Explorando os efeitos independentes do hormônio folículo-estimulante in vivo em um modelo de camundongo
Summary
O hormônio folículo-estimulante (FSH) em vários tecidos e órgãos extragonadais está associado à patogênese de múltiplas doenças. O modelo de camundongos ovariectomizados e tratados com FSH (OVF) pode ser usado para explorar as ações extragonadais do FSH.
Abstract
Durante a transição de uma fase reprodutiva para uma não reprodutiva (menopausa), muitas mulheres experimentam alterações fisiológicas e patológicas significativas, incluindo diminuição da massa óssea, aumento dos lipídios sanguíneos e aumento da adiposidade visceral. Os níveis de hormônio folículo-estimulante (FSH) aumentam durante a transição menopausal. Muitos estudos têm demonstrado que o FSH em vários tecidos e órgãos extragonadais está associado à patogênese de múltiplas doenças. Assim, a construção de um modelo animal que possa ajudar a estudar os efeitos independentes do FSH in vivo é particularmente importante. Neste estudo, camundongos C57BL/6 fêmeas foram ovariectomizadas e suplementadas com valerato de estradiol (OVX + E2) para eliminar o efeito do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal. Os camundongos OVX + E2 receberam solvente (N.S.) ou diferentes doses de FSH recombinante via injeção intraperitoneal para criar um modelo de camundongo (OVF) caracterizado por estrogênio relativamente estável e níveis crescentes de FSH. Assim, geramos com sucesso um modelo experimental em camundongos para mimetizar o estágio inicial da transição menopausal, caracterizado por níveis séricos elevados de FSH. O modelo OVF tem as vantagens de ser estável, de baixo custo e fácil operação, o que é adequado para estudos que explorem as ações extragonadais do FSH. Aqui, descrevemos protocolos detalhados para o modelo de OVF de camundongo.
Introduction
Os níveis de hormônio folículo-estimulante (FSH) aumentam durante a transição menopausal (o termo transição menopausal foi definido em 2011 nas fases do sistema STRAW) + 10 do envelhecimento reprodutivo)1. É durante a transição menopáusica, período caracterizado pelo aumento dos níveis de FSH e estrogênio relativamente estável1, que as mulheres experimentam mudanças no ciclo menstrual e alterações fisiológicas significativas envolvendo várias células e tecidos. Essas mudanças podem afetar seriamente a qualidade de vida e a saúde das mulheres. Explorar os efeitos do FSH pode melhorar a qualidade de vida e a saúde das mulheres.
O FSH é secretado pelas células gonadotróficas da hipófise anterior e é fundamental no controle da função e reprodução gonadal2. A função do FSH é mediada pelo receptor de FSH (FSHR), que pertence ao receptor acoplado à proteína G (GPCR)3. A FSHR é geralmente expressa nas gônadas, ou seja, no ovário e testículo. Foi comprovado que a FSHR é universalmente expressa em múltiplas células e tecidos extragonadais, incluindo fígado4, hipocampo5, osteoclastos6, adipócitos7 e células endoteliais8. Estudos emergentes têm revelado ações extragonadais do FSH e sua potencial relevância clínica na dislipidemia4, doença de Alzheimer5, osteoporose 9,10, aterosclerose11, obesidade9 e câncer12. Assim, a construção de um modelo animal que possa ajudar a estudar os efeitos independentes do FSH in vivo é particularmente importante para explorar as ações do FSH isoladamente.
No protocolo, introduzimos o procedimento para estabelecer um modelo de camundongo com estrógeno relativamente estável e níveis elevados de FSH13. O modelo de camundongo mimetiza a transição menopausal por cirurgia ovariectomizada e, em seguida, suplementado com valerato de estradiol e FSH recombinante. Como os camundongos ovariectomizados foram suplementados com estrogênio exógeno para manter níveis semelhantes de estrogênio com os camundongos sham-operados, os níveis de FSH endógeno foram estáveis devido ao feedback estrogênico na glândula pituitária. Nessa condição, poderia controlar os níveis de FSH administrando FSH exógeno sem alterar os níveis de estrogênio. Assim, o modelo de OVF em camundongos pode excluir a influência do estrógeno e observar os efeitos fisiológicos e patológicos extragonadais do FSH. Acreditamos que o procedimento detalhado e visualizado é útil para os pesquisadores estabelecerem o modelo de camundongo OVF em seu laboratório e aplicá-lo para investigar alterações fisiológicas e patológicas durante a transição menopausal, conforme necessário.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante a transição de uma fase reprodutiva para uma não reprodutiva (menopausa), muitas mulheres experimentam alterações fisiológicas e patológicas significativas. Os níveis de FSH aumentam durante a transição menopausal1. Estudos emergentes têm revelado que o FSH em vários tecidos e órgãos extragonadais é crítico na patogênese de múltiplas doenças, incluindo dislipidemia4, doença de Alzheimer5, osteoporose 9,10, aterosclerose11, obesidade9 e câncer12. Assim, a construção de um modelo animal que possa ajudar a estudar os efeitos independentes do FSH in vivo é particularmente importante. O modelo de camundongo OVF imita o estágio inicial da transição menopausal com estrogênio relativamente estável e níveis crescentes de FSH e é particularmente adequado para estudos que explorem as ações extragonadais do FSH.
Nesse método, a ooforectomia foi realizada com incisão dorsal única, a aproximadamente 1 cm da base da coxa para cima (Figura 1B). A pele foi cortada quase em conjunto com a musculatura dorsal com tesoura dissecante afiada, sendo assim acessada a cavidade peritoneal. No pós-operatório, a incisão muscular não necessitou de sutura, e a ferida cutânea foi fechada bilateralmente com um fio de categute (Figura 2). A operação é tecnicamente mais fácil, menos demorada e menos prejudicial para camundongos fêmeas em comparação com outros métodos usados.
Alguns detalhes que devem ser observados durante o procedimento cirúrgico. Primeiro, todos os procedimentos cirúrgicos devem ser mantidos limpos e o mais estéril possível para reduzir o risco de infecção pós-operatória. Segundo, como o tecido ovariano é muito frágil, os instrumentos cirúrgicos não podem entrar em contato direto com os ovários durante a ooforectomia, para evitar a implantação intraperitoneal. Terceiro, após a cirurgia, os camundongos foram movidos para uma manta de temperatura constante de 37 °C durante a recuperação para evitar hipotermia pós-operatória levando à morte.
Estudo prévio comprovou que o estrógeno endógeno é sintetizado nas células da teca ovariana de mulheres na pré-menopausa ou células do estroma adiposo da mama de mulheres na pós-menopausa e em menor quantidade no tecido periférico14. O estrógeno sérico caiu acentuadamente em camundongos ovariectomizados, mas não pode ser eliminado (Figura 3B). Entretanto, o estrógeno endógeno sintetizado no tecido extragonadal não afeta a estabilidade dos níveis de estrogênio no modelo de OVF (Figura 4B).
Existem algumas limitações no modelo OVF. Uma vez que a operação cirúrgica não é cuidadosa e leva ao implante intraperitoneal ovariano, pode levar à falha do modelo. Neste caso, o estrogênio sérico não cai acentuadamente e flutua durante diferentes estágios do ciclo estral. Após a administração exógena de estrogênio e FSH, leva aproximadamente 1 semana para o corpo atingir o equilíbrio. Assim, alterações patológicas do modelo de OVF que ocorrem dentro de 1 semana não podem indicar os efeitos do FSH.
Em conclusão, o modelo OVF tem as vantagens de ser estável, de baixo custo e fácil operação. Os efeitos sistêmicos do FSH de alto nível podem ser observados após a injeção intraperitoneal de FSH; ou seja, o modelo OVF é adequado para estudos que explorem as ações extragonadais do FSH. No entanto, as exigências para cirurgia modelo e procedimentos de injeção intraperitoneal são bastante altas. Se o financiamento for suficiente, modelos de nocaute específicos são a melhor escolha.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer ao laboratório de animais do Hospital Provincial de Shandong pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC 82101645), pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Shandong, China (ZR2020QH088), e pelo Plano de Apoio à Ciência e Tecnologia para a Inovação Juvenil das Faculdades da Província de Shandong (2021KJ051).
Materials
| beta-estradiol 17-valerate | Macklin | E829824 | |
| Estradiol sensitive ELISA | Demeditec | DE4399 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Beyotime | C0107 | |
| Meloxicam | Aladdin | M129228 | |
| recombinant human Follicle-stimulating hormone | Merck Serono | N19Z8803G | |
| Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Aliphatic name: 2,2,2-Tribromoethanol |
References
- Harlow, S. D., et al. Executive summary of the Stages of Reproductive Aging Workshop + 10: addressing the unfinished agenda of staging reproductive aging. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (4), 1159-1168 (2012).
- Ulloa-Aguirre, A., Zariñán, T. The Follitropin Receptor: Matching Structure and Function. Molecular Pharmacology. 90 (5), 596-608 (2016).
- Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Human Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
- Guo, Y., et al. Blocking FSH inhibits hepatic cholesterol biosynthesis and reduces serum cholesterol. Cell Research. 29 (2), 151-166 (2019).
- Xiong, J., et al. FSH blockade improves cognition in mice with Alzheimer’s disease. Nature. 603 (7901), 470-476 (2022).
- Sun, L., et al. FSH Directly Regulates Bone Mass. Cell. 125 (2), 247-260 (2006).
- Liu, X. M., et al. FSH regulates fat accumulation and redistribution in aging through the Gαi/Ca(2+)/CREB pathway. Aging Cell. 14 (3), 409-420 (2015).
- Maclellan, R. A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Vascular Anomalies. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3), 344e-351en (2014).
- Liu, P., et al. Blocking FSH induces thermogenic adipose tissue and reduces body fat. Nature. 546 (7656), 107-112 (2017).
- Ji, Y., et al. Epitope-specific monoclonal antibodies to FSHβ increase bone mass. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2192-2197 (2018).
- El Khoudary, S. R., et al. Trajectories of estradiol and follicle-stimulating hormone over the menopause transition and early markers of atherosclerosis after menopause. European Journal of Preventive Cardiology. 23 (7), 694-703 (2016).
- Radu, A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Tumor Blood Vessels. The New England Journal of Medicine. 363 (17), 1621-1630 (2010).
- Sowers, M. R., et al. Endogenous hormones and bone turnover markers in pre- and perimenopausal women: SWAN. Osteoporosis International. 14 (3), 191-197 (2003).
- Kristensen, V. N., Kure, E. H., Erikstein, B., Harada, N., Børresen-Dale, A. L. Genetic susceptibility and environmental estrogen-like compounds. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 482 (1), 77-82 (2001).
