マウスモデルにおける卵胞刺激ホルモンの in vivo での独立効果の探索

以下のプロトコルは、研究動物の使用に関するすべての施設倫理ガイドラインに準拠しており、中国の山東省病院の動物倫理委員会によって承認されました。すべての外科的操作は深い麻酔下で行われ、動物は処置中のどの段階でも痛みを経験しませんでした。 1. 手術前の準備 器具の滅菌手術前に手術器具をオートクレーブ(121°Cで15分間)で蒸気滅菌します。十分な使い捨て縫合糸と針を準備します。 手術プラットフォームのセットアップ外科手術専用の部屋で手術を行います。操作には、少なくとも60 cm x 60 cmのベンチ領域を割り当てます。その部分の表面を75%アルコールで洗浄し、使い捨ての医療用タオルで覆い、30分前に紫外線で消毒します(図1A)。 動物の準備すべての動物を温度管理された部屋(20〜25°C)に、12時間の明るいサイクル、12時間の暗いサイクルで収容します。8週齢の雌のC57BL/6マウスを手術前の1週間、飼育施設に順応させる。 手術前にマウスの体重を量ります。すべての9週齢の雌マウスにトリブロモエタノール(280 mg / kg)の腹腔内注射による全身麻酔を投与し、処置中のどの段階でも痛みのない状態を達成します。痛みを和らげるために、手術の約1時間前にメロキシカム(2 mg / kg)を皮下に注射します。. 手術中の角膜の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗ります。 清潔な綿棒を使用して、背中に脱毛ローションを塗ります。ローションをマウスに3〜5分間置いてから、ガーゼと綿棒を使用して髪を取り除きます。マウスの背面からすべての髪の毛が取り除かれるまで、この手順を繰り返します。 ガーゼと綿棒を使用して、75%アルコールで肌をきれいにします。ゴムストリップまたは綿ロープを使用してマウスを手術台に固定し(図1B)、ヨードフォア溶液を塗布して背面を清掃します。注:卵巣摘出術の前に、つま先をつまんで麻酔の深さを確認してください。 2.卵巣摘出術 注:トリブロモエタノールは約30分間維持できるため、手術を可能な限り完了させることができます。 使い捨てメスを使用して、大腿部から上に向かって~1.0cmの背側切開を行い、皮膚と皮下筋膜のみを切開し、この時点で後腹膜に切り込まないようにします。 切開部を左に引くと、白い脂肪パッドが見えます。白色脂肪パッドに沿って~0.5cmカットし、マイクロ鉗子とハサミを使用して腹腔内を露出させます。 後腹膜を切開した後、マイクロ鉗子で腹腔内から白色脂肪パッドをゆっくりと優しく取り除きます。浸したガーゼの外側に0.9%滅菌生理食塩水で白色脂肪組織を直ちに湿らせます。腹腔の外側では、露出した組織を常に湿らせてください。 ピンク色の粒状物質、すなわち卵巣が白い脂肪パッドの下部に付着しています(図2A)。卵巣は細い管、すなわち子宮に接続されています。5-0の吸収性縫合糸を使用して、子宮の卵巣端を結紮し、左卵巣を切除します(図2B)。 卵巣を摘出するときは、周囲の脂肪組織をできるだけ保存してください。手術器具と卵巣との直接接触を避け、卵巣組織の腹腔内移植を防ぎます。 白い脂肪パッドを腹腔内に慎重に戻します。後腹膜に5-0の吸収性縫合糸で簡単な断続的縫合を行います(図2C)。縫合が完了したら、0.9%滅菌生理食塩水に浸したガーゼで出血を取り除きます。 皮膚切開部を右に引っ張り、同じ方法で右卵巣を切除します。 4-0の非吸収性縫合糸で断続的に縫合を行い、0.9%滅菌生理食塩水に浸したガーゼで出血を取り除きます(図2D)。 両方の縫合を完了した後、ヨードフォア溶液で創傷を洗浄します。広域抗生物質を腹腔内に注射します。 3. 術後の観察 手術後、マウスを37°Cの恒温ブランケットに移します。マウスが自由に動けるようになるまで、動物を個別のケージに入れてください。胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。 手術後24時間でメロキシカム(2mg / kg)を皮下注射して痛みを和らげます。. マウスを毎日監視して、手術創が合併症(裂開)の兆候を示さずに適切に治癒していることを確認します。 4.エストラジオールの補給 吉草酸エストラジオールを添加した飼料を準備します。飼料1kgあたり2.6mgのβ-エストラジオール17-吉草酸を添加して使用します。 手術完了後3日目に、マウスに吉草酸エストラジオールを与えます。 5. FSHインジェクション 組換えヒトFSH溶液を調製する。注射用の組換えヒトFSH粉末を0.9%滅菌生理食塩水で100 IU/mLまで溶解します。 実験計画に従ってマウスをグループ化し、腹腔内注射で溶媒または異なる用量の組換えFSHを2週間投与します。組換えFSHの生物活性に応じて、閉経期移行期の女性の血清FSHレベルに相当するFSHの注射用量をマウスに使用します。注:異なる治療に基づいて、卵巣摘出エストロゲン補充マウスを3つのグループにランダムに分けました、溶媒(NS)群は100μL /日の溶媒を投与され、低用量FSH(L-FSH)群は1日あたり15IU / kg体重を投与され、高用量FSH(H-FSH)グループは1日あたり30IU / kg体重を投与されました。