Análisis de la función mitocondrial en un mutante PINK1B9-nulo de Drosophila melanogaster mediante respirometría de alta resolución
Summary
En este trabajo presentamos un protocolo de respirometría de alta resolución para analizar la bioenergética en moscas de la fruta mutantes PINK1B9-nulas. El método utiliza el protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
Abstract
Las enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson (EP), y las alteraciones celulares como el cáncer son algunos de los trastornos que alteran el metabolismo energético con deterioro de las funciones mitocondriales. Las mitocondrias son orgánulos que controlan tanto el metabolismo energético como los procesos celulares implicados en la supervivencia y muerte celular. Por esta razón, los enfoques para evaluar la función mitocondrial pueden ofrecer información importante sobre las condiciones celulares en los procesos patológicos y fisiológicos. En este sentido, los protocolos de respirometría de alta resolución (HRR) permiten evaluar toda la función de la cadena respiratoria mitocondrial o la actividad de complejos mitocondriales específicos. Además, el estudio de la fisiología mitocondrial y la bioenergética requiere modelos genética y experimentalmente manejables como Drosophila melanogaster.
Este modelo presenta varias ventajas, como su similitud con la fisiología humana, su rápido ciclo de vida, su fácil mantenimiento, su rentabilidad, su alto rendimiento y su minimización del número de preocupaciones éticas. Estos atributos lo establecen colectivamente como una herramienta invaluable para diseccionar procesos celulares complejos. El presente trabajo explica cómo analizar la función mitocondrial utilizando el mutante PINK1B9-null de Drosophila melanogaster. El gen pink1 es responsable de codificar la quinasa putativa 1 inducida por PTEN, a través de un proceso reconocido como mitofagia, que es crucial para la eliminación de mitocondrias disfuncionales de la red mitocondrial. Las mutaciones en este gen se han asociado con una forma familiar autosómica recesiva de inicio temprano de la EP. Este modelo se puede utilizar para estudiar la disfunción mitocondrial implicada en la fisiopatología de la EP.
Introduction
Las mitocondrias son orgánulos celulares que controlan funciones importantes, incluida la regulación apoptótica, la homeostasis del calcio y la participación en las vías biosintéticas. Al poseer material genético autónomo, son capaces de contribuir a los procesos de mantenimiento y reparación celular. Su estructura alberga la cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa, ambas cruciales para la energía celular 1,2,3. En particular, el control de la energía se logra a través de la producción de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS)2. La alteración del metabolismo energético con deterioro de las funciones mitocondriales ocurre tanto en la supervivencia como en la muerte celular 4,5, frecuentemente asociada a una amplia gama de patologías humanas, como el cáncer, y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson (EP)3,6.
La EP es un trastorno crónico, progresivo y neurológico. La causa principal de esta enfermedad es la muerte de las células cerebrales, especialmente en la sustancia negra, que son responsables de la producción del neurotransmisor dopamina, que controla el movimiento 6,7,8. La primera observación que relacionó el parkinsonismo con la disfunción mitocondrial se realizó en 1988, en modelos experimentales utilizando toxinas que inhiben la cadena respiratoria Complejo I9.
Actualmente, existen varios métodos para evaluar la disfunción mitocondrial 10,11,12,1 3; sin embargo, en comparación con los abordajes convencionales, la respirometría de alta resolución (HRR) presenta una sensibilidad y ventajas superiores13,14. Por ejemplo, los protocolos de HRR permiten evaluar toda la función de la cadena respiratoria mitocondrial o la actividad de complejos mitocondriales específicos14,15. Las disfunciones mitocondriales pueden evaluarse en células intactas, mitocondrias aisladas o incluso ex vivo 10,11,13,14.
Las disfunciones mitocondriales están estrechamente asociadas con muchos procesos patológicos y fisiológicos. Por lo tanto, es importante estudiar la fisiología mitocondrial y la bioenergética utilizando sistemas modelo genética y experimentalmente tratables. En este sentido, la investigación sobre Drosophila melanogaster, la mosca de la fruta, tiene varias ventajas. Este modelo comparte características y procesos celulares fundamentales con los seres humanos, incluido el uso del ADN como material genético, orgánulos comunes y vías moleculares conservadas involucradas en el desarrollo, la inmunidad y la señalización celular. Además, las moscas de la fruta tienen un ciclo de vida rápido, fácil mantenimiento, bajo costo, alto rendimiento y menos preocupaciones éticas, lo que constituye una herramienta invaluable para diseccionar procesos celulares complejos 16,17,18,19,20.
Además, un homólogo del gen de la quinasa putativa 1 (pink1) inducido por PTEN se expresa en D. melanogaster. Desempeña un papel crucial en la eliminación de mitocondrias dañadas a través del proceso de mitofagia8. En humanos, las mutaciones en este gen predisponen a los individuos a una forma familiar autosómica recesiva de EP asociada a disfunción mitocondrial 8,21,22,23. En consecuencia, la mosca de la fruta es un poderoso modelo animal para estudios sobre la fisiopatología de la EP y el cribado de candidatos a fármacos centrados en la disfunción mitocondrial y la bioenergética. Por lo tanto, en el presente trabajo se explica cómo analizar la función mitocondrial en un modelo de EP de D. melanogaster utilizando la técnica HRR en el OROBOROS con el protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
Protocol
Representative Results
Discussion
La HRR es una técnica poderosa para estudiar la respiración mitocondrial y el metabolismo energético en D. melanogaster y otros organismos. Proporciona una evaluación detallada y cuantitativa de la función mitocondrial, lo que permite a los investigadores obtener información sobre la bioenergética de las células. El protocolo presentado aquí describe la evaluación de la función de la cadena respiratoria mitocondrial y la actividad de complejos mitocondriales específicos utilizando el protocolo SUIT e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen a la agencia brasileña Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) y T.D. (#88887.512883/2020-00) son beneficiarios de becas de investigación.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
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