نقدم هنا بروتوكول قياس التنفس عالي الدقة لتحليل الطاقة الحيوية في ذباب الفاكهة الطافر PINK1B9-null. تستخدم الطريقة بروتوكول الركيزة – فك التوصيل – المثبط – المعايرة (SUIT).
الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون (PD) ، والاضطرابات الخلوية مثل السرطان هي بعض الاضطرابات التي تعطل استقلاب الطاقة مع ضعف وظائف الميتوكوندريا. الميتوكوندريا عضيات تتحكم في كل من استقلاب الطاقة والعمليات الخلوية المشاركة في بقاء الخلايا وموتها. لهذا السبب ، يمكن أن تقدم طرق تقييم وظيفة الميتوكوندريا رؤى مهمة حول الحالات الخلوية في العمليات المرضية والفسيولوجية. في هذا الصدد ، تسمح بروتوكولات قياس التنفس عالية الدقة (HRR) بتقييم وظيفة السلسلة التنفسية للميتوكوندريا بأكملها أو نشاط مجمعات الميتوكوندريا المحددة. علاوة على ذلك ، تتطلب دراسة فسيولوجيا الميتوكوندريا وعلم الطاقة الحيوية نماذج قابلة للتتبع وراثيا وتجريبيا مثل ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر.
يقدم هذا النموذج العديد من المزايا ، مثل تشابهه مع علم وظائف الأعضاء البشرية ، ودورة حياته السريعة ، وسهولة الصيانة ، والفعالية من حيث التكلفة ، وقدرات الإنتاجية العالية ، وتقليل عدد المخاوف الأخلاقية. هذه السمات تؤسسها بشكل جماعي كأداة لا تقدر بثمن لتشريح العمليات الخلوية المعقدة. يشرح العمل الحالي كيفية تحليل وظيفة الميتوكوندريا باستخدام ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر PINK1B9-null الطافرة. الجين pink1 مسؤول عن تشفير كيناز 1 المفترض الناجم عن PTEN ، من خلال عملية تعرف باسم mitophagy ، وهو أمر بالغ الأهمية لإزالة الميتوكوندريا المختلة وظيفيا من شبكة الميتوكوندريا. ارتبطت الطفرات في هذا الجين بشكل وراثي جسدي متنحي مبكر من مرض باركنسون. يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة خلل الميتوكوندريا المتضمن في الفيزيولوجيا المرضية لمرض باركنسون.
الميتوكوندريا عضيات خلوية تتحكم في وظائف مهمة، بما في ذلك التنظيم المبرمج، وتوازن الكالسيوم، والمشاركة في مسارات التخليق الحيوي. من خلال امتلاك مادة وراثية مستقلة ، فهي قادرة على المساهمة في عمليات الصيانة والإصلاح الخلوية. يحتوي هيكلها على سلسلة نقل الإلكترون والفسفرة التأكسدية ، وكلاهما ضروري للطاقة الخلوية1،2،3. على وجه الخصوص ، يتم تحقيق التحكم في الطاقة من خلال إنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) 2. يحدث اضطراب استقلاب الطاقة مع ضعف وظائف الميتوكوندريا في كل من بقاء الخلية وموتها 4,5 ، وغالبا ما يرتبط بمجموعة واسعة من الأمراض البشرية ، مثل السرطان ، والأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون (PD)3,6.
PD هو اضطراب مزمن وتقدمي وعصبي. السبب الرئيسي لهذا المرض هو موت خلايا المخ ، وخاصة في المادة السوداء ، المسؤولة عن إنتاج الناقل العصبي الدوبامين ، الذي يتحكم في الحركة6،7،8. تم إجراء أول ملاحظة تربط الشلل الرعاش بخلل الميتوكوندريا في عام 1988 ، في نماذج تجريبية باستخدام السموم التي تمنع السلسلة التنفسية ComplexI 9.
حاليا ، هناك عدة طرق لتقييم ضعف الميتوكوندريا10،11،12،13 ؛ ومع ذلك ، بالمقارنة مع الأساليب التقليدية ، فإن قياس التنفس عالي الدقة (HRR) يقدم حساسية ومزايا فائقة13,14. على سبيل المثال ، تسمح بروتوكولات HRR بتقييم وظيفة السلسلة التنفسية للميتوكوندريا بأكملها أو نشاط مجمعات الميتوكوندريا المحددة14,15. يمكن تقييم اختلالات الميتوكوندريا في الخلايا السليمة أو الميتوكوندريا المعزولة أو حتى خارج الجسم الحي10،11،13،14.
ترتبط اختلالات الميتوكوندريا ارتباطا وثيقا بالعديد من العمليات المرضية والفسيولوجية. لذلك من المهم دراسة فسيولوجيا الميتوكوندريا والطاقة الحيوية باستخدام أنظمة نموذجية قابلة للتتبع وراثيا وتجريبيا. في هذا الصدد ، فإن البحث عن ذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة ، له العديد من المزايا. يشترك هذا النموذج في الخصائص والعمليات الخلوية الأساسية مع البشر ، بما في ذلك استخدام الحمض النووي كمادة وراثية ، وعضيات مشتركة ، ومسارات جزيئية محفوظة تشارك في التطور والمناعة وإشارات الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع ذباب الفاكهة بدورة حياة سريعة ، وسهولة الصيانة ، وتكلفة منخفضة ، وإنتاجية عالية ، ومخاوف أخلاقية أقل ، مما يشكل أداة لا تقدر بثمن لتشريح العمليات الخلوية المعقدة16،17،18،19،20.
علاوة على ذلك ، يتم التعبير عن متماثل جين كيناز 1 (الوردي 1) الناجم عن PTEN في D. melanogaster. يلعب دورا حاسما في إزالة الميتوكوندريا التالفة من خلال عملية الميتوفاجي8. في البشر ، تهيئ الطفرات في هذا الجين الأفراد لشكل عائلي جسمي متنحي من مرض باركنسون المرتبط بخلل الميتوكوندريا8،21،22،23. وبالتالي ، فإن ذبابة الفاكهة هي نموذج حيواني قوي للدراسات حول الفيزيولوجيا المرضية لمرض باركنسون وفحص الأدوية المرشحة التي تركز على خلل الميتوكوندريا والطاقة الحيوية. لذلك ، يشرح العمل الحالي كيفية تحليل وظيفة الميتوكوندريا في نموذج PD من D. melanogaster باستخدام تقنية HRR في OROBOROS مع بروتوكول Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
HRR هي تقنية قوية لدراسة تنفس الميتوكوندريا واستقلاب الطاقة في D. melanogaster والكائنات الحية الأخرى. يوفر تقييما مفصلا وكميا لوظيفة الميتوكوندريا ، مما يسمح للباحثين باكتساب نظرة ثاقبة على الطاقة الحيوية للخلايا. يصف البروتوكول المقدم هنا تقييم وظيفة السلسلة التنفسية للميتوكوندريا ونشا?…
The authors have nothing to disclose.
يعترف المؤلفون بالوكالة البرازيلية Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 # 88887.505377/2020). P.M. (# 88887.512821 / 2020-00) و T.D. (# 88887.512883 / 2020-00) هم من المستفيدين من الزمالة البحثية.
ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
Distilled water | |||
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
Pistil to homogenization | |||
Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |