Burada sunulan deneysel tasarım, lenf nodu (LN) metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücrelerinin çalışmaları için yararlı bir üreme modeli sağlar, bu da seyirci CD8+ T hücrelerinin bozulmasını dışlar.
Drenaj lenf nodlarından tümör antijenine özgü CD8+ T hücreleri, tümör oluşumu sırasında anti-tümör immün yanıtının oluşturulmasında biriken bir önem kazanır. Bununla birlikte, çoğu durumda, kanser hücreleri, uzak organlara daha fazla metastaz yapmadan önce lenf düğümlerinde metastatik lokuslar oluşturur. Lokal ve sistematik CD8+ T hücresi yanıtlarının LN metastazından ne ölçüde etkilendiği belirsizliğini korumaktadır. Bu amaçla, lenfositik koriomenenjit virüsü (LCMV), glikoprotein (GP) ve sınıf I majör histouyumluluk kompleksi (MHC) molekülü H-2Db tarafından sunulan GP kaynaklı peptit GP33-41’e özgü T hücresi reseptörlerini (TCR’ler) barındıran T hücresi reseptörlerini (TCR’ler) barındıran vekil neoantijeni eksprese eden bir B16F10-GP melanom hücre hattı ile birleştirilmiş bir murin LN metastaz modeli oluşturduk. Bu protokol, LN metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücresi yanıtlarının incelenmesini sağlar. Bu protokolde, C57BL / 6J fareleri deri altına B16F10-GP hücreleri ile implante edildi, ardından saf P14 hücreleri ile evlat edinme transferi yapıldı. Subkutan tümörün çapı yaklaşık 5 mm’ye ulaştığında, primer tümör eksize edildi ve B16F10-GP hücreleri doğrudan tümör drenaj lenf noduna (TdLN) enjekte edildi. Daha sonra, LN metastazı sürecinde CD8+ T hücrelerinin dinamikleri izlendi. Toplu olarak, bu model, LN metastazı sırasında antijene özgü CD8 + T hücresi immün yanıtlarını kesin olarak araştırmak için bir yaklaşım sağlamıştır.
Kanser immünoterapisi, özellikle bağışıklık kontrol noktası blokajı (ICB), kanser tedavisinde devrim yarattı1. ICB, tümör mikroçevresindeki (TME) tükenmiş CD8 + T hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilen koinhibitör immünoreseptörleri (PD-1, Tim-3, LAG-3 ve TIGIT gibi) bloke eder ve tükenmiş CD8 + T hücrelerinin yeniden canlanmasına yol açar2. Tükenmiş CD8 + T hücrelerinin heterojenliği göz önüne alındığında, biriken kanıtlar, drenaj lenf nodu (dLN) dahil olmak üzere periferden türetilen, ancak TME’de olmayan, tümöre özgü CD8 + T hücrelerinin ICB 3,4,5,6,7,8’in etkinliğine aracılık ettiğini ortaya koymuştur. Son zamanlarda, TdLN’den türetilen TCF-1+TOX– tümöre özgü bellek CD8+ T hücrelerinin (TdLN-TTSM), geleneksel bellek T hücrelerinin çeşitli fonksiyonel özelliklerini içeren ve ICB tedavisi üzerine döl tükenmiş hücrelere daha da genişleyebilen ve farklılaşabilen ICB’ye gerçek yanıt verenler olduğu doğrulandı9. Toplamda, bu bulgular anti-tümör bağışıklığının artmasında LN’nin önemini doğruladı.
Lenf nodu, biyolojik sinyallerin yanı sıra yapısal temel sağlayarak tümöre özgü CD8+ T hücrelerinin hazırlanmasını ve aktivasyonunu kolaylaştırmada kritik bir yer olarak işlev görür10. Çeşitli kanser hücreleri, sistematik yayılımdan önce sıklıkla sentinel lenf nodunu (SLN, primer tümörü boşaltan ilk LN) tohumlar11. SLN metastazının varlığı, insan kanserinde kötü sonuçla bağlantılıdır ve klinik öncesi modeller, TdLN’deki tümör hücrelerinin hem lenfatik damarlar hem dedüğüm 12,13,14,15’in kan damarları yoluyla uzak organlara yayılabileceğini göstermiştir. SLN biyopsisi, birçok solid tümör tipinde sonraki tedavi kararlarına rehberlik etmek için standart bir prosedürü temsil etmektedir ve bu da tutulmamış LN’nin gereksiz rezeksiyonunu önleyebilir16,17. İlgili LN’ye bile, cerrahi rezeksiyonun gerekli olup olmadığı ve ne zaman gerekli olduğu tartışmalıdır, çünkü birkaç çalışma, bölgesel LN’nin çıkarılmasının, bölgesel LN rezeksiyonu olmadan radyasyon veya sistemik tedavi alanlara kıyasla genel sağkalımda iyileşme göstermediğini göstermiştir18,19. Bir yorum, mikroskobik hastalığı olan metastatik LN’nin (mLN), bağışıklık hücrelerini eğitmek ve bazı terapötik faydalar sağlamak için bir miktar kapasiteyi koruyabileceğidir. Bu nedenle, LN metastazının anti-tümör immün yanıtını, özellikle TdLN-TTSM’nin özelliklerini ve fonksiyonlarını nasıl etkilediğini aydınlatmak kritik öneme sahiptir.
Şimdiye kadar, hem klinik öncesi hem de klinik veriler mLN20’de bazı yapısal ve hücresel değişiklikler ortaya koymuştur. Bununla birlikte, LN metastazı sırasında tümöre özgü CD8 + T hücrelerinin dinamik değişiklikleri tanımlanmamıştır. Bu nedenle, daha fazla araştırma için zorlayıcı bir LN metastazı modeli geliştirmeye ihtiyaç vardır. Gerçekten de, birkaç çalışma mLN fare modellerini farklı yollarla bildirmiştir 14,21,22. Örneğin, aksiller LN’lerde spontan metastaz, 4T1 meme kanseri hücrelerinin meme yağ yastığı22’ye implantasyonu yoluyla gerçekleştirildi. Başka bir çalışmada, Reticker-Flynn ve ark. ayrışmış mLN dokularından kültürlenen tümör hücrelerinin seri aşılanması yoluyla deri altı primer tümörden LN’lere yüksek yayılma insidansına sahip melanom hücre hatları üretti (dokuz tur)14. Yaygın olarak kullanılan bir diğer model, tümör hücrelerinin ayak tabanına enjeksiyonu ile hazırlandı ve metastatik lokuslar popliteal LN22’de oluşturulacaktı. Özellikle, müdahalenin kesin zaman noktalarını değerlendirmek zordur, çünkü bu modellerde LN metastazı her zaman sadık değildir.
Bu çalışmada, LCMV virüsü glikoprotein (GP) gen dizisinin B16F10 hücre hattı9’un genomuna CRISPR/Cas9 aracılı eklenmesiyle oluşturulan B16F10-GP hücrelerinin23,24 intranodal enjeksiyonu yoluyla bir murin LN metastatik modeli oluşturulmuştur. Daha sonra, bu fareler, transgenik T hücre reseptörlerini (TCR’ler) barındıran P14 hücreleri ile transfer edildi ve spesifik olarak H-2Db GP33-41 epitop25,26’yı tanıdı ve LN metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücrelerinin sistemik ve lokal dinamikleri araştırılabildi. Deneysel tasarımımız, immün yanıtların, özellikle de LN metastazı sırasında antijene özgü CD8 + T hücrelerinin, seyirci CD8 + T hücrelerinin pertürbasyonunu dışlayan çalışması için yararlı bir model sunmaktadır. Bu sonuçlar, mLN’nin çıkarılması veya saklanması konusundaki klinik tedavi seçeneklerini etkileyecek ve maksimum terapötik fayda elde etmek için mLN’nin manipülasyonuna yeni bir ışık tutacaktır.
Tümör oluşumu sırasında, antijen sunan hücreler (APC’ler) tümör antijenlerini yutar ve CD8+ T hücrelerini hazırladıkları TdLN’ye göç eder. Hazırlama ve aktivasyondan sonra, CD8 + T hücreleri TdLN’yi terk eder ve tümör hücrelerini öldürmek için tümöre sızar10. TdLN rezeksiyonu ve lenfoid organlardan bağışıklık hücrelerinin çıkışını bloke eden FTY720’nin uygulanması yoluyla, birkaç çalışma TdLN’nin PD-1/PD-L1 kontrol noktası tedavisini…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Çin’in Seçkin Genç Akademisyenleri için Ulusal Bilim Vakfı (No. 82122028’den LX’e), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82173094’den LX’e), Chong Qing Doğa Bilimleri Vakfı (No. 2023NSCQ-BHX0087’dan SW’ye) tarafından desteklenmiştir.
1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
EDTA | Sigma | EDS-500g | |
FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
sodium azide | Sigma | S2002 | |
surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |