Summary

Modell der drainierenden Lymphknotenmetastasierung zur Beurteilung der Dynamik antigenspezifischer CD8+ T-Zellen während der Tumorentstehung

Published: January 26, 2024
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Summary

Das hier vorgestellte experimentelle Design bietet ein nützliches Reproduktionsmodell für die Untersuchung von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen während der Metastasierung von Lymphknoten (LN), das die Störung von CD8+ T-Zellen ausschließt.

Abstract

Tumorantigen-spezifische CD8+ T-Zellen aus drainierenden Lymphknoten gewinnen eine zunehmende Bedeutung für die Erhöhung der Anti-Tumor-Immunantwort während der Tumorentstehung. In vielen Fällen bilden Krebszellen jedoch metastasierende Loci in Lymphknoten, bevor sie weiter in entfernte Organe metastasieren. Inwieweit die lokalen und systematischen CD8+ T-Zell-Antworten durch LN-Metastasen beeinflusst wurden, bleibt unklar. Zu diesem Zweck haben wir ein murines LN-Metastasenmodell in Kombination mit einer B16F10-GP-Melanomzelllinie aufgebaut, die das Surrogat-Neoantigen exprimiert, das aus dem lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV), dem Glykoprotein (GP) und P14-transgenen Mäusen stammt, die T-Zell-Rezeptoren (TCRs) beherbergen, die spezifisch für das GP-abgeleitete Peptid GP33-41 sind, das vom Klasse-I-Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Molekül H-2Db präsentiert wird. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung antigenspezifischer CD8+ T-Zell-Antworten während der LN-Metastasierung. In diesem Protokoll wurden C57BL/6J-Mäusen subkutan B16F10-GP-Zellen implantiert, gefolgt von einem adoptiven Transfer mit naiven P14-Zellen. Als der subkutane Tumor auf einen Durchmesser von etwa 5 mm anwuchs, wurde der Primärtumor herausgeschnitten und B16F10-GP-Zellen wurden direkt in den tumordrainierenden Lymphknoten (TdLN) injiziert. Anschließend wurde die Dynamik der CD8+ T-Zellen während des Prozesses der LN-Metastasierung überwacht. Insgesamt hat dieses Modell einen Ansatz zur präzisen Untersuchung der antigenspezifischen CD8+ T-Zell-Immunantworten während der LN-Metastasierung geliefert.

Introduction

Die Krebsimmuntherapie, insbesondere die Immun-Checkpoint-Blockade (ICB), hat die Krebstherapie revolutioniert1. ICB blockiert die koinhibitorischen Immunrezeptoren (wie PD-1, Tim-3, LAG-3 und TIGIT), die in erschöpften CD8+ T-Zellen in der Tumormikroumgebung (TME) stark exprimiert werden, was zur Wiederbelebung erschöpfter CD8+ T-Zellen führt2. Unter Berücksichtigung der Heterogenität erschöpfter CD8+ T-Zellen zeigten sich häufende Beweise, dass tumorspezifische CD8+ T-Zellen, die aus der Peripherie stammen, einschließlich drainierender Lymphknoten (dLN), aber nicht in TME, die Wirksamkeit von ICBvermitteln 3,4,5,6,7,8. Kürzlich wurde bestätigt, dass TdLN-abgeleitete TCF-1+TOX-tumorspezifische Gedächtnis-CD8+-T-Zellen (TdLN-TTSM) die echten Responder auf ICB sind, die mehrere funktionelle Eigenschaften herkömmlicher Gedächtnis-T-Zellen verkörpern und sich nach der ICB-Behandlung weiter ausdehnen und zu Nachkommen differenzieren könnten9. Insgesamt bestätigten diese Ergebnisse die Bedeutung von LN für die Erhöhung der Anti-Tumor-Immunität.

Der Lymphknoten fungiert als kritischer Ort bei der Erleichterung des Primings und der Aktivierung tumorspezifischer CD8+ T-Zellen, indem er sowohl strukturelle Grundlagen als auch biologische Signale bereitstellt10. Mehrere Arten von Krebszellen säen häufig Wächterlymphknoten (SLN, das erste LN, das einen Primärtumor entwässert), bevor sie sich systematisch ausbreiten11. Das Vorhandensein von SLN-Metastasen ist mit einem schlechten Ergebnis bei menschlichem Krebs verbunden, und präklinische Modelle zeigten, dass sich Tumorzellen in TdLN sowohl über die Lymphgefäße als auch über die Blutgefäße des Knotens 12,13,14,15 auf entfernte Organe ausbreiten können. Die SLN-Biopsie stellt heute ein Standardverfahren dar, um spätere Behandlungsentscheidungen bei vielen soliden Tumorarten zu treffen, wodurch eine unnötige Resektion von unbeteiligten LN vermieden werden könnte16,17. Selbst für die betroffenen LN bleibt es umstritten, ob und wann eine chirurgische Resektion erforderlich ist, da mehrere Studien gezeigt haben, dass die Entfernung der regionalen LN kein verbessertes Gesamtüberleben im Vergleich zu denjenigen zeigte, die eine Strahlen- oder systemische Therapie ohne regionale LN-Resektion erhielten18,19. Eine Interpretation ist, dass metastasiertes LN (mLN) mit mikroskopischer Erkrankung eine gewisse Fähigkeit zur Bildung von Immunzellen behalten und einige therapeutische Vorteile bieten kann. Daher ist es von entscheidender Bedeutung zu klären, wie sich die LN-Metastasierung auf die Anti-Tumor-Immunantwort auswirkt, insbesondere auf die Eigenschaften und Funktionen von TdLN-TTSM.

Bisher haben sowohl präklinische als auch klinische Daten einige strukturelle und zelluläre Veränderungen in mLN20 gezeigt. Die dynamischen Veränderungen von tumorspezifischen CD8+ T-Zellen während der LN-Metastasierung wurden jedoch nicht beschrieben. Daher ist die Entwicklung eines überzeugenden Modells der LN-Metastasierung für weitere Untersuchungen erforderlich. In der Tat haben mehrere Studien mLN-Mausmodelle auf unterschiedliche Weise berichtet 14,21,22. Beispielsweise wurde eine spontane Metastasierung in axillären LNs durch die Implantation von 4T1-Brustkrebszellen in das Brustfettpolsterdurchgeführt 22. In einer anderen Studie erzeugten Reticker-Flynn et al. Melanomzelllinien mit hoher Inzidenz der Ausbreitung von subkutanem Primärtumor auf LNs durch serielle Inokulation von Tumorzellen, die aus dissoziierten mLN-Geweben kultiviert wurden (neun Runden)14. Ein weiteres häufig verwendetes Modell wurde durch die Injektion von Tumorzellen in den Fußballen hergestellt, und die metastatischen Loci wurden in poplitealem LN22 gebildet. Insbesondere ist es schwierig, die genauen Zeitpunkte der Intervention zu bewerten, da die LN-Metastasierung in diesen Modellen nicht immer originalgetreu ist.

In der vorliegenden Studie wurde ein murines LN-Metastasierungsmodell durch intranodale Injektion von B16F10-GP-Zellen23,24 etabliert, das durch CRISPR/Cas9-vermittelte Insertion der LCMV-Virus-Glykoprotein-Gensequenz (GP) in das Genom der B16F10-Zelllinie9 erzeugt wurde. Anschließend wurden diese Mäuse mit P14-Zellen übertragen, die transgene T-Zell-Rezeptoren (TCRs) beherbergen, die spezifisch das H-2Db GP33-41-Epitop 25,26 erkennen, und die systemische und lokale Dynamik von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen während der LN-Metastasierung konnte untersucht werden. Unser experimentelles Design bietet ein nützliches Modell für die Untersuchung von Immunantworten, insbesondere der antigenspezifischen CD8+ T-Zellen während der LN-Metastasierung, die die Störung von CD8+ T-Zellen ausschließt. Diese Ergebnisse würden sich auf die klinischen Behandlungsoptionen auswirken, ob das mLN entfernt oder beibehalten werden soll, und ein neues Licht auf die Manipulation von mLN werfen, um einen maximalen therapeutischen Nutzen zu erzielen.

Protocol

Die verwendeten C57BL/6J-Mäuse (als B6-Mäuse bezeichnet) und die naiven P14-transgenen Mäuse 9,27 waren 6-10 Wochen alt und wogen 18-22 g. Sowohl Männer als auch Frauen wurden ohne Randomisierung oder Verblindung eingeschlossen. Alle Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Qingdao Agricultural University durchgeführt. 1. Herstellung von Medium und Reagenz…

Representative Results

Das schematische Diagramm dieses Versuchsdesigns ist in Abbildung 1A dargestellt. Insgesamt wurden 5 x 105 B16F10-GP-Zellen in 100 μl PBS subkutan (s.c.) in die bilaterale Leistenregion von CD45.2 C57BL/6J-Mäusen implantiert. Nach 7 Tagen wurden diesen tumortragenden Mäusen intraperitoneal (i.p.) 4 mg CTX injiziert, gefolgt von der adoptiven Übertragung von 5 x 105 CD45.1+P14-Zellen durch intravenöse (i.v.) Schwanzinjektion. Wenn die Tumore auf einen Dur…

Discussion

Während der Tumorentstehung verschlingen antigenpräsentierende Zellen (APCs) Tumorantigene und wandern zu TdLN, wo sie CD8+ T-Zellen primen. Nach dem Priming und der Aktivierung verlassen CD8+ T-Zellen das TdLN und infiltrieren den Tumor, um Tumorzellen abzutöten10. Durch die TdLN-Resektion und die Verabreichung von FTY720, die den Austritt von Immunzellen aus den lymphatischen Organen blockieren, haben mehrere Studien die zentrale Rolle von TdLN bei der Sicherstellung der…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Science Foundation for Outstanding Young Scholars of China (Nr. 82122028 bis LX), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82173094 bis LX), der Natural Science Foundation of Chong Qing (Nr. 2023NSCQ-BHX0087 bis SW).

Materials

1.5 mL centrifuge tube KIRGEN KG2211
100 U insulin syringe BD Biosciences  320310
15 mL conical tube  BEAVER  43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)  Sigma  T48402-25G 
2-Methyl-2-butanol Sigma 240486-100ML 
70 μm nylon cell strainer BD Falcon  352350
APC anti-mouse CD45.1  BioLegend  110714 Clone:A20 
B16-GP cell line Beijing Biocytogen Co.Ltd, China Custom
BSA-V (bovine serum albumin)  Bioss bs-0292P
cell culture dish BEAVER  43701/43702/43703 
centrifuge Eppendorf 5810R-A462/5424R 
cyclophosphamide Sigma  C0768-25G 
Cyclophosphamide (CTX) Sigma PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium  Gibco  C11995500BT 
EDTA Sigma EDS-500g 
FACS tubes BD Falcon 352052
fetal bovine serum  Gibco 10270-106
flow cytometer BD FACSCanto II
hemocytometer PorLab Scientific HM330
isoflurane RWD life science  R510-22-16 
KHCO3  Sangon Biotech  A501195-0500 
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation  Life Technologies  L10199 
needle carrier  RWD Life Science  F31034-14 
NH4Cl  Sangon Biotech A501569-0500 
paraformaldehyde Beyotime P0099-500ml 
PE anti-mouse TCR Vα2 BioLegend 127808 Clone:B20.1 
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco 10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a  BioLegend 100734 Clone:53-6.7
RPMI-1640 Sigma R8758-500ML
sodium azide Sigma S2002 
surgical forceps RWD Life Science  F12005-10
surgical scissors RWD Life Science  S12003-09 
suture thread RWD Life Science F34004-30 
trypsin-EDTA Sigma T4049-100ml

References

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Zhang, Y., Su, X., Wang, L., Yue, Z., Liu, Q., Ran, L., Lei, S., Hu, J., Xu, L., Ye, L., Ji, P., Li, G., Huang, Q., Wen, S. Draining Lymph Node Metastasis Model for Assessing the Dynamics of Antigen-Specific CD8+ T Cells During Tumorigenesis. J. Vis. Exp. (203), e65646, doi:10.3791/65646 (2024).

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