ניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי במוטנט Drosophila melanogaster PINK1B9-Null באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול רספירומטריה ברזולוציה גבוהה לניתוח ביו-אנרגטיקה בזבובי פירות מוטנטיים מסוג PINK1B9-null. השיטה משתמשת בפרוטוקול Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
Abstract
מחלות נוירודגנרטיביות, כולל מחלת פרקינסון (PD), והפרעות תאיות כגון סרטן הן חלק מההפרעות המשבשות את חילוף החומרים האנרגטי עם פגיעה בתפקודי המיטוכונדריה. מיטוכונדריה הם אברונים השולטים הן בחילוף החומרים של האנרגיה והן בתהליכים תאיים המעורבים בהישרדות התאים ובמוות. מסיבה זו, גישות להערכת תפקוד המיטוכונדריה יכולות להציע תובנות חשובות על התנאים התאיים בתהליכים פתולוגיים ופיזיולוגיים. בהקשר זה, פרוטוקולי רספירומטריה ברזולוציה גבוהה (HRR) מאפשרים הערכה של כל תפקוד שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית או הפעילות של קומפלקסים מיטוכונדריאליים ספציפיים. יתר על כן, חקר הפיזיולוגיה והביו-אנרגטיקה של המיטוכונדריה דורש מודלים גנטיים וניסיוניים כגון Drosophila melanogaster.
מודל זה מציג מספר יתרונות, כגון הדמיון שלו לפיזיולוגיה האנושית, מחזור החיים המהיר שלו, תחזוקה קלה, עלות-תועלת, יכולות תפוקה גבוהות ומספר מינימלי של בעיות אתיות. תכונות אלה מבססות אותו באופן קולקטיבי ככלי רב ערך לניתוח תהליכים תאיים מורכבים. העבודה הנוכחית מסבירה כיצד לנתח את תפקוד המיטוכונדריה באמצעות מוטציה Drosophila melanogaster PINK1B9-null. הגן pink1 אחראי לקידוד קינאז משוער 1 המושרה על ידי PTEN, באמצעות תהליך המוכר כמיטופגיה, שהוא חיוני לסילוק מיטוכונדריה לא מתפקדת מהרשת המיטוכונדריאלית. מוטציות בגן זה נקשרו לצורה משפחתית אוטוזומלית רצסיבית מוקדמת של פרקינסון. מודל זה יכול לשמש לחקר תפקוד לקוי של המיטוכונדריה המעורב בפתופיזיולוגיה של פרקינסון.
Introduction
מיטוכונדריה הם אברונים תאיים השולטים בתפקודים חשובים, כולל ויסות אפופטוטי, הומאוסטזיס סידן והשתתפות במסלולים ביוסינתטיים. על ידי בעל חומר גנטי אוטונומי, הם מסוגלים לתרום לתהליכי תחזוקה ותיקון תאים. המבנה שלהם מכיל את שרשרת הובלת האלקטרונים ואת הזרחן החמצוני, שניהם חיוניים לאנרגיה תאית 1,2,3. בפרט, בקרת אנרגיה מושגת באמצעות ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחן חמצוני (OXPHOS)2. הפרעה בחילוף החומרים האנרגטי עם פגיעה בתפקודי המיטוכונדריה מתרחשת הן בהישרדות תאיםוהן במוות 4,5, הקשורים לעתים קרובות למגוון רחב של פתולוגיות אנושיות, כגון סרטן, ומחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פרקינסון (PD)3,6.
מחלת פרקינסון היא הפרעה כרונית, פרוגרסיבית ונוירולוגית. הגורם העיקרי למחלה זו הוא מוות של תאי מוח, במיוחד בחומר ניגרה, אשר אחראים לייצור של נוירוטרנסמיטר דופמין, אשר שולט על תנועה 6,7,8. התצפית המוקדמת ביותר שקישרה בין פרקינסוניזם לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה נעשתה בשנת 1988, במודלים ניסיוניים המשתמשים ברעלים המעכבים את שרשרת הנשימה קומפלקס I9.
נכון לעכשיו, ישנן מספר שיטות להערכת תפקוד לקוי של המיטוכונדריה 10,11,12,1 3; עם זאת, בהשוואה לגישות קונבנציונליות, רספירומטריה ברזולוציה גבוהה (HRR) מציגה רגישות ויתרונות מעולים13,14. לדוגמה, פרוטוקולי HRR מאפשרים להעריך את כל תפקוד שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית או את הפעילות של קומפלקסים מיטוכונדריאליים ספציפיים14,15. ניתן להעריך תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בתאים שלמים, במיטוכונדריה מבודדים, או אפילו ב-ex vivo 10,11,13,14.
תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור קשר הדוק עם תהליכים פתולוגיים ופיזיולוגיים רבים. לכן חשוב לחקור פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית וביו-אנרגטיקה באמצעות מערכות מודל גנטיות וניסיוניות. בהקשר זה, מחקר על Drosophila melanogaster, זבוב הפירות, יש כמה יתרונות. מודל זה חולק מאפיינים ותהליכים תאיים בסיסיים עם בני אדם, כולל שימוש בדנ”א כחומר גנטי, אברונים משותפים ומסלולים מולקולריים שמורים המעורבים בהתפתחות, חסינות ואיתות תאי. בנוסף, לזבובי הפירות יש מחזור חיים מהיר, תחזוקה קלה, עלות נמוכה, תפוקה גבוהה ופחות דאגות אתיות, ובכך מהווים כלי רב ערך לניתוח תהליכים תאיים מורכבים 16,17,18,19,20.
יתר על כן, הומולוג של הגן קינאז משוער 1 (pink1) המושרה על ידי PTEN מבוטא ב- D. melanogaster. יש לו תפקיד מכריע בסילוק מיטוכונדריה פגומה בתהליך של מיטופגיה8. בבני אדם, מוטציות בגן זה נוטות אנשים לצורה משפחתית אוטוזומלית רצסיבית של PD הקשורה לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה 8,21,22,23. כתוצאה מכך, זבוב הפירות הוא מודל חייתי רב עוצמה למחקרים על הפתופיזיולוגיה של מחלת פרקינסון ולסינון מועמדים לתרופות המתמקדים בתפקוד לקוי של המיטוכונדריה ובביו-אנרגטיקה. לכן, העבודה הנוכחית מסבירה כיצד לנתח תפקוד מיטוכונדריאלי במודל של PD מ D. melanogaster באמצעות טכניקת HRR ב OROBOROS עם Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT) פרוטוקול.
Protocol
Representative Results
Discussion
HRR היא טכניקה רבת עוצמה לחקר נשימה מיטוכונדריאלית ומטבוליזם של אנרגיה ב-D. melanogaster ובאורגניזמים אחרים. הוא מספק הערכה מפורטת וכמותית של תפקוד המיטוכונדריה, ומאפשר לחוקרים לקבל תובנות לגבי הביו-אנרגטיקה של התאים. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את הערכת תפקוד שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ואת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לסוכנות הברזילאית Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) ו- T.D. (#88887.512883/2020-00) הם מקבלי מלגות מחקר.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838 (2020).
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders – A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson’s disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson’s disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -. F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine – use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson’s disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson’s disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson’s disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics: a biologist’s guide. , (2011).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
