Summary

تحليل وظيفة الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر PINK1B9-null الطافرة باستخدام قياس التنفس عالي الدقة

Published: November 10, 2023
doi:

Summary

نقدم هنا بروتوكول قياس التنفس عالي الدقة لتحليل الطاقة الحيوية في ذباب الفاكهة الطافر PINK1B9-null. تستخدم الطريقة بروتوكول الركيزة – فك التوصيل – المثبط – المعايرة (SUIT).

Abstract

الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون (PD) ، والاضطرابات الخلوية مثل السرطان هي بعض الاضطرابات التي تعطل استقلاب الطاقة مع ضعف وظائف الميتوكوندريا. الميتوكوندريا عضيات تتحكم في كل من استقلاب الطاقة والعمليات الخلوية المشاركة في بقاء الخلايا وموتها. لهذا السبب ، يمكن أن تقدم طرق تقييم وظيفة الميتوكوندريا رؤى مهمة حول الحالات الخلوية في العمليات المرضية والفسيولوجية. في هذا الصدد ، تسمح بروتوكولات قياس التنفس عالية الدقة (HRR) بتقييم وظيفة السلسلة التنفسية للميتوكوندريا بأكملها أو نشاط مجمعات الميتوكوندريا المحددة. علاوة على ذلك ، تتطلب دراسة فسيولوجيا الميتوكوندريا وعلم الطاقة الحيوية نماذج قابلة للتتبع وراثيا وتجريبيا مثل ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر.

يقدم هذا النموذج العديد من المزايا ، مثل تشابهه مع علم وظائف الأعضاء البشرية ، ودورة حياته السريعة ، وسهولة الصيانة ، والفعالية من حيث التكلفة ، وقدرات الإنتاجية العالية ، وتقليل عدد المخاوف الأخلاقية. هذه السمات تؤسسها بشكل جماعي كأداة لا تقدر بثمن لتشريح العمليات الخلوية المعقدة. يشرح العمل الحالي كيفية تحليل وظيفة الميتوكوندريا باستخدام ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر PINK1B9-null الطافرة. الجين pink1 مسؤول عن تشفير كيناز 1 المفترض الناجم عن PTEN ، من خلال عملية تعرف باسم mitophagy ، وهو أمر بالغ الأهمية لإزالة الميتوكوندريا المختلة وظيفيا من شبكة الميتوكوندريا. ارتبطت الطفرات في هذا الجين بشكل وراثي جسدي متنحي مبكر من مرض باركنسون. يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة خلل الميتوكوندريا المتضمن في الفيزيولوجيا المرضية لمرض باركنسون.

Introduction

الميتوكوندريا عضيات خلوية تتحكم في وظائف مهمة، بما في ذلك التنظيم المبرمج، وتوازن الكالسيوم، والمشاركة في مسارات التخليق الحيوي. من خلال امتلاك مادة وراثية مستقلة ، فهي قادرة على المساهمة في عمليات الصيانة والإصلاح الخلوية. يحتوي هيكلها على سلسلة نقل الإلكترون والفسفرة التأكسدية ، وكلاهما ضروري للطاقة الخلوية1،2،3. على وجه الخصوص ، يتم تحقيق التحكم في الطاقة من خلال إنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) 2. يحدث اضطراب استقلاب الطاقة مع ضعف وظائف الميتوكوندريا في كل من بقاء الخلية وموتها 4,5 ، وغالبا ما يرتبط بمجموعة واسعة من الأمراض البشرية ، مثل السرطان ، والأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون (PD)3,6.

PD هو اضطراب مزمن وتقدمي وعصبي. السبب الرئيسي لهذا المرض هو موت خلايا المخ ، وخاصة في المادة السوداء ، المسؤولة عن إنتاج الناقل العصبي الدوبامين ، الذي يتحكم في الحركة6،7،8. تم إجراء أول ملاحظة تربط الشلل الرعاش بخلل الميتوكوندريا في عام 1988 ، في نماذج تجريبية باستخدام السموم التي تمنع السلسلة التنفسية ComplexI 9.

حاليا ، هناك عدة طرق لتقييم ضعف الميتوكوندريا10،11،12،13 ؛ ومع ذلك ، بالمقارنة مع الأساليب التقليدية ، فإن قياس التنفس عالي الدقة (HRR) يقدم حساسية ومزايا فائقة13,14. على سبيل المثال ، تسمح بروتوكولات HRR بتقييم وظيفة السلسلة التنفسية للميتوكوندريا بأكملها أو نشاط مجمعات الميتوكوندريا المحددة14,15. يمكن تقييم اختلالات الميتوكوندريا في الخلايا السليمة أو الميتوكوندريا المعزولة أو حتى خارج الجسم الحي10،11،13،14.

ترتبط اختلالات الميتوكوندريا ارتباطا وثيقا بالعديد من العمليات المرضية والفسيولوجية. لذلك من المهم دراسة فسيولوجيا الميتوكوندريا والطاقة الحيوية باستخدام أنظمة نموذجية قابلة للتتبع وراثيا وتجريبيا. في هذا الصدد ، فإن البحث عن ذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة ، له العديد من المزايا. يشترك هذا النموذج في الخصائص والعمليات الخلوية الأساسية مع البشر ، بما في ذلك استخدام الحمض النووي كمادة وراثية ، وعضيات مشتركة ، ومسارات جزيئية محفوظة تشارك في التطور والمناعة وإشارات الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع ذباب الفاكهة بدورة حياة سريعة ، وسهولة الصيانة ، وتكلفة منخفضة ، وإنتاجية عالية ، ومخاوف أخلاقية أقل ، مما يشكل أداة لا تقدر بثمن لتشريح العمليات الخلوية المعقدة16،17،18،19،20.

علاوة على ذلك ، يتم التعبير عن متماثل جين كيناز 1 (الوردي 1) الناجم عن PTEN في D. melanogaster. يلعب دورا حاسما في إزالة الميتوكوندريا التالفة من خلال عملية الميتوفاجي8. في البشر ، تهيئ الطفرات في هذا الجين الأفراد لشكل عائلي جسمي متنحي من مرض باركنسون المرتبط بخلل الميتوكوندريا8،21،22،23. وبالتالي ، فإن ذبابة الفاكهة هي نموذج حيواني قوي للدراسات حول الفيزيولوجيا المرضية لمرض باركنسون وفحص الأدوية المرشحة التي تركز على خلل الميتوكوندريا والطاقة الحيوية. لذلك ، يشرح العمل الحالي كيفية تحليل وظيفة الميتوكوندريا في نموذج PD من D. melanogaster باستخدام تقنية HRR في OROBOROS مع بروتوكول Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

Protocol

استخدمنا السلالات w1118 (أبيض) و w [*] Pink1 [B9] / FM7i ، P {w [+ mC] = ActGFP}JMR3 (يشار إليها باسم Pink1B9) (معرف FlyBase: FBgn0029891) من مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة (رقم الهوية: 34749). في هذه الدراسة ، تمت مقارنة ذكور D. melanogaster PINK1B9-null مع ذكور D. melanogaster من سلالة w1118 ، والتي تستخدم ك?…

Representative Results

هنا ، نحن أن تدفق O2 في حالات OXPHOS CI (P = 0.0341) و OXPHOS CI&II (P = 0.0392) يتم تقليله في الذباب الفارغ PINK1B9 عند مقارنته بالذباب الضابط (الشكل 4). وقد لوحظت هذه النتيجة أيضا في النتائج السابقة من مجموعتنا29،30. CI و CII هما م?…

Discussion

HRR هي تقنية قوية لدراسة تنفس الميتوكوندريا واستقلاب الطاقة في D. melanogaster والكائنات الحية الأخرى. يوفر تقييما مفصلا وكميا لوظيفة الميتوكوندريا ، مما يسمح للباحثين باكتساب نظرة ثاقبة على الطاقة الحيوية للخلايا. يصف البروتوكول المقدم هنا تقييم وظيفة السلسلة التنفسية للميتوكوندريا ونشا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يعترف المؤلفون بالوكالة البرازيلية Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 # 88887.505377/2020). P.M. (# 88887.512821 / 2020-00) و T.D. (# 88887.512883 / 2020-00) هم من المستفيدين من الزمالة البحثية.

Materials

ADP Sigma-Aldrich A5285 Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
Ágar Kasv K25-1800 For bacteriologal use
Antimycin-A Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
Digitonin Sigma-Aldrich D 5628 CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118 Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTA Sigma-Aldrich E8145 Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCP Sigma-Aldrich C2920 Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder 
GraphPad Prism version 8.0.1. Software for data acquisition and analysis
Hepes Sigma-Aldrich H4034 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379 Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOH Sigma-Aldrich 211473 Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
Malate Sigma-Aldrich M1296 Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acid Sigma-Aldrich M1000 (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MES Sigma-Aldrich M3671 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubes Eppendorf
O2K-Titration Set Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
Oligomycin Sigma-Aldrich O 4876 Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
Proline Sigma-Aldrich P0380 L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
Succinate Sigma-Aldrich S 2378 Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
Sucrose Merck 107,651,000 Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
Taurine Sigma-Aldrich T0625 CAS number 107-35-7

References

  1. Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
  2. Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
  3. Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
  4. Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838 (2020).
  5. Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders – A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
  6. Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
  7. DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson’s disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
  8. Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
  9. Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson’s disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
  10. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
  11. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
  12. Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -. F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
  13. Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, 237-246 (2019).
  14. Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
  15. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine – use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
  16. Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
  17. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  18. McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
  19. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
  20. Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
  21. Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson’s disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
  22. Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson’s disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
  23. Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson’s disease. Gene. 857, 147183 (2023).
  24. Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
  25. Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
  26. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
  27. Dytham, C. . Choosing and using statistics: a biologist’s guide. , (2011).
  28. Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
  29. Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
  30. Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
  31. Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
  32. Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
  33. Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
  34. Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
  35. Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
  36. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
  37. Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
  38. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
  39. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
  40. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
  41. Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).

Play Video

Cite This Article
Michelotti, P., Duarte, T., Dalla Corte, C. L. Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (201), e65664, doi:10.3791/65664 (2023).

View Video