Summary

Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanarak Bir Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutantında Mitokondriyal Fonksiyonun Analizi

Published: November 10, 2023
doi:

Summary

Burada, PINK1B9-null mutant meyve sineklerinde biyoenerjetik analiz etmek için yüksek çözünürlüklü bir respirometri protokolü sunuyoruz. Yöntem, Substrat-Bağlayıcı-İnhibitör-Titrasyon (SUIT) protokolünü kullanır.

Abstract

Parkinson Hastalığı (PH) dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıklar ve kanser gibi hücresel bozukluklar, mitokondriyal fonksiyonların bozulmasıyla enerji metabolizmasını bozan bozukluklardan bazılarıdır. Mitokondri, hem enerji metabolizmasını hem de hücre sağkalımı ve ölümünde yer alan hücresel süreçleri kontrol eden organellerdir. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirme yaklaşımları, patolojik ve fizyolojik süreçlerdeki hücresel durumlar hakkında önemli bilgiler sunabilir. Bu bağlamda, yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR) protokolleri, tüm mitokondriyal solunum zinciri fonksiyonunun veya spesifik mitokondriyal komplekslerin aktivitesinin değerlendirilmesine izin verir. Ayrıca, mitokondriyal fizyoloji ve biyoenerjetik çalışmak, Drosophila melanogaster gibi genetik ve deneysel olarak izlenebilir modeller gerektirir.

Bu model, insan fizyolojisine benzerliği, hızlı yaşam döngüsü, kolay bakımı, maliyet etkinliği, yüksek verim yetenekleri ve en aza indirilmiş sayıda etik kaygı gibi çeşitli avantajlar sunar. Bu özellikler toplu olarak onu karmaşık hücresel süreçleri incelemek için paha biçilmez bir araç olarak kurar. Bu çalışma, Drosophila melanogaster PINK1B9-null mutantı kullanılarak mitokondriyal fonksiyonun nasıl analiz edileceğini açıklamaktadır. Pink1 geni, işlevsiz mitokondrinin mitokondriyal ağdan çıkarılması için çok önemli olan mitofaji olarak tanınan bir süreç yoluyla PTEN’in neden olduğu varsayılan kinaz 1’i kodlamaktan sorumludur. Bu gendeki mutasyonlar, otozomal resesif erken başlangıçlı ailesel PH formu ile ilişkilendirilmiştir. Bu model, PH’nin patofizyolojisinde yer alan mitokondriyal disfonksiyonu incelemek için kullanılabilir.

Introduction

Mitokondri, apoptotik regülasyon, kalsiyum homeostazı ve biyosentetik yollara katılım dahil olmak üzere önemli işlevleri kontrol eden hücresel organellerdir. Özerk genetik materyale sahip olarak, hücresel bakım ve onarım süreçlerine katkıda bulunabilirler. Yapıları, her ikisi de hücresel enerji 1,2,3 için çok önemli olan elektron taşıma zincirini ve oksidatif fosforilasyonu barındırır. Özellikle, oksidatif fosforilasyon (OXPHOS)2 yoluyla adenozin trifosfat (ATP) üretimi yoluyla enerji kontrolü sağlanır. Mitokondriyal fonksiyonların bozulması ile enerji metabolizmasının bozulması hem hücre sağkalımında hem de ölümde meydana gelir 4,5, sıklıkla kanser gibi çok çeşitli insan patolojileri ve Parkinson Hastalığı (PD) gibi nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilidir3,6.

PH kronik, ilerleyici ve nörolojik bir hastalıktır. Bu hastalığın birincil nedeni, özellikle 6,7,8 hareketini kontrol eden nörotransmitter dopaminin üretiminden sorumlu olan substantia nigra’da beyin hücrelerinin ölümüdür. Parkinsonizmi mitokondriyal disfonksiyona bağlayan en eski gözlem, 1988’de solunum zinciri Kompleksi I9’u inhibe eden toksinler kullanılarak deneysel modellerde yapıldı.

Şu anda, mitokondriyal disfonksiyonu değerlendirmek için birkaç yöntem vardır 10,11,12,1 3; bununla birlikte, geleneksel yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR) üstün duyarlılık ve avantajlar sunar 13,14. Örneğin, HRR protokolleri, tüm mitokondriyal solunum zinciri fonksiyonunun veya spesifik mitokondriyal komplekslerinaktivitesinin değerlendirilmesine izin verir 14,15. Mitokondriyal disfonksiyonlar sağlam hücrelerde, izole mitokondrilerde ve hatta ex vivo olarak değerlendirilebilir 10,11,13,14.

Mitokondriyal disfonksiyonlar birçok patolojik ve fizyolojik süreçle yakından ilişkilidir. Bu nedenle, genetik ve deneysel olarak izlenebilir model sistemleri kullanarak mitokondriyal fizyoloji ve biyoenerjetik çalışmak önemlidir. Bu bağlamda, meyve sineği olan Drosophila melanogaster üzerine yapılan araştırmaların çeşitli avantajları vardır. Bu model, DNA’nın genetik materyal olarak kullanımı, ortak organeller ve gelişim, bağışıklık ve hücre sinyalizasyonunda yer alan korunmuş moleküler yollar dahil olmak üzere insanlarla temel hücresel özellikleri ve süreçleri paylaşır. Ek olarak, meyve sinekleri hızlı bir yaşam döngüsüne, kolay bakıma, düşük maliyete, yüksek verime ve daha az etik kaygıya sahiptir, bu nedenle karmaşık hücresel süreçleri incelemek için paha biçilmez bir araç oluşturur 16,17,18,19,20.

Ayrıca, PTEN’in neden olduğu varsayılan kinaz 1 (pembe1) geninin bir homologu D. melanogaster’de eksprese edilir. Mitofaji süreci boyunca hasarlı mitokondrinin uzaklaştırılmasında çok önemli bir rol oynar8. İnsanlarda, bu gendeki mutasyonlar, bireyleri mitokondriyal disfonksiyon ile ilişkili otozomal resesif ailesel bir PD formuna yatkın hale getirir 8,21,22,23. Sonuç olarak, meyve sineği, PH’nin patofizyolojisi ve mitokondriyal disfonksiyon ve biyoenerjetiklere odaklanan ilaç adaylarının taranması üzerine çalışmalar için güçlü bir hayvan modelidir. Bu nedenle, bu çalışma, Substrat-Birleştirici-İnhibitör-Titrasyon (SUIT) protokolü ile OROBOROS’ta HRR tekniği kullanılarak D. melanogaster’den bir PD modelinde mitokondriyal fonksiyonun nasıl analiz edileceğini açıklamaktadır.

Protocol

Bloomington Drosophila stok merkezinden w1118 (beyaz) ve w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (Pink1B9 olarak anılır) suşlarını kullandık (FlyBase ID: FBgn0029891) (Kimlik numarası: 34749). Bu çalışmada, erkek D. melanogaster PINK1B9-null mutantları, kontrol grubu (genetik arka plan) olarak kullanılan w1118 suşundan erkek D. melanogaster ile karşılaştırılmıştır. Sineklerin doğru genotipe (Pink1B9…

Representative Results

Burada, OXPHOS CI (P = 0.0341) ve OXPHOS CI&II (P = 0.0392) durumlarındakiO2 akısının, kontrol sineklerine göre PINK1B9 boş sineklerinde azaldığını düşünüyoruz (Şekil 4). Bu sonuçgrubumuzun önceki bulgularında da gözlenmiştir 29,30. CI ve CII, elektronların NADH’den ubikinona transferinden CI’nin sorumlu olduğu, CII’nin elektronları s?…

Discussion

HRR, D. melanogaster ve diğer organizmalarda mitokondriyal solunum ve enerji metabolizmasını incelemek için güçlü bir tekniktir. Mitokondriyal fonksiyonun ayrıntılı ve nicel bir değerlendirmesini sağlayarak araştırmacıların hücrelerin biyoenerjetik hakkında fikir edinmelerini sağlar. Burada sunulan protokol, mitokondriyal solunum zinciri fonksiyonunun ve spesifik mitokondriyal komplekslerin aktivitesinin değerlendirilmesini açıklar. SUIT protokolü, mitokondriyal solunumun farklı …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Brezilya ajansı Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior’u (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020) kabul etmektedir. P.M. (#88887.512821/2020-00) ve T.D. (#88887.512883/2020-00) araştırma bursu alıcılarıdır.

Materials

ADP Sigma-Aldrich A5285 Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
Ágar Kasv K25-1800 For bacteriologal use
Antimycin-A Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
Digitonin Sigma-Aldrich D 5628 CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118 Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTA Sigma-Aldrich E8145 Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCP Sigma-Aldrich C2920 Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder 
GraphPad Prism version 8.0.1. Software for data acquisition and analysis
Hepes Sigma-Aldrich H4034 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379 Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOH Sigma-Aldrich 211473 Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
Malate Sigma-Aldrich M1296 Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acid Sigma-Aldrich M1000 (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MES Sigma-Aldrich M3671 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubes Eppendorf
O2K-Titration Set Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
Oligomycin Sigma-Aldrich O 4876 Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
Proline Sigma-Aldrich P0380 L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
Succinate Sigma-Aldrich S 2378 Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
Sucrose Merck 107,651,000 Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
Taurine Sigma-Aldrich T0625 CAS number 107-35-7

References

  1. Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
  2. Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
  3. Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
  4. Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838 (2020).
  5. Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders – A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
  6. Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
  7. DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson’s disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
  8. Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
  9. Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson’s disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
  10. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
  11. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
  12. Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -. F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
  13. Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, 237-246 (2019).
  14. Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
  15. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine – use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
  16. Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
  17. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  18. McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
  19. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
  20. Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
  21. Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson’s disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
  22. Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson’s disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
  23. Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson’s disease. Gene. 857, 147183 (2023).
  24. Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
  25. Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
  26. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
  27. Dytham, C. . Choosing and using statistics: a biologist’s guide. , (2011).
  28. Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
  29. Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
  30. Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
  31. Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
  32. Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
  33. Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
  34. Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
  35. Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
  36. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
  37. Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
  38. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
  39. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
  40. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
  41. Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).

Play Video

Cite This Article
Michelotti, P., Duarte, T., Dalla Corte, C. L. Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (201), e65664, doi:10.3791/65664 (2023).

View Video