基质辅助激光解吸/电离成像质谱分析用硬棕榈籽的制备
Summary
该协议旨在描述用于MALDI-IMS分析的低含水量硬种子样品切片的详细指南，保持分析物的原始分布和丰度，并提供高质量的信号和空间分辨率。
Abstract
基质辅助激光解吸/电离成像质谱法（MALDI-IMS）用于鉴定天然环境中的化合物。目前，MALDI-IMS在临床分析中经常使用。尽管如此，对于更好地应用这种技术来了解植物组织中化合物的生理信息，仍然存在一个很好的视角。然而，对于植物材料的特定样品，制备可能具有挑战性，因为MALDI-IMS需要薄片（12-20μm）才能进行适当的数据采集和成功分析。从这个意义上说，之前，我们开发了一种样品制备方案来获得 Euterpe oleracea （巴西莓）硬种子的薄片，从而能够通过MALDI-IMS进行分子定位。
在这里，我们表明所开发的方案适用于制备来自同一属的其他种子。简而言之，该方案基于将种子浸没在去离子水中24小时，用明胶嵌入样品，并将它们切片在适应的低温恒温器中。然后，对于基质沉积，使用 1：1 （v/v） 2,5-二羟基苯甲酸 （DHB） 和含 0.1% 三氟乙酸的甲醇溶液以 30 mg/mL 的速度将 xy 运动平台耦合到电喷雾电离 （ESI） 针喷雾。使用软件处理 E. precatoria 和 E. edulis 种子数据以绘制其代谢物模式。
己糖低聚物在样品切片中作图，以证明这些样品的方案的充分性，因为已知这些种子含有大量的甘露聚糖，甘露聚糖是己糖甘露糖的聚合物。结果，鉴定了己糖低聚物的峰，以 （Δ = 162 Da） 的 [M + K]+ 加合物为代表。因此，先前为 E. oleracea 种子量身定制的样品制备方案也使另外两种硬棕榈种子的MALDI-IMS分析成为可能。简而言之，该方法可以成为研究植物材料形态解剖学和生理学的宝贵工具，特别是来自抗切割样品的研究。
Introduction
基质辅助激光解吸/电离成像质谱 （MALDI-IMS） 是一种强大的方法，可实现二维生物分子分配，对可电离化合物进行非靶向研究，并确定其空间分布，尤其是在生物样品中 1,2。二十年来，该技术能够同时检测和鉴定脂质、肽、碳水化合物、蛋白质、其他代谢物和合成分子，例如治疗药物 3,4。MALDI-IMS有助于在组织样品表面进行化学分析，无需提取、纯化、分离、标记或染色剂。然而，为了成功分析，该技术的一个关键步骤是样品制备，特别是在植物组织中，由于环境适应，植物组织被特化并修饰为广泛的复杂器官5。
由于植物组织固有的物理化学特性，需要一种适应方案来适应MALDI-IMS分析的要求，并在切片制备过程中保持组织的原始形状6,7。对于非常规样品（如种子），既定方案8不适用，因为这些组织具有刚性的细胞壁和低含水量，这很容易导致切片碎裂并导致化合物离域9。
我们的研究小组已经发表了关于分子图谱的实验数据和用于 MALDI-IMS 分析的 açaí （Euterpe oleracea Mart.） 种子10、11、12 的适应方案，这是在可租用的巴西莓果肉13 生产过程中大量产生的副产品。这个想法是开发一种原 位绘制巴西 莓种子中不同代谢物的方案，帮助提出目前尚未进行商业探索的这种农业废物的可能用途。然而，由于巴西莓种子的抗性，有必要定制一个方案，以便从MALDI-IMS分析中获得适当的样品切片。
在这种背景下，具有重要经济意义的巴西莓果肉推动了具有相似感官特征的Euterpe属棕榈树的其他果实的日益商业化。作为巴西莓14,15 的替代品，在工业规模上生产的两种新兴棕榈树的果实是生长在亚马逊干旱地区的 E. precatoria（称为 açaí-do-amazonas）和 E. edulis（称为 juçara），这是典型的大西洋森林。然而，食用 açaí-do-amazonas 和 juçara 会导致相同的抗性和不可食用种子的积累，这些种子尚未得到利用，并且迄今为止尚未对其详细的化学成分进行研究。
因此，我们在这里证明，先前设计的方案可用于分析 E . precatoria 和 E. edulis 种子，以便通过 MALDI-IMS 进行分子定位，证明是一种强大的工具，可用于分析这些资源的组成，并有助于确定它们潜在的生物技术用途。此外，此处提供的详细说明可以帮助其他有类似困难的人制备用于MALDI-IMS分析的抗性材料。
Protocol
Representative Results
Discussion
植物由具有特定生化功能的特殊组织组成。因此，MALDI-IMS的样品制备方案必须根据具有特定物理化学性质的各种植物组织进行设计，因为样品必须保持其原始的分析物分布和丰度，以获得高质量的信号和空间分辨率8。
在进行MALDI-IMS分析之前，首要考虑因素是正确收集和储存样品。然而，在植物中，样品制备通常因分析的组织而异。例如，植物组织中的细胞?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由塞拉皮海拉研究所 （Serra-1708-15009） 和卡洛斯·查加斯·菲略支持里约热内卢州研究基金会 （FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021） 资助。塞拉皮海拉研究所和国家科学技术发展委员会（CNPq）为费利佩·洛佩斯·布鲁姆博士和加布里埃尔·马丁斯博士（机构能力建设计划/INT/MCTI）颁发了奖学金。高等教育人员改进协调会 （CAPES） 因向 Davi M. M. C. da Silva 先生颁发硕士奖学金而受到认可。马萨斯生物分子光谱中心（CEMBIO-UFRJ）因提供MALDI-IMS分析服务而受到认可，并感谢Alan Menezes do Nascimento先生和由MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ 442604资助的Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise（CENANO-INT）进行基本成分分析。
Materials
| 1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81320 | |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
| APCI needle | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 602193 | |
| AxiDraw V3 xy motion platform | Evil Mad Scientist, CA, USA | 2510 | |
| Carbon double-sided conductive tape | |||
| Compass Data Analysis software | creation of mass list | ||
| Compressed air | |||
| copper double-faced adhesive tape | 3M, USA | 1182-3/4"X18YD | |
| Cryostat CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | ||
| Diamond Wafering Blade 15 HC | |||
| Everhart-Thornley detector | |||
| FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | image acquisition | |
| FTMS Processing | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | data calibration | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma Aldrich Co, MO, USA | G9391 | |
| High Profile Microtome Blades Leica 818 | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | 0358 38926 | |
| indium tin oxide coated glass slide | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8237001 | |
| Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA | ||
| IsoMet 1000 precision cutter | Buehler, Illinois, USA | ||
| Methanol | J.T.Baker | 9093-03 | |
| Mili-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
| Oil vacuum pump | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound | Fisher HealthCare, Texas, USA | 4585 | |
| Parafilm "M" Sealing Film | Amcor | HS234526B | |
| Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, USA | ||
| SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Software INCA Suite 4.14 V | Oxford Instruments, Ableton, UK | ||
| Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Syringe pump | kdScientific, MA, USA | 78-9100K | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 302031 | |
| X-Max spectrometer | Oxford Instruments, Ableton, UK |
References
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