Onderzoek naar onafhankelijke effecten van follikelstimulerend hormoon in vivo in een muismodel

Het volgende protocol voldeed aan alle institutionele ethische richtlijnen met betrekking tot het gebruik van proefdieren en werd goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Shandong Provincial Hospital, China. Alle chirurgische manipulaties werden uitgevoerd onder diepe anesthesie en de dieren ervoeren in geen enkel stadium van de procedure pijn. 1. Voorbereiding voor de operatie Sterilisatie van instrumentenSteriliseer chirurgische instrumenten met stoom in een autoclaaf (121°C gedurende 15 min) voorafgaand aan de operatie. Zorg voor voldoende wegwerphechtingen en naalden. Installatie van het operatieplatformVoer de operatie uit in een kamer die gewijd is aan chirurgische ingrepen. Wijs een werkbank van minimaal 60 cm x 60 cm toe voor de operatie. Reinig het oppervlak van het gebied met 75% alcohol en dek af met een medische wegwerphanddoek en desinfecteer het vervolgens 30 minuten van tevoren met ultraviolette straling (Figuur 1A). Voorbereiding van dierenHuisvest alle dieren in een ruimte met temperatuurregeling (20-25 °C) met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Acclimatiseer 8 weken oude vrouwelijke C57BL/6-muizen gedurende 1 week in de huisvestingsfaciliteit gedurende 1 week voor de operatie. Weeg muizen voor de operatie. Dien alle vrouwelijke muizen van 9 weken oud met algemene anesthesie toe door intraperitoneale injectie van tribroomethanol (280 mg/kg), om pijnloosheid te bereiken in elk stadium van de procedure. Injecteer meloxicam (2 mg/kg) subcutaan, ongeveer 1 uur voor een operatie om de pijn te verlichten. Breng oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies tijdens de operatie te voorkomen. Breng ontharingslotion aan op de rug met een schoon wattenstaafje. Laat de lotion 3-5 minuten op een muis zitten en verwijder vervolgens het haar met gaas en wattenstaafjes. Herhaal deze stap totdat alle haren van de achterkant van de muis zijn verwijderd. Gebruik gaas en wattenstaafjes om de huid te reinigen met 75% alcohol. Bevestig de muis weer op het operatieplatform met behulp van een rubberen strip of katoenen touw (Figuur 1B) en breng jodoforoplossing aan om de rug schoon te maken.NOTITIE: Bevestig de diepte van de anesthesie door een teenknijp vóór de ovariëctomie. 2. Ovariëctomie OPMERKING: Tribroomethanol kan ongeveer 30 minuten worden gehandhaafd, zodat de operatie zoveel mogelijk wordt voltooid. Maak een dorsale incisie van ~1,0 cm in de lengterichting vanaf de basis van de dij naar boven met behulp van een wegwerpscalpel, zorg ervoor dat alleen de huid en de onderhuidse fascia worden ingesneden en vermijd op dit moment in het achterste peritoneum te snijden. Trek de incisie naar links en er is een wit vetkussentje te zien. Knip ~0,5 cm langs het witte vetkussentje om de intraperitoneale holte bloot te leggen met behulp van een micropincet en een schaar. Na het doorsnijden van het achterste buikvlies, verwijdert u langzaam en voorzichtig het witte vetkussentje uit de intraperitoneale holte met een micropincet. Bevochtig het witte vetweefsel onmiddellijk met 0,9% steriele zoutoplossing buiten het geweekte gaas. Houd blootliggend weefsel altijd vochtig buiten de buikholte. Een roze korrelige substantie, namelijk de eierstok, is bevestigd aan het onderste deel van het witte vetkussen (figuur 2A). De eierstokken zijn verbonden met een slank kanaal, namelijk de baarmoeder. Gebruik 5-0 resorbeerbare hechtingen om het ovariumuiteinde van de baarmoeder te ligate en verwijder de linker eierstok (Figuur 2B). Behoud bij het verwijderen van een eierstok zoveel mogelijk het omliggende vetweefsel. Vermijd direct contact tussen chirurgische instrumenten en de eierstokken en voorkom intraperitoneale implantatie van eierstokweefsel. Plaats het witte vetkussen voorzichtig terug in de intraperitoneale holte. Voer een eenvoudige intermitterende hechting uit op het achterste peritoneum met een 5-0 resorbeerbare hechting (Figuur 2C). Nadat de hechting is voltooid, reinigt u eventuele bloedingen met 0,9% steriel in zoutoplossing gedrenkt gaas. Trek de huidincisie naar rechts en verwijder de rechter eierstok met dezelfde methode. Voer een intermitterende hechting uit met 4-0 niet-resorbeerbare hechtingen en reinig eventuele bloedingen met 0.9% steriel in zoutoplossing gedrenkt gaas (Figuur 2D). Reinig de wond met een jodoforoplossing na het voltooien van beide hechtingen. Intraperitoneaal breedspectrumantibiotica injecteren. 3. Observatie na de operatie Verplaats de muizen na de operatie naar een deken met een constante temperatuur van 37 °C. Totdat de muizen zich vrij kunnen bewegen, houdt u de dieren in hun individuele kooi. Laat het dier niet onbeheerd achter totdat het weer voldoende bij bewustzijn is gekomen om sternale ligging te behouden. Injecteer meloxicam (2 mg/kg) subcutaan 24 uur na de operatie om de pijn te verlichten. Controleer de muizen dagelijks om er zeker van te zijn dat de operatiewond goed geneest zonder tekenen van complicaties (dehiscentie). 4. Suppletie met oestradiol Bereid voer aangevuld met oestradiolvaleraat. Gebruik 2,6 mg bèta-oestradiol 17-valeraat aangevuld per 1 kg voer. Voer de muizen 3 dagen na voltooiing van de operatie met oestradiolvaleraat. 5. FSH-injectie Bereid een recombinante humane FSH-oplossing voor. Los recombinant humaan FSH-poeder voor injectie op met 0,9% steriele zoutoplossing tot 100 IE/ml. Groepeer muizen volgens experimentele plannen en geef gedurende 2 weken oplosmiddel of verschillende doses recombinant FSH via intraperitoneale injectie. Gebruik volgens de biologische activiteit van recombinant FSH de injectiedosis FSH bij muizen die gelijk is aan het serum-FSH-gehalte bij vrouwen tijdens de overgangsperiode van de menopauze.OPMERKING: Op basis van verschillende behandelingen werden ovariëctomische oestrogeen-gesupplementeerde muizen willekeurig verdeeld in drie groepen, de solventgroep (NS) die 100 μL/dag oplosmiddel kreeg, de groep met een lage dosis FSH (L-FSH) die 15 IE/kg lichaamsgewicht per dag kreeg en de groep met een hoge dosis FSH (H-FSH) die 30 IE/kg lichaamsgewicht per dag kreeg.