ניקוז גרורות בלוטות הלימפה מודל להערכת הדינמיקה של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן במהלך הגידול
Summary
התכנון הניסיוני המוצג כאן מספק מודל רבייה שימושי למחקרים של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן במהלך גרורות בלוטות הלימפה (LN), אשר אינו כולל את ההפרעה של תאי CD8+ T עוברי אורח.
Abstract
תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן הגידול מבלוטות לימפה מתנקזות מקבלים חשיבות מצטברת בהגברת התגובה החיסונית נגד הגידול במהלך הגידול. עם זאת, במקרים רבים, תאים סרטניים יוצרים מוקדים גרורתיים בבלוטות הלימפה לפני גרורות נוספות לאיברים מרוחקים. באיזו מידה התגובות המקומיות והשיטתיות של תאי CD8+ T הושפעו מגרורות LN נותרה מעורפלת. לשם כך, הקמנו מודל גרורות LN מורין בשילוב עם קו תאי מלנומה B16F10-GP המבטא את הניאואנטיגן החלופי הנגזר מנגיף כוריאומנינגיטיס לימפוציטית (LCMV), גליקופרוטאין (GP) ועכברים טרנסגניים P14 בעלי קולטני תאי T (TCRs) ספציפיים לפפטיד GP33-41 שמקורו ב-GP המוצג על ידי מולקולת קומפלקס היסטותאימות גדולה (MHC) מסוג I H-2Db. פרוטוקול זה מאפשר לחקור תגובות ספציפיות לתאי CD8+ T של אנטיגן במהלך גרורות LN. בפרוטוקול זה, עכברי C57BL/6J הושתלו תת עורית עם תאי B16F10-GP, ולאחר מכן העברה מאומצת עם תאי P14 נאיביים. כאשר הגידול התת עורי גדל לקוטר של כ-5 מ”מ, הגידול הראשוני נכרת, ותאי B16F10-GP הוזרקו ישירות לבלוטת הלימפה המנקזת את הגידול (TdLN). לאחר מכן, הדינמיקה של תאי CD8+ T נוטרה במהלך תהליך גרורות LN. באופן קולקטיבי, מודל זה סיפק גישה לחקור במדויק את התגובה החיסונית הספציפית לאנטיגן CD8+ T של תאי T במהלך גרורות LN.
Introduction
אימונותרפיה לסרטן, במיוחד חסימת נקודות בקרה חיסוניות (ICB), חוללה מהפכה בטיפול בסרטן1. ICB חוסם את קולטני החיסון המעכבים (כגון PD-1, Tim-3, LAG-3 ו- TIGIT), אשר באים לידי ביטוי גבוה בתאי CD8+ T מותשים במיקרו-סביבה של הגידול (TME), מה שמוביל להתחדשות של תאי CD8+ T מותשים2. בהתחשב בהטרוגניות של תאי CD8+ T מותשים, עדויות מצטברות גילו כי תאי CD8+ T ספציפיים לגידול שמקורם בפריפריה, כולל ניקוז בלוטת הלימפה (dLN), אך לא ב- TME, מתווכים את היעילות של ICB 3,4,5,6,7,8. לאחרונה, TdLN נגזר TCF-1+TOX– זיכרון ספציפי לגידול CD8+ תאי T (TdLN-TTSM) אושר להיות המגיבים המקוריים ICB אשר מגלמים מספר תכונות פונקציונליות של תאי זיכרון T קונבנציונאלי יכול להרחיב עוד יותר להתמיין לתאים מותשים צאצאים עם טיפול ICB9. בסך הכל, ממצאים אלה איששו את החשיבות של LN בהגברת חסינות נגד גידולים.
בלוטת הלימפה מתפקדת כמקום קריטי בהקלת ההכנה וההפעלה של תאי CD8+ T ספציפיים לגידול על ידי מתן בסיס מבני כמו גם אותות ביולוגיים10. מספר סוגים של תאים סרטניים זורעים לעתים קרובות בלוטת לימפה של זקיף (SLN, ה- LN הראשון המנקז גידול ראשוני) לפני הפצה שיטתית11. נוכחות גרורות SLN קשורה לתוצאות גרועות בסרטן אנושי ומודלים פרה-קליניים הראו כי תאי גידול ב- TdLN יכולים להתפשט לאיברים מרוחקים דרך כלי הלימפה וכלי הדם של הצומת 12,13,14,15. ביופסיית SLN מייצגת כעת הליך סטנדרטי המנחה החלטות טיפול עוקבות בסוגי גידולים מוצקים רבים שיכולים למנוע כריתה מיותרת של LN 16,17 בלתי מעורב. אפילו לגבי LN המעורב, זה עדיין שנוי במחלוקת אם ומתי יש צורך בכריתה כירורגית מכיוון שמספר מחקרים הוכיחו כי הסרת LN אזורי לא הציגה הישרדות כוללת משופרת בהשוואה לאלה שקיבלו קרינה או טיפול סיסטמי ללא כריתת LN אזורית 18,19. פרשנות אחת היא כי LN גרורתי (mLN) עם מחלה מיקרוסקופית עשוי לשמור על יכולת מסוימת לחנך תאים חיסוניים ולספק כמה יתרונות טיפוליים. לכן, חשוב ביותר להבהיר כיצד גרורות LN משפיעות על התגובה החיסונית נגד הגידול, במיוחד על התכונות והתפקודים של TdLN-TTSM.
עד כה, נתונים פרה-קליניים וקליניים כאחד חשפו כמה שינויים מבניים ותאיים ב-mLN20. עם זאת, השינויים הדינמיים של תאי CD8+ T ספציפיים לגידול במהלך גרורות LN לא תוארו. לכן, פיתוח מודל משכנע של גרורות LN נדרש לחקירה נוספת. ואכן, מספר מחקרים דיווחו על מודלים של עכברי mLN בדרכים שונות 14,21,22. לדוגמה, גרורות ספונטניות ב- LN בבית השחי בוצעו באמצעות השתלת תאי סרטן שד 4T1 לתוך כרית שומן החלב22. במחקר אחר, Reticker-Flynn et al. יצרו שורות תאי מלנומה עם שכיחות גבוהה של התפשטות מגידול ראשוני תת-עורי ל- LNs באמצעות חיסון סדרתי של תאי גידול בתרבית מרקמות mLN מנותקות (תשעה סבבים)14. מודל נפוץ נוסף הוכן על ידי הזרקת תאי גידול לתוך כרית כף הרגל והמוקדים הגרורתיים ייווצרו בפופליטל LN22. יש לציין כי קשה להעריך את נקודות הזמן המדויקות של ההתערבות מכיוון שגרורות LN במודלים אלה אינן תמיד נאמנות.
במחקר הנוכחי, מודל גרורתי LN מורין הוקם באמצעות הזרקה intranodal של B16F10-GP תאים23,24, שנוצר על ידי החדרה בתיווך CRISPR / Cas9 של רצף הגן גליקופרוטאין וירוס LCMV (GP) לתוך הגנום של B16F10 קותא 9. לאחר מכן, עכברים אלה הועברו עם תאי P14 אשר מכילים קולטני תאי T טרנסגניים (TCRs) לזהות באופן ספציפי את H-2Db GP33-41 אפיטופ25,26 ואת הדינמיקה המערכתית והמקומית של תאי CD8+ T ספציפיים אנטיגן במהלך גרורות LN ניתן לחקור. תכנון הניסוי שלנו מספק מודל שימושי לחקר תגובות חיסוניות, במיוחד תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן במהלך גרורות LN אשר אינו כולל את ההפרעה של תאי CD8+ T של צופה מהצד. תוצאות אלה ישפיעו על אפשרויות הטיפול הקליני האם להסיר או לשמור את ה- mLN וישפכו אור חדש על המניפולציה של mLN כדי להשיג יתרונות טיפוליים מקסימליים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך הגידול, תאים מציגי אנטיגן (APCs) בולעים אנטיגנים סרטניים ונודדים ל- TdLN שם הם ראשונים תאי CD8+ T. לאחר הפריימינג וההפעלה, תאי T CD8+ עוזבים את ה- TdLN וחודרים לגידול כדי להרוג תאי גידול10. באמצעות כריתת TdLN ומתן FTY720 אשר חוסמים את יציאת תאי החיסון מאיברי הלימפה, מספר מחקרים ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע לחוקרים צעירים מצטיינים של סין (מס ‘82122028 ל- LX), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘82173094 ל- LX), הקרן למדעי הטבע של צ’ונג צ’ינג (מס ‘2023NSCQ-BHX0087 ל- SW).
Materials
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
- Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
- Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
- Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
- Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
- Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
- Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
- Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
- Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
- Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
- Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
- Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
- du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
- An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
- Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
- Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
- Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
- Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
- North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
- Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
- Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
- Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
- Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
- Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
- Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
- Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).
