Изучение независимых эффектов фолликулостимулирующего гормона in vivo на мышиной модели
Summary
Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) в различных экстрагонадных тканях и органах связан с патогенезом множественных заболеваний. Овариэктомированная и обработанная ФСГ мышиная модель (OVF) может быть использована для изучения экстрагонадного действия ФСГ.
Abstract
Во время перехода из репродуктивной фазы в нерепродуктивную (менопаузу) у многих женщин наблюдаются значительные физиологические и патологические изменения, включая снижение костной массы, повышение уровня липидов в крови, увеличение висцерального ожирения. Уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) повышается во время менопаузального перехода. Многие исследования показали, что ФСГ в различных экстрагонадных тканях и органах связан с патогенезом множественных заболеваний. Таким образом, создание животной модели, которая может помочь в изучении независимых эффектов ФСГ in vivo , особенно важно. В данном исследовании самкам мышей C57BL/6 была овариоэктомизирована и добавлена эстрадиола валерат (OVX + E2) для устранения эффекта гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси. Мыши OVX + E2 получали растворитель (N.S.) или различные дозы рекомбинантного ФСГ через внутрибрюшинную инъекцию для создания мышиной модели (OVF), характеризующейся относительно стабильным эстрогеном и повышением уровня ФСГ. Таким образом, мы успешно создали экспериментальную мышиную модель, имитирующую раннюю стадию менопаузального перехода, характеризующуюся повышенным уровнем ФСГ в сыворотке крови. Модель оптического видоискателя обладает такими преимуществами, как стабильность, низкая стоимость и простота в эксплуатации, что подходит для исследований экстрагонадного действия ФСГ. Здесь мы опишем подробные протоколы для модели оптического видоискателя мыши.
Introduction
Уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) повышается во время менопаузального перехода (термин менопаузальный переход был определен в 2011 году на этапах семинара по репродуктивному старению (система STRAW) + 10)1. Именно во время менопаузального перехода, периода, характеризующегося повышением уровня ФСГ и относительно стабильным эстрогеном1, женщины испытывают изменения менструального цикла и значительные физиологические изменения, затрагивающие различные клетки и ткани. Эти изменения могут серьезно повлиять на качество жизни и здоровье женщин. Изучение эффектов ФСГ может улучшить качество жизни и здоровье женщин.
ФСГ секретируется из гонадотропных клеток передней доли гипофиза и имеет решающее значение для контроля функции и репродукции гонад2. Функция ФСГ опосредована рецептором ФСГ (FSHR), который относится к рецептору, связанному с G-белком (GPCR)3. FSHR обычно экспрессируется в гонадах, а именно в яичнике и яичке. Доказано, что FSHR универсально экспрессируется во многих экстрагонадных клетках и тканях, включая печень4, гиппокамп5, остеокласты6, адипоциты7 и эндотелиальные клетки8. Новые исследования выявили экстрагонадное действие ФСГ и его потенциальную клиническую значимость при дислипидемии4, болезни Альцгеймера5, остеопорозе 9,10, атеросклерозе11, ожирении9 и раке12. Таким образом, создание животной модели, которая может помочь в изучении независимых эффектов ФСГ in vivo, особенно важно при изучении действия только ФСГ.
В протоколе мы ввели процедуру создания мышиной модели с относительно стабильным эстрогеном и повышенным уровнем ФСГ13. Мышиная модель имитирует переход к менопаузе с помощью овариэктомии, а затем добавляется эстрадиола валерат и рекомбинантный ФСГ. Поскольку овариэктомированные мыши были дополнены экзогенным эстрогеном для поддержания уровня эстрогена, аналогичного искусству мышей, уровни эндогенного ФСГ были стабильными из-за обратной связи эстрогена в гипофизе. В этом состоянии он может контролировать уровень ФСГ, вводя экзогенный ФСГ без изменения уровня эстрогена. Таким образом, модель мыши с оптическим видоискателем позволяет исключить влияние эстрогенов и наблюдать экстрагонадные физиологические и патологические эффекты ФСГ. Мы считаем, что детальная и визуализированная процедура полезна для исследователей, чтобы создать модель OVF мыши в своей лаборатории и применить ее для изучения физиологических и патологических изменений во время менопаузы по мере необходимости.
Protocol
Representative Results
Discussion
Во время перехода из репродуктивной фазы в нерепродуктивную (менопаузу) у многих женщин наблюдаются значительные физиологические и патологические изменения. Уровень ФСГ повышается во время менопаузального перехода1. Новые исследования показали, что ФСГ в различных экстрагонадных тканях и органах имеет решающее значение в патогенезе многих заболеваний, включая дислипидемию4, болезнь Альцгеймера5, остеопороз 9,10, атеросклероз11, ожирение9 и рак12. Таким образом, создание животной модели, которая может помочь в изучении независимых эффектов ФСГ in vivo, особенно важно. Мышиная модель оптического видоискателя имитирует раннюю стадию перехода к менопаузе с относительно стабильным эстрогеном и повышением уровня ФСГ и особенно подходит для исследований экстрагонадного действия ФСГ.
В этом методе овариоэктомия выполнялась с использованием одного дорсального разреза спины, примерно на 1 см от основания бедра вверх (рис. 1B). Кожа разрезалась почти вместе с тыльными мышцами с помощью острых рассекающих ножниц, и таким образом осуществлялся доступ к брюшной полости. После операции разрез мышцы не требовал наложения швов, а кожная рана закрывалась двусторонне одним кетгутовым швом (рис. 2). Операция технически проще, менее трудоемка и менее вредна для самок мышей по сравнению с другими используемыми методами.
Некоторые детали, на которые следует обратить внимание во время операции. Во-первых, все хирургические процедуры должны содержаться в чистоте и быть как можно более стерильными, чтобы снизить риск послеоперационной инфекции. Во-вторых, из-за того, что ткань яичника очень хрупкая, хирургические инструменты не могут контактировать с яичниками непосредственно во время овариоэктомии, чтобы избежать внутрибрюшинной имплантации. В-третьих, после операции мышей поместили в одеяло с постоянной температурой 37 °C во время восстановления, чтобы предотвратить послеоперационную гипотермию, приводящую к смерти.
Предыдущее исследование доказало, что эндогенный эстроген синтезируется в тека-клетках яичников женщин в пременопаузе или жировых стромальных клетках молочной железы женщин в постменопаузе и в незначительных количествах в периферических тканях14. Уровень эстрогена в сыворотке крови резко снизился у мышей, подвергшихся овариоэктомии, но не может быть устранен (рис. 3B). Однако эндогенный эстроген, синтезируемый в экстрагонадной ткани, не влияет на стабильность уровней эстрогенов в модели OVF (рис. 4B).
Модель оптического видоискателя имеет некоторые ограничения. Если хирургическая операция не является осторожной и приводит к внутрибрюшинной имплантации яичников, это может привести к несостоятельности модели. При этом уровень эстрогена в сыворотке крови не падает резко и колеблется на разных этапах эстрального цикла. После экзогенного введения эстрогена и ФСГ организму требуется примерно 1 неделя, чтобы достичь равновесия. Таким образом, патологические изменения модели оптического видоискателя, происходящие в течение 1 недели, не могут свидетельствовать об эффектах ФСГ.
В заключение следует отметить, что модель оптического видоискателя обладает такими преимуществами, как стабильность, низкая стоимость и простота в эксплуатации. Системные эффекты высокого уровня ФСГ могут наблюдаться после внутрибрюшинного введения ФСГ; то есть модель оптического видоискателя подходит для исследований, изучающих экстрагонадное действие ФСГ. Тем не менее, требования к модельной хирургии и процедурам внутрибрюшинных инъекций достаточно высоки. Если финансирование достаточно, то лучшим выбором будут конкретные нокаут-модели.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотим поблагодарить лабораторию на животных больницы провинции Шаньдун за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC 82101645), Фондом естественных наук провинции Шаньдун, Китай (ZR2020QH088) и Планом научно-технической поддержки молодежных инноваций колледжей провинции Шаньдун (2021KJ051).
Materials
| beta-estradiol 17-valerate | Macklin | E829824 | |
| Estradiol sensitive ELISA | Demeditec | DE4399 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Beyotime | C0107 | |
| Meloxicam | Aladdin | M129228 | |
| recombinant human Follicle-stimulating hormone | Merck Serono | N19Z8803G | |
| Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Aliphatic name: 2,2,2-Tribromoethanol |
References
- Harlow, S. D., et al. Executive summary of the Stages of Reproductive Aging Workshop + 10: addressing the unfinished agenda of staging reproductive aging. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (4), 1159-1168 (2012).
- Ulloa-Aguirre, A., Zariñán, T. The Follitropin Receptor: Matching Structure and Function. Molecular Pharmacology. 90 (5), 596-608 (2016).
- Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Human Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
- Guo, Y., et al. Blocking FSH inhibits hepatic cholesterol biosynthesis and reduces serum cholesterol. Cell Research. 29 (2), 151-166 (2019).
- Xiong, J., et al. FSH blockade improves cognition in mice with Alzheimer’s disease. Nature. 603 (7901), 470-476 (2022).
- Sun, L., et al. FSH Directly Regulates Bone Mass. Cell. 125 (2), 247-260 (2006).
- Liu, X. M., et al. FSH regulates fat accumulation and redistribution in aging through the Gαi/Ca(2+)/CREB pathway. Aging Cell. 14 (3), 409-420 (2015).
- Maclellan, R. A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Vascular Anomalies. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3), 344e-351en (2014).
- Liu, P., et al. Blocking FSH induces thermogenic adipose tissue and reduces body fat. Nature. 546 (7656), 107-112 (2017).
- Ji, Y., et al. Epitope-specific monoclonal antibodies to FSHβ increase bone mass. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2192-2197 (2018).
- El Khoudary, S. R., et al. Trajectories of estradiol and follicle-stimulating hormone over the menopause transition and early markers of atherosclerosis after menopause. European Journal of Preventive Cardiology. 23 (7), 694-703 (2016).
- Radu, A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Tumor Blood Vessels. The New England Journal of Medicine. 363 (17), 1621-1630 (2010).
- Sowers, M. R., et al. Endogenous hormones and bone turnover markers in pre- and perimenopausal women: SWAN. Osteoporosis International. 14 (3), 191-197 (2003).
- Kristensen, V. N., Kure, E. H., Erikstein, B., Harada, N., Børresen-Dale, A. L. Genetic susceptibility and environmental estrogen-like compounds. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 482 (1), 77-82 (2001).
