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Biology

Un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para el aislamiento de núcleos individuales de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación de núcleos únicos

Published: July 28, 2023
doi:
10.3791/65611
, , , ,
1Roche Pharma Research and Early Development, Pharmaceutical Sciences,Roche Innovation Centre Basel

Summary

El estudio describe un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para aislar núcleos de alta calidad de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación posterior de ARN de núcleos individuales.

Abstract

La secuenciación de ARN de una sola célula y de un solo núcleo se han convertido en aplicaciones comunes de laboratorio debido a la gran cantidad de información transcriptómica que proporcionan. La secuenciación de ARN de un solo núcleo, en particular, es útil para investigar la expresión génica en tejidos difíciles de disociar. Además, este enfoque también es compatible con el material congelado (de archivo). Aquí, describimos un protocolo para aislar núcleos individuales de alta calidad de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación posterior de ARN de un solo núcleo de manera parcialmente automatizada utilizando instrumentos y reactivos disponibles comercialmente. En concreto, se utiliza un disociador robótico para automatizar y estandarizar la homogeneización de los tejidos, seguido de un gradiente químico optimizado para filtrar los núcleos. Por último, contamos de forma precisa y automática los núcleos mediante un contador automatizado de células fluorescentes. El rendimiento de este protocolo se demuestra en el cerebro de ratón, el riñón de rata y el tejido hepático y del bazo de cynomolgus. Este protocolo es sencillo, rápido y fácilmente adaptable a varios tejidos de mamíferos sin necesidad de una optimización extensa y proporciona núcleos de buena calidad para la secuenciación posterior de ARN de núcleos individuales.

Introduction

La secuenciación de ARN de una sola célula (sc) y de un solo núcleo (sn) se ha convertido en protocolos de uso común en biología molecular y celular debido a la mayor resolución de la expresión génica en comparación con la secuenciación masiva de ARN. Sin embargo, el aislamiento de preparaciones de buena calidad de células individuales y núcleos individuales de tejidos sólidos sigue siendo un desafío y, a menudo, es el paso limitante de la velocidad en los experimentos sc/sn-RNAseq. De hecho, se ha desarrollado una gran cantidad de protocolos que utilizan diversos procedimientos químicos y mecánicos para obtener suspensiones de células/núcleos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Además, las estrategias para limpiar dichas preparaciones de escombros/grumos, etc., van desde la clasificación por flujo hasta la filtración y el lavado. Estos protocolos suelen ser manuales (lo que da lugar a variabilidad relacionada con el usuario), pueden llevar mucho tiempo (lo que reduce la viabilidad de la célula/núcleo) y/o pueden requerir el acceso a un citómetro de flujo para la clasificación de células/núcleos. Este estudio se centró en el desarrollo de un protocolo de aislamiento de núcleos únicos simple, rápido y parcialmente automatizado a partir de tejidos de mamíferos congelados para aplicaciones posteriores de secuenciación de ARN. Nos centramos específicamente en el aislamiento de núcleos en lugar del aislamiento celular, ya que es compatible con el uso de tejidos congelados, lo que hace que la recolección/procesamiento de muestras sea más práctica y permite el procesamiento por lotes imparcial de muestras, especialmente en experimentos de curso temporal. Además, aunque el transcriptoma nuclear no refleja completamente el transcriptoma celular, varios estudios han demostrado que los datos de secuenciación de ARN de un solo núcleo son comparables a los datos de secuenciación de ARN de una sola célula para la identificación del tipo de célula, aunque las proporciones de los tipos de células pueden variar 6,16,17,18,19.

El aislamiento de núcleos consta de varios pasos: 1) interrupción mecánica o química del tejido para liberar los núcleos, 2) limpieza de escombros y grumos, y 3) recuento preciso de núcleos para su preparación para aplicaciones posteriores. En varios protocolos, el paso 1 implica con frecuencia el uso de un homogeneizador Dounce para alterar el tejido 3,20. Alternativamente, se pueden utilizar métodos químicos, aunque a menudo deben optimizarse para diferentes tejidos 2,5,6. Hemos experimentado que un procedimiento manual de disrupción tisular es propenso a la variabilidad asociada al operador, lo que conduce a una calidad y rendimiento variables de los núcleos. Con el fin de minimizar la variabilidad técnica y tener un protocolo más consistente y reproducible que funcione en todos los tejidos, se desarrolló un protocolo que utiliza un disociador tisular robótico disponible comercialmente21. Para el paso 2, aunque el intercambio de tampones suele ser el medio más simple para lavar los núcleos, adoptamos el uso de un paso de centrifugación en gradiente de sacarosa relativamente corto para tener una eliminación más completa de los desechos. Para el tejido cerebral específicamente, utilizamos un gradiente coloide de sílice en lugar de un gradiente de sacarosa para una eliminación de mielina más efectiva. Finalmente, para el recuento, el uso de un hemocitómetro es el estándar de oro para contar e inspeccionar visualmente los núcleos. En nuestro protocolo, este paso puede automatizarse de forma fiable utilizando un contador de células fluorescentes automatizado disponible en el mercado22. Este protocolo ha sido probado y es compatible con varios tejidos congelados de mamíferos, incluidos el cerebro, el riñón, el bazo y el hígado, de diferentes especies de mamíferos (ratas, ratones y primates no humanos) y proporciona núcleos de buena calidad para la secuenciación posterior de ARN de núcleos individuales con una plataforma comercial basada en gotas. El protocolo tarda aproximadamente 75 minutos desde la preparación del tejido hasta el inicio del flujo de trabajo de secuenciación de ARN de núcleo único.

Protocol

Todos los estudios con animales se llevaron a cabo con la aprobación de la autoridad veterinaria cantonal de Basilea-Ciudad en estricto cumplimiento de las regulaciones federales suizas sobre protección animal o con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de conformidad con la Ley de Bienestar Animal alemana. 1. Preparación de tejidos y reactivos/instrumentos Limpieza y preparación del instrumentalLimpie las mesas de trabajo y las pinzas con una solución de descontaminación de etanol y RNasa al 70%. Enfriar previamente las centrífugas a 4 °C. Enfriar previamente los cartuchos de aislamiento de núcleos en la nevera a 4 °C durante al menos 30 min. Inicie el disociador robótico y encienda el enfriamiento configurando el control deslizante en la parte superior derecha de la pantalla para que se enfríe y haciendo clic en él para comenzar a enfriar para que el control deslizante aparezca naranja. Compruebe que el frasco de reactivo de almacenamiento de núcleos (NSR) adjunto y el frasco de tampón de aislamiento de núcleos (NIB) tengan suficiente líquido y estén bien enfriados. Prepare una caja de espuma de poliestireno llena de hielo seco y enfríe previamente las placas de Petri y las hojas de bisturí sobre hielo seco. Preparación del tampónPrepare la solución de almohadilla de sacarosa (SCS) de 1,5 M como se muestra en la Tabla 1. Distribuya el SCS en alícuotas de 500 μL en tubos de DNasa/RNasa de 2 ml para obtener cuatro alícuotas de SCS de 500 μl por muestra. Mantenga las alícuotas en hielo hasta su nuevo uso. En caso de procesar tejido cerebral, prepare en su lugar una solución coloidal de sílice al 18% como se describe en la Tabla 2, diluyendo la solución madre coloidal de sílice en NSR y agregando un inhibidor de ARNasa. Prepare 3 ml de solución coloidal de sílice al 18% por muestra y manténgala en hielo. 2. Homogeneización de tejidos y aislamiento de núcleos Retire la muestra del congelador a -80 °C y colóquela inmediatamente sobre hielo seco. Corte la muestra en una placa de Petri preenfriada o en una placa de metal sobre hielo seco con un bisturí preenfriado en un trozo de 15-50 mg (si aún no tiene el tamaño correcto). Asegúrese de cortar la muestra en la dirección correcta para que la muestra siga siendo representativa de las estructuras de los órganos de interés.NOTA: Con este protocolo, 15-50 mg es el tamaño óptimo de la muestra para la extracción nuclear. Para lograr un buen rendimiento después de la limpieza, se recomienda un tamaño de muestra de al menos 25 mg. Para muestras más pequeñas, hay disponibles cartuchos especiales que están optimizados para procesar entradas pequeñas con el disociador robótico. Se emplearon cartuchos de aislamiento de núcleos de entrada pequeños para disociar muestras de tejido que pesaban tan solo 4 mg con un rendimiento suficiente para la secuenciación posterior de ARN de núcleos individuales. En la Tabla 3 se muestra un ejemplo de rendimiento de núcleos utilizando el cartucho de baja entrada de tejido hepático de rata. Retire el cartucho de aislamiento de núcleos del refrigerador, desembáquelo, retire el molinillo y pipetee 15 μL de inhibidor de RNasa (40 U/μL) en el fondo del cartucho.NOTA: Durante la extracción de núcleos, el disociador robótico agregará NIB y NSR al cartucho hasta un volumen total de 3 ml (con el protocolo de extracción de núcleos de bajo volumen). Al añadir 15 μL de inhibidor de la ARNasa (40 U/μL) al cartucho antes de la extracción, la suspensión tendrá la concentración deseada de inhibidor de la ARNasa de 0,2 U/μL. Coloque la muestra de tejido en el fondo del cartucho con unas pinzas. No coloque la muestra exactamente en el centro del cartucho para tener una eficiencia de interrupción óptima. Seleccione Ejecutar un protocolo en el instrumento y haga clic en la opción Núcleos en la esquina superior izquierda.En el menú, seleccione el protocolo Low Volume Nuclei Isolation y verifique que la velocidad de interrupción esté configurada en rápida haciendo clic en Modificar. Cargue el cartucho en el instrumento abriendo la puerta y deslizando hacia afuera de la platina levantando la perilla roja. Inserte el cartucho en la ubicación designada, gire el bloqueo del cartucho y deslícelo en la platina hasta que la perilla roja encaje en su lugar. Cierre la puerta e inicie la extracción de núcleos en el instrumento haciendo clic en Siguiente. La carrera dura aproximadamente 7 min. Una vez finalizada la carrera, retire el cartucho del instrumento levantando la perilla roja y tirando de la platina. Coloque inmediatamente el cartucho en hielo. Para todos los tejidos, excepto el cerebro, continúe con el paso 3.1. Para muestras de cerebro, proceda directamente al paso 3.2. 3. Limpieza de núcleos Limpieza del gradiente de sacarosaNOTA: Para el tejido cerebral, omita este paso y vaya directamente al paso 3.2. Todos los pasos de limpieza se realizan en hielo para minimizar la degradación del ARN. Los tampones y tubos, así como las centrífugas, deben enfriarse previamente. Todos los pasos de resuspensión y mezcla se realizan únicamente mediante un pipeteo cuidadoso, ya que el vórtice podría comprometer la calidad e integridad de los núcleos.Perfore con cuidado la lámina redonda del cartucho disociador con una punta de pipeta.NOTA: Después de la disociación, la suspensión de núcleos resultante tiene un volumen aproximado de 2 mL. Para facilitar la limpieza del gradiente de sacarosa, divida la suspensión de núcleos en dos alícuotas de 900 μL, lo que da como resultado un volumen total de 1,8 ml de suspensión de núcleos que se utiliza durante la limpieza. Retire la primera alícuota de 900 μL de la suspensión de núcleos del cartucho y agréguela a una alícuota SCS de 500 μL previamente preparada en un tubo de 2 mL. Mezclar bien pipeteando hasta que la mezcla sea homogénea. Retire los 1400 μL de la mezcla de suspensión de núcleos – SCS y colóquelos con cuidado en una nueva alícuota SCS de 500 μL sosteniendo el tubo en ángulo y agregando la mezcla gota a gota, creando una separación de fases claramente visible (consulte la Figura 1A). Cierre con cuidado el tubo y vuelva a colocarlo en hielo sin alterar la separación de fases. Repita los pasos 3.1.2 a 3.1.4 con la segunda alícuota de suspensión de 900 μl y una nueva alícuota SCS para tener dos tubos de 2 ml por muestra con una separación de fases claramente visible para la centrifugación en gradiente. Añadir con cuidado los tubos a una centrífuga preenfriada y centrifugar a 13.000 x g durante 15 min a 4 °C. Mientras tanto, prepare la NSR descrita en la Tabla 4, añadiendo el inhibidor de la RNasa a una alícuota de NSR. Prepare 1 ml de NSR por muestra.NOTA: En este punto, las perlas de gel de reactivo de expresión génica de una sola célula se pueden retirar del congelador a -80 °C, lo que les permite equilibrarse a temperatura ambiente (RT), y el oligonucleótido del interruptor de plantilla se puede resuspender en un tampón de TE bajo. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante de ambos tubos sin alterar el gránulo y vuelva a suspender cuidadosamente el gránulo en 50 μL de NSR helado según las recomendaciones del fabricante. Agrupe los dos gránulos de la misma muestra en un nuevo tubo de 1,5 ml y agregue 900 μl de NSR helado a un volumen total de 1 ml. Mezclar bien pipeteando. Centrifugar la muestra a 500 x g durante 5 min a 4 °C con una centrífuga de rotor de cubo oscilante.NOTA: Se recomienda encarecidamente utilizar un rotor de cubeta oscilante para minimizar la pérdida de núcleos, especialmente cuando se espera que el rendimiento de los núcleos sea bajo o cuando se comienza con pequeñas cantidades de tejido. Mientras tanto, prepare 500 μL por muestra de 1x PBS (sin Ca2+ y Mg2+) con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,04% y 0,2 U/μL de inhibidor de la ARNasa como se describe en la Tabla 5. Retire con cuidado el sobrenadante sin desechar el gránulo y vuelva a suspender el gránulo en 100 μL de solución de PBS como se preparó anteriormente (1x PBS + 0,04% BSA + inhibidor de RNasa a 0,2 U/μL).NOTA: Para muestras de tejido pequeñas, la concentración de núcleos puede ser baja y, por lo tanto, se recomienda resuspender el gránulo en solo 50 μL de solución de PBS para garantizar concentraciones suficientemente altas para la secuenciación de ARN de núcleos individuales. Continúe directamente con el paso 4. Limpieza de gradiente coloidal de síliceNOTA: Para el tejido cerebral, un gradiente coloide de sílice es más adecuado que un gradiente de sacarosa para eliminar la mielina y los desechos de la suspensión de núcleos. Todos los pasos de limpieza se realizan en hielo para minimizar la degradación del ARN. Los tampones y tubos, así como las centrífugas, deben enfriarse previamente. Todos los pasos de resuspensión y mezcla se realizan únicamente mediante un pipeteo cuidadoso, ya que el vórtice podría comprometer la calidad e integridad de los núcleos.Perfore con cuidado la lámina redonda del cartucho disociador con una punta de pipeta. Retire la suspensión de núcleos del cartucho y agréguela a un tubo de 5 ml. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C en una centrífuga preenfriada. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el gránulo y vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de solución coloidal de sílice al 18% helada. Agregue 2 ml adicionales de solución coloidal de sílice al 18% para tener un volumen total de 3 ml y mezcle bien pipeteando. Centrifugar la muestra a 700 x g durante 5 min a 4 °C en un rotor de cubo basculante con el freno activado. Mientras tanto, prepare la NSR descrita en la Tabla 4 añadiendo el inhibidor de la RNasa a una alícuota de NSR. Prepare 1 ml de NSR por muestra.NOTA: En este punto, las perlas de gel de reactivo de expresión génica de una sola célula se pueden retirar del congelador a -80 °C, lo que permite que se equilibren a RT y el oligonucleótido del interruptor de plantilla se puede resuspender en un tampón de TE bajo. Retire con cuidado la muestra de la centrífuga sin alterar la capa de mielina que flota en la parte superior. Primero, retire la capa de mielina de la parte superior y deséchela; Luego, retire con cuidado todo el sobrenadante sin alterar el gránulo.NOTA: La capa de mielina se puede eliminar fácilmente envolviendo una toallita estéril sin pelusa alrededor de una punta de pipeta de 1 ml para aspirar la capa de mielina junto con 1-2 ml del sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de NSR helado según las recomendaciones del fabricante. Centrifugar la muestra a 500 x g durante 5 min a 4 °C en una centrífuga con rotor de cubo oscilante.NOTA: Se recomienda encarecidamente utilizar un rotor de cubeta oscilante para minimizar la pérdida de núcleos, especialmente cuando se espera que el rendimiento de los núcleos sea bajo o cuando se comienza con pequeñas cantidades de tejido. Mientras tanto, prepare 500 μL por muestra de 1x PBS (sin Ca2+ y Mg2+) con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,04% y 0,2 U/μL de inhibidor de la ARNasa como se describe en la Tabla 5. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el gránulo y vuelva a suspender la muestra en 100 μL de solución de PBS como se preparó anteriormente (1x PBS + 0,04% BSA + inhibidor de RNasa a 0,2 U/μL).NOTA: Para muestras de tejido pequeñas, la concentración de núcleos puede ser baja y, por lo tanto, se recomienda resuspender el gránulo en solo 50 μL de solución de PBS para garantizar concentraciones suficientemente altas para la secuenciación de ARN de núcleos individuales. 4. Conteo Para cada muestra a contar, diluir 10 μL de suspensión de núcleos en 20 μL de solución de PBS para obtener una dilución 1:3. Para el recuento, agregue 25 μL de solución de tinción de yoduro de propidio (PI) a un pocillo de mezcla de la placa de conteo de contador fluorescente. Añadir 25 μL de la suspensión de núcleos diluidos y mezclar bien mediante pipeteo. Transfiera la muestra teñida de 50 μL desde el pocillo de mezcla al pocillo de carga. Cargue la placa de conteo en el contador de celdas e inicie el conteo.NOTA: El recuento de núcleos se toma del canal fluorescente rojo con un tiempo de exposición de 700 ms. Este canal se optimizó para obtener un recuento preciso de núcleos mediante la comparación cruzada con el recuento manual con una cámara de Neubauer y tinción con azul de tripano bajo el microscopio. A altas concentraciones, los núcleos están muy juntos, lo que dificulta que el software los separe. En este caso, se recomienda volver a contar la muestra en una dilución adecuada. La integridad de los núcleos, así como la limpieza, se pueden evaluar a partir de la imagen de campo claro o bajo un microscopio. Diluir las muestras con PBS (1x PBS + 0,04% BSA + inhibidor de RNasa a 0,2 U/μL) hasta la concentración deseada para la secuenciación de ARN de un solo núcleo.NOTA: Las concentraciones entre 700 y 1.200 núcleos/μL se consideran óptimas para la secuenciación de ARN de un solo núcleo. Las concentraciones celulares más bajas, como 700 núcleos/μL, pueden dar lugar a una reducción de la contaminación de fondo del ARN ambiental. 5. Preparación de la biblioteca Realice la secuenciación de ARN de un solo núcleo con los reactivos de expresión génica de una sola célula utilizando el protocolo del fabricante con el objetivo de una recuperación de núcleos de 8000-10.000 núcleos por muestra. 6. Secuenciación Secuenciar las bibliotecas con la profundidad de secuenciación deseada con indexación dual de extremo emparejado y las siguientes lecturas de secuenciación: Lectura 1: 28 ciclos, Índice i7: 10 ciclos, Índice i5: 10 ciclos y Lectura 2: 90 ciclos.

Representative Results

El rendimiento y la versatilidad de este protocolo se demuestran mediante la secuenciación de ARN de núcleos individuales en tejido fresco congelado de la corteza occipital cerebral de tres ratones B6, tejido renal fresco congelado cortado transversalmente de tres ratas Wistar, tejido de archivo (11 años) de hígado y bazo de tres macacos Cynomolgus de Mauricio. Todos los animales no fueron perfundidos. Como se muestra en las Figuras 1B, C, se obtuvieron núcleos de buena calidad que estaban libres de signos de desprendimiento, escombros y aglomeración. La filtración basada en gradiente de sacarosa se optimizó para eliminar la mayoría de los desechos mediante la prueba de diferentes densidades, velocidades de giro y tiempos, y la evaluación de la pureza/integridad nuclear bajo un microscopio, así como la evaluación de la distribución del tamaño y el rendimiento de los núcleos (Figura 1D). Esto nos permitió elegir una densidad de gradiente de sacarosa de 1,5 M y utilizar un tiempo de centrifugado corto de 15 min. A continuación, para evaluar aún más la calidad de los núcleos, los datos se preprocesaron con 10X Cell Ranger y se realizó un análisis posterior de los datos con Besca23. Se filtraron los núcleos con un contenido mitocondrial del >5% (ya que tienden a ser núcleos dañados/estresados) y se conservaron los núcleos con 500-7.000 genes (para minimizar las gotas vacías y los múltiples). Solo incluimos genes que estaban presentes en al menos 30 núcleos. Nos centramos en 8.000 núcleos por muestra de corteza cerebral y 10.000 núcleos por muestra de riñón, hígado y bazo. Después de la filtración, se obtuvieron 10.644 núcleos de alta calidad de las tres muestras de cerebro, 14.960 núcleos de alta calidad de las tres muestras de riñón, 18.795 núcleos de alta calidad de las tres muestras de hígado y 13.882 núcleos de alta calidad de las tres muestras de bazo. Las figuras 2A, D, G, J muestran gráficos de violín que representan la distribución de los recuentos de IMU, los recuentos de genes y el contenido mitocondrial en cada muestra. La mediana del número de recuentos en todas las muestras de cerebro fue de 7.563 UMI/núcleo y 3.208 genes/núcleo. La mediana del número de recuentos en todas las muestras de riñón fue de 3.841 UMI/núcleo y 1.915 genes/núcleo. La mediana del número de recuentos en todas las muestras de hígado fue de 2.649 UMI/núcleo y 1.676 genes/núcleo. La mediana del número de recuentos en todas las muestras de bazo fue de 1.609 UMI/núcleo y 1.138 genes/núcleo. A continuación, generamos conglomerados utilizando genes muy variables y los anotamos utilizando genes marcadores conocidos 17,24,25,26. Como se ve en la Figura 2B, E, H, K, pudimos identificar los tipos de células esperados de cada tejido. Además, como se ve en la Figura 2B, E, H, K, todos los animales contribuyeron a todos los conglomerados, lo que indica una baja variabilidad técnica general introducida por el protocolo. Además, las proporciones celulares fueron comparables en las tres muestras por tipo de tejido, al igual que el UMI y los recuentos de genes (Figura 2A, C, D, F, G, I, J, L). Una excepción notable es el hígado, donde las poblaciones de hepatocitos entre las tres muestras de hígado fueron diferentes en proporciones y perfil. Lo más probable es que esto se deba a diferencias biológicas entre los animales (sexo, edad, estado metabólico). Figura 1: Evaluación de la calidad de los núcleos y optimización del gradiente de sacarosa. (A) La separación de fases esperada durante la centrifugación en gradiente de sacarosa se muestra con una flecha. (B) Imágenes fluorescentes representativas de núcleos de riñón de rata teñidos con yoduro de propidio (arriba) y bazo de cynomolgus (abajo) obtenidos con el protocolo. (C) Imágenes representativas de microscopía de campo claro de núcleos aislados del hígado de ratón (arriba) y del cerebro de ratón (abajo), barra de escala de 500 μm. Obsérvese la superficie lisa regular de los núcleos, lo que indica una buena calidad nuclear. (D) Optimización del gradiente de sacarosa. Se probaron varias densidades de sacarosa, velocidades de centrifugado y tiempos de centrifugado. Se muestran imágenes de microscopía de campo claro de los núcleos, la distribución del tamaño de los núcleos y el rendimiento de los núcleos para cada condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Datos representativos de snRNAseq en la corteza occipital del cerebro del ratón, el riñón de rata (corteza y médula) y el hígado y el bazo del macaco cynomolgus. (A) Gráficos de violín que muestran la distribución de genes/núcleo, UMI/núcleo y porcentaje de contenido mitocondrial por muestra de cerebro. (B) Panel izquierdo: Gráfico UMAP que muestra la contribución de cada muestra a los grupos identificados en el cerebro. Panel derecho: UMAP que muestra las identidades de los grupos anotados en función de los genes marcadores en el tejido cerebral. (C) Proporciones celulares observadas en las 3 muestras de cerebro. (D) Gráficos de violín que muestran la distribución de genes/núcleo, UMIs/núcleo y porcentaje de contenido mitocondrial por muestra de riñón. (E) Panel izquierdo: Gráfico UMAP que muestra la contribución de cada muestra a los conglomerados identificados en el riñón. Panel derecho: UMAP que muestra las identidades de los grupos anotados en función de los genes marcadores en el tejido renal. (F) Proporciones celulares observadas en las 3 muestras de riñón. (G) Gráficos de violín que muestran la distribución de genes/núcleo, UMI/núcleo y porcentaje de contenido mitocondrial por muestra de hígado. (H) Panel izquierdo: gráfico UMAP que muestra la contribución de cada muestra a los conglomerados identificados en el hígado. Panel derecho: UMAP que muestra las identidades de los grupos anotados en función de los genes marcadores en el tejido hepático. (I) Proporciones celulares observadas en las 3 muestras hepáticas. (J) Gráficos de violín que muestran la distribución de genes/núcleo, UMIs/núcleo y porcentaje de contenido mitocondrial por muestra de bazo. (K) Panel izquierdo: Gráfico UMAP que muestra la contribución de cada muestra a los conglomerados identificados en el bazo. Panel derecho: UMAP que muestra las identidades de los grupos anotados en función de los genes marcadores en el tejido del bazo. (L) Proporciones celulares observadas en las 3 muestras de bazo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Componentes Concentración de existencias Volumen por muestra Concentración final Solución de almohadilla de sacarosa 2 M 1500 μL 1,5 M Tampón de cojín de sacarosa – 500 μL – Ditiotreitol (TDT) 1 M 2 μL 1 mM Inhibidor de la ARNasa 40 U/μL 10 μL 0,2 U/μL Tabla 1: Preparación de la solución de almohadilla de sacarosa (SCS) 1,5 M. Esta solución se utiliza para la centrifugación en gradiente de sacarosa durante la limpieza en el paso 3.1 y debe prepararse cada vez antes de iniciar el protocolo. Mantenga siempre el SCS en hielo durante el protocolo. Las soluciones mencionadas en esta tabla están referenciadas en la Tabla de Materiales. Componentes Concentración de existencias Volumen por muestra Concentración final Solución madre coloidal de sílice 90% 600 μL 18% Reactivo de almacenamiento de núcleos (S2 Genomics) – 2400 μL – Inhibidor de la ARNasa 40 U/μL 15 μL 0,2 U/μL Tabla 2: Preparación de una solución coloidal de sílice al 18%. Esta solución se utiliza para la centrifugación en gradiente coloidal de sílice durante la limpieza en el paso 3.2 y debe prepararse cada vez antes de iniciar el protocolo. Mantenga siempre la solución coloidal de sílice al 18% en hielo durante el protocolo. Tejido Peso de la muestra Cartucho Rendimiento Hígado de rata 25 mg Cartucho de aislamiento de núcleos 65.000 núcleos por mg de tejido Hígado de rata 4 mg Cartucho de aislamiento de núcleos de entrada pequeños 32.000 núcleos por mg de tejido Tabla 3: Rendimiento de los núcleos del cartucho de aislamiento de núcleos de baja entrada frente al cartucho de aislamiento de núcleos después de la limpieza del gradiente de sacarosa. Componentes Concentración de existencias Volumen por muestra Concentración final Reactivo de almacenamiento de núcleos – 1000 μL – Inhibidor de la ARNasa 40 U/μL 5 μL 0,2 U/μL Tabla 4: Preparación del reactivo de almacenamiento de núcleos (NSR). Esta solución se utiliza durante el aislamiento de núcleos en los pasos 3-5, así como durante la limpieza en el paso 3.1.8. Se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 4 meses. Prepare una alícuota fresca con inhibidor de ARNasa durante la etapa de centrifugación en la etapa de limpieza 6. Las soluciones mencionadas en esta tabla están referenciadas en la Tabla de Materiales. 1x solución madre de PBS + 0,04% BSA Componentes Concentración de existencias Volumen de existencias Concentración final PBS (sin Ca 2+, sin Mg2+) 1 vez 30 mL – Albúmina sérica bovina (BSA) 30% 40 μL 0.04% 1x PBS + 0,04% BSA + 0,2 U/μL de inhibidor de ARNasa Componentes Concentración de existencias Volumen por muestra Concentración final 1x PBS + 0.04% BSA Solución Stock – 500 μL – Inhibidor de la ARNasa 40 U/μL 2,5 μL 0,2 U/μL Tabla 5: Preparación de PBS + 0.04% BSA. Esta solución se utiliza al final de la limpieza en el paso 3.1.10 y después del recuento para diluir la suspensión de núcleos a la concentración deseada para la secuenciación de ARN de núcleos individuales 10X (paso de recuento 4.4). La solución madre puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 mes. Prepare una alícuota fresca con inhibidor de ARNasa durante la etapa de centrifugación en la etapa de limpieza 6.

Discussion

Hemos desarrollado un protocolo versátil y parcialmente automatizado para obtener núcleos individuales de alta calidad a partir de tejidos congelados de mamíferos y hemos demostrado el protocolo en el cerebro de ratón, el riñón de rata y el tejido hepático y del bazo de Cynomolgus.

Al comparar el rendimiento de este protocolo con el de otros protocolos publicados para la secuenciación de ARN de un solo núcleo en cerebro, riñón, bazo y tejido hepático 6,7,20,24,25,26, observamos que somos capaces de detectar un número similar de genes y recuentos de UMI por núcleo y somos capaces de recuperar los tipos celulares esperados. En comparación con los métodos existentes, este protocolo tiene varias ventajas. En primer lugar, el protocolo de este estudio automatiza la homogeneización de tejidos y el aislamiento de núcleos individuales. Esto se logra con el uso de un disruptor tisular robótico21. En la mayoría de los protocolos, el tejido se homogeneiza con un homogeneizador Dounce para liberar núcleos individuales 3,20. Sin embargo, hemos notado que este paso manual puede conducir a una variabilidad experimental en el rendimiento y la integridad de los núcleos dependiendo de la cantidad de fuerza ejercida durante la homogeneización, comprometiendo la reproducibilidad de los experimentos. Aquí, mediante el uso de una trituradora de tejidos automatizada con ajustes fijos, se obtuvo una buena calidad de los núcleos y un rendimiento con mayor consistencia en todos los experimentos. Además, la automatización de este paso también reduce el tiempo de práctica del protocolo (el paso de disrupción tisular dura aproximadamente 7 minutos), lo que permite al usuario prepararse para los pasos posteriores. En segundo lugar, el protocolo descrito en este estudio es versátil, es decir, es compatible con diferentes tejidos de diferentes especies. Esto nos permite evitar la optimización prolongada del protocolo, por ejemplo, para identificar tampones/detergentes de homogeneización para diferentes tejidos 2,5,6. En tercer lugar, este protocolo no depende del acceso a un clasificador de flujo para obtener núcleos limpios, lo que lo hace más accesible para los laboratorios que no cuentan con el equipo/experiencia necesarios para la clasificación de flujo. En su lugar, optimizamos la filtración basada en gradiente de sacarosa para eliminar la mayor parte de los residuos. Sin embargo, para el tejido cerebral en particular, se recomienda el uso de un gradiente coloidal de sílice en lugar de un gradiente de sacarosa para una eliminación más eficiente de la mielina. También hemos encontrado que el uso de un rotor de cubo oscilante al final de la etapa de centrifugación en gradiente coloidal de sacarosa/sílice minimiza la pérdida de núcleos. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente el uso de un rotor de este tipo. En cuarto lugar, después de probar múltiples métodos para contar núcleos (conteo manual bajo el microscopio, uso de varios contadores automatizados), se recomienda el uso de un contador automatizado de células fluorescentes22. El uso de un colorante intercalante de ADN, como el yoduro de propidio, aumenta la precisión del recuento de núcleos. En quinto lugar, este protocolo tarda unos 75 minutos desde el inicio hasta la carga del chip microfluídico. Esto ayuda a garantizar que la integridad de los núcleos permanezca alta cuando se procesan varias muestras. Por último, hemos comprobado que el protocolo también es compatible con el tejido incluido en el compuesto de temperatura óptima de corte (OCT). Si se utiliza este material, el tejido se puede extraer del bloque OCT con un bisturí antes de la homogeneización.

Un desafío frecuente en los conjuntos de datos de secuenciación de ARN de un solo núcleo es la presencia de ARN ambiental, que puede ser no nuclear (por ejemplo, mitocondrial), así como derivado nuclear27,28. En nuestro protocolo, el ARN mitocondrial (un sustituto del ARN ambiental no nuclear) es bajo incluso antes del filtrado (0,1-1,6% para los tejidos mostrados). Sin embargo, al igual que otros protocolos y conjuntos de datos, la contaminación ambiental por ARN de genes altamente expresados en los núcleos de abundantes tipos celulares (como hepatocitos en el hígado, neuronas en el cerebro, etc.) todavía está presente27. Existen varias herramientas bioinformáticas, como CellBender, SoupX, etc., que pueden eliminar dicha contaminación ambiental por ARN antes de la anotación de los núcleos 29,30,31. Otra limitación de este protocolo es que, aunque los pasos de disrupción tisular y aislamiento de núcleos están automatizados, el rendimiento de este paso sigue siendo limitado, ya que solo se puede procesar una muestra a la vez. Sin embargo, dado que este paso solo toma aproximadamente 7 minutos por pieza de tejido, aún se pueden procesar varias muestras en un lote. Por lo general, procesamos cuatro muestras por lote, pero hemos hecho hasta seis muestras por lote con buenos resultados. Las recientes mejoras en el disociador robótico para permitir el procesamiento paralelo de dos muestras simultáneamente permitirán el procesamiento de 8-12 muestras por lote, lo que es compatible con el rendimiento del chip microfluídico que se utiliza para la encapsulación de núcleos individuales.

Aunque no hemos utilizado los núcleos aislados por este protocolo para otras aplicaciones posteriores como ATAC-seq o snRNAseq utilizando otras plataformas, basándonos en la calidad de los datos obtenidos con los reactivos de expresión génica utilizados aquí, creemos que nuestro protocolo debería ser compatible con aplicaciones posteriores adicionales. Sin embargo, el trabajo futuro implicará probar este protocolo con otras aplicaciones posteriores, como ATAC-seq.

En conclusión, hemos desarrollado un protocolo de aislamiento de núcleos rápido, sencillo y parcialmente automatizado para la secuenciación posterior de ARN de un solo núcleo que ha demostrado ser compatible con diferentes tipos de tejidos congelados de mamíferos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Filip Bochner, Marion Richardson, Petra Staeuble y Matthias Selhausen por proporcionar los tejidos animales que se analizaron en este manuscrito. También nos gustaría agradecer a Petra Schwalie, Klas Hatje, Roland Schmucki y Martin Ebeling por su apoyo en bioinformática.

Materials

1 M DTT Thermo Fisher Scientific P2325
10% Tween 20 Bio-Rad 1662404
10x Magnetic Separator 10x genomics PN-120250
10x Vortex Adapter 10x genomics PN-120251
1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190144 stored at 4°C
30% Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9576_50ML
400 mM Tris-HCl, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15568025
40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher Scientific 10777019 Stored at -20 °C
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626
Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience CELMXSYSF2 Automated fluorescent cell counter
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns 10x genomics PN-1000127 Single cell gene expression reagent, stored at room temperature
Chromium Next GEM Secondary Holder 10x genomics PN-1000195
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns 10x genomics PN-1000129 Single cell gene expression reagent, stored at -80 °C
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns 10x genomics PN-1000128 Single cell gene expression reagent
Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns 10x genomics PN-1000158 Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C
Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns 10x genomics PN-1000130 Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C
Divided Polystyrene Reservoirs VWR 41428-958
DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf Sigma-Aldrich EP0030108051
DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf Sigma-Aldrich EP0030108078
Dry ice – –
Dynabeads MyOne SILANE 10x genomics PN-2000048 Single cell gene expression reagent, stored at 4 °C
Ethanol Pure Sigma-Aldrich E7023
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) Ricca Chemical Company 3290-16
Heatblock
High-Throughput Nexcelom Counting Plates Nexcelom Bioscience CHM24-A100-001 Cell counter counting plate
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) Thermo Fisher Scientific 12090015
Mini Centrifuge – –
NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles) Illumina 2002840
Nuclei Isolation Buffer S2 Genomics 100-063-396 Stored at 4 °C
Nuclei Isolation Cartridge S2 Genomics 100-063-287 Precooled at 4 °C before use
Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution Sigma-Aldrich NUC201-1KT Sucrose cushion solution 
Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer Sigma-Aldrich NUC201-1KT
Nuclei Storage Reagent S2 Genomics 100-063-405 Stored at 4 °C
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips Eppendorf 30124359
Percoll GE Healthcare 17-0891-02 Silica colloid solution
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
Qiagen Buffer EB Qiagen 19086
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R) Eppendorf  5805000010
Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R) Eppendorf  5811000015
RNAseZap Ambion AM9780 RNAse decontamination solution
Round cell culture petri dish SPL 330005
Scalpel disposable Aesculap AG BA210 pre-cooled on dry ice before use
Single Index Kit T Set A, 96 rxns 10x genomics PN-1000213 Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C
Singulator 100 System S2 Genomics – Commercially available robotic tissue dissociator
Sodium Hydroxide 1M Sigma-Aldrich 72068
SPRIselect Reagent Kit Beckman Coulter b23318
Sterile tweezers – –
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientific 10977049
ViaStain PI Staining Solution Nexcelom Bioscience CS1-0109-5mL Propidium iodide staining solution
Vortex Mixer+A2:D44 VWR –
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References

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Stalder, L., Koechl, F., Hahn, K., Sultan, M., Prasad, M. K. A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing. J. Vis. Exp. (197), e65611, doi:10.3791/65611 (2023).
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