نموذج استنزاف ورم خبيث في العقدة الليمفاوية لتقييم ديناميكيات الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد أثناء تكوين الورم
Summary
يوفر التصميم التجريبي المعروض هنا نموذجا تناسليا مفيدا لدراسات الخلايا التائية CD8+ الخاصة بمولد الضد أثناء ورم خبيث في العقدة الليمفاوية (LN) ، والذي يستبعد اضطراب خلايا CD8+ T المتارة.
Abstract
تكتسب الخلايا التائية CD8 + T الخاصة بمستضد الورم من تصريف الغدد الليمفاوية أهمية متراكمة في تصاعد الاستجابة المناعية المضادة للورم أثناء تكوين الأورام. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، تشكل الخلايا السرطانية مواضع نقيلية في الغدد الليمفاوية قبل أن تنتقل إلى أعضاء بعيدة. إلى أي مدى تأثرت استجابات الخلايا التائية CD8 + المحلية والمنهجية بورم خبيث LN لا يزال غامضا. تحقيقا لهذه الغاية ، أنشأنا نموذج ورم خبيث LN الفئران جنبا إلى جنب مع خط خلايا سرطان الجلد B16F10-GP الذي يعبر عن المستضد الجديد البديل المشتق من فيروس التهاب المشيمية اللمفاوي (LCMV) ، والبروتين السكري (GP) ، والفئران المعدلة وراثيا P14 التي تؤوي مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) الخاصة بالببتيد المشتق من GP GP33-41 المقدم من جزيء معقد التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الأولى (MHC) H-2Db. يتيح هذا البروتوكول دراسة استجابات الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد أثناء ورم خبيث LN. في هذا البروتوكول ، تم زرع الفئران C57BL / 6J تحت الجلد بخلايا B16F10-GP ، تليها النقل بالتبني بخلايا P14 الساذجة. عندما نما الورم تحت الجلد إلى قطر 5 مم تقريبا ، تم استئصال الورم الرئيسي ، وتم حقن خلايا B16F10-GP مباشرة في العقدة الليمفاوية التي تستنزف الورم (TdLN). بعد ذلك ، تمت مراقبة ديناميكيات الخلايا التائية CD8 + أثناء عملية ورم خبيث LN. بشكل جماعي ، قدم هذا النموذج نهجا للتحقيق بدقة في الاستجابات المناعية للخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد أثناء ورم خبيث LN.
Introduction
أحدث العلاج المناعي للسرطان ، وخاصة حصار نقاط التفتيش المناعية (ICB) ، ثورة في علاج السرطان1. يمنع ICB المستقبلات المناعية المثبطة (مثل PD-1 و Tim-3 و LAG-3 و TIGIT) ، والتي يتم التعبير عنها بشكل كبير في خلايا CD8 + T المنهكة في البيئة المكروية للورم (TME) ، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا التائية CD8 + T المنهكة2. بالنظر إلى عدم تجانس خلايا CD8 + T المستنفدة ، كشفت الأدلة المتراكمة أن خلايا CD8 + T الخاصة بالورم المشتقة من المحيط ، بما في ذلك تصريف العقدة الليمفاوية (dLN) ، ولكن ليس في TME ، تتوسط في فعالية ICB3،4،5،6،7،8. في الآونة الأخيرة ، تم تأكيد أن الخلايا التائية CD8 + T المشتقة من TdLN المشتقة من TCF-1 + TOX (TdLN-TTSM) هي المستجيبون الحقيقيون ل ICB التي تجسد العديد من الخصائص الوظيفية للخلايا التائية للذاكرة التقليدية ويمكن أن تتوسع وتتمايز إلى خلايا مستنفدة من ذرية عند علاج ICB9. إجمالا ، أكدت هذه النتائج أهمية LN في بناء مناعة مضادة للورم.
تعمل العقدة الليمفاوية كمكان حاسم في تسهيل تحضير وتنشيط خلايا CD8 + T الخاصة بالورم من خلال توفير الأساس الهيكلي وكذلك الإشارات البيولوجية10. تقوم عدة أنواع من الخلايا السرطانية في كثير من الأحيان بزرع العقدة الليمفاوية الخافرة (SLN ، أول LN يستنزف ورما أوليا) قبل النشر المنهجي11. يرتبط وجود ورم خبيث SLN بنتائج سيئة في سرطان الإنسان وأظهرت النماذج قبل السريرية أن الخلايا السرطانية في TdLN يمكن أن تنتشر إلى أعضاء بعيدة من خلال كل من الأوعية اللمفاوية والأوعية الدموية للعقدة12،13،14،15. تمثل خزعة SLN الآن إجراء قياسيا لتوجيه قرارات العلاج اللاحقة في العديد من أنواع الأورام الصلبة التي يمكن أن تتجنب الاستئصال غير الضروري ل LN16,17 غير المتورط. حتى بالنسبة إلى LN المعنية ، لا يزال من المثير للجدل ما إذا كانت هناك حاجة إلى الاستئصال الجراحي ومتى حيث أظهرت العديد من الدراسات أن إزالة LN الإقليمية لم تظهر تحسنا في البقاء على قيد الحياة بشكل عام مقارنة بأولئك الذين تلقوا العلاج الإشعاعي أو الجهازي دون استئصال LN الإقليمي18,19. أحد التفسيرات هو أن LN النقيلي (mLN) المصاب بمرض مجهري قد يحتفظ ببعض القدرة على تثقيف الخلايا المناعية وتوفير بعض الفوائد العلاجية. لذلك ، من المهم للغاية توضيح كيفية تأثير ورم خبيث LN على الاستجابة المناعية المضادة للورم ، وخاصة خصائص ووظائف TdLN-TTSM.
حتى الآن ، كشفت كل من البيانات قبل السريرية والسريرية عن بعض التغييرات الهيكلية والخلوية في mLN20. ومع ذلك ، لم يتم تحديد التغييرات الديناميكية لخلايا CD8 + T الخاصة بالورم أثناء ورم خبيث LN. لذلك ، هناك حاجة إلى تطوير نموذج مقنع لورم خبيث LN لمزيد من التحقيق. في الواقع ، أبلغت العديد من الدراسات عن نماذج ماوس mLN بطرق مختلفة14،21،22. على سبيل المثال ، تم إجراء ورم خبيث عفوي في LNs الإبطية من خلال زرع خلايا سرطان الثدي 4T1 في وسادة الدهون الثديية22. في دراسة أخرى ، قام Reticker-Flynn et al. بتوليد خطوط خلايا سرطان الجلد مع ارتفاع معدل الانتشار من الورم الأولي تحت الجلد إلى LNs من خلال التلقيح التسلسلي للخلايا السرطانية المزروعة من أنسجة mLN المنفصلة (تسع جولات) 14. تم إعداد نموذج آخر شائع الاستخدام عن طريق حقن الخلايا السرطانية في وسادة القدم وسيتم تشكيل المواضع النقيلي في LN22 المأبضي. والجدير بالذكر أنه من الصعب تقييم النقاط الزمنية الدقيقة للتدخل لأن ورم خبيث LN في هذه النماذج ليس دائما مخلصا.
في هذه الدراسة ، تم إنشاء نموذج نقيلي LN للفأر من خلال الحقن داخل العقد لخلايا B16F10-GP23,24 ، الناتجة عن الإدخال بوساطة CRISPR / Cas9 لتسلسل جين البروتين السكري لفيروس LCMV (GP) في جينوم خط خلية B16F109. بعد ذلك ، تم نقل هذه الفئران بخلايا P14 التي تؤوي مستقبلات الخلايا التائية المعدلة وراثيا (TCRs) على وجه التحديد على H-2Db GP33-41 25,26 ويمكن التحقيق في الديناميات النظامية والمحلية لخلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد أثناء ورم خبيث LN. يوفر تصميمنا التجريبي نموذجا مفيدا لدراسة الاستجابات المناعية ، وخاصة الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد أثناء ورم خبيث LN والذي يستبعد اضطراب خلايا CD8 + T المتارة. ستؤثر هذه النتائج على خيارات العلاج السريري حول إزالة mLN أو الاحتفاظ به وإلقاء ضوء جديد على التلاعب ب mLN لتحقيق أقصى قدر من الفوائد العلاجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
أثناء تكوين الورم ، تبتلع الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) مستضدات الورم وتهاجر إلى TdLN حيث تقوم بتجهيز خلايا CD8 + T. بعد التحضير والتنشيط ، تترك خلايا CD8 + T TdLN وتتسلل إلى الورم لقتل الخلايا السرطانية10. من خلال استئصال TdLN وإدارة FTY720 التي تمنع خروج الخلايا المناعية من الأعض?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم للعلماء الشباب المتميزين في الصين (رقم 82122028 إلى LX) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82173094 إلى LX) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغ تشينغ (رقم 2023NSCQ-BHX0087 إلى SW).
Materials
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
- Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
- Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
- Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
- Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
- Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
- Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
- Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
- Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
- Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
- Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
- Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
- du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
- An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
- Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
- Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
- Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
- Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
- North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
- Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
- Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
- Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
- Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
- Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
- Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
- Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).
