硬質または軟質基板上に垂直に配向したカーボンナノファイバーアレイを使用して、生体分子および色素を植物に送達
Summary
ここでは、垂直に配向したカーボンナノファイバー(VACNF)を微細加工し、VACNFをフレキシブル基板に転写し、硬質および軟質基板上のVACNFを植物に塗布して生体分子と色素を送達する方法について説明します。
Abstract
生体分子や不浸透性色素を無傷の植物に送達することは、大きな課題です。ナノマテリアルは、DNAを植物に送達するための新進気鋭のツールです。これらの新しいツールはエキサイティングですが、まだ広く適用されていません。硬質基板(バッキング)上に作製されたナノ材料は、湾曲した植物構造にうまく適用することが特に困難です。本研究では、垂直に配向したカーボンナノファイバーアレイを微細加工し、硬質基板から軟質基板に転写するプロセスについて述べる。これらの繊維(硬質または軟質基質上)を、植物への一過性形質転換または色素(フルオレセインなど)の送達にどのように使用できるかを詳述し、実証します。VACNFを硬質シリコン基板からフレキシブルSU-8エポキシ基板に転写して、フレキシブルVACNFアレイを形成する方法を示します。SU-8の疎水性を克服するために、可撓性フィルム中の繊維を薄い酸化ケイ素層(2〜3nm)でコーティングした。これらの繊維を湾曲した植物器官に送達するために、VACNFフィルムの繊維側に1μLの色素またはDNA溶液の液滴を付着させ、10分間待ってから、フィルムを植物器官に置き、転がる動きのある綿棒を使用して繊維を植物細胞に打ち込みます。この手法により、曲面を有する植物器官への色素・DNA送達を実現しました。
Introduction
植物の形質転換(一過性および安定的の両方)は、すべての植物組織および種において、まだ広く達成可能にはなっていない。植物の一過性形質転換とは、プラスミドにコードされた遺伝子が一時的に植物に導入されるが、ゲノムに安定的に取り込まれないプロセスです。プロトプラストの粒子衝撃、アグロバクテリア、エレクトロポレーション、またはポリエチレングリコール処理を使用する従来の方法は、時間がかかり、面倒な場合があります。さらに、それらはすべての植物種に適用できるわけではありません1,2,3,4。DNA送達のためのナノマテリアルの使用は、まだ初期段階にある急成長中の分野です5。ナノ材料、特にカーボンナノファイバーは、創傷反応を引き起こすことなく、タンパク質、デキストラン、染料を植物の葉に送達するためにも成功しています6。この研究の目標は、ナノ材料の一種であるカーボンナノファイバーを使用して、生体分子または色素を植物に送達するための詳細なプロトコルを提供することです。ここでは、さまざまな植物器官における細胞の一過性形質転換を可能にする生体分子としてDNAに着目します。
以前、Morganらは、硬質シリコン基板にカーボンナノファイバーを貼り付けて、レタス、N. benthamiana、ポプラの葉、およびシロイヌナズナの葉と根の両方を一過性に変化させることを実証しました。形質転換はさまざまな器官で成功しましたが、根や果実などの曲面を持つ植物組織に繊維を適用することはより困難でした。私たちは、ナノファイバーの柔軟な裏打ちが、臓器の形状によりよく適合することで、ナノファイバーの送達効率を向上させる可能性があると推論しました。
本稿では、垂直に配向したカーボンナノファイバーの作製と設計、VACNFのフレキシブル基板への転写、硬質基板と軟質基板の両方にVACNFを植物に塗布して生体分子と色素を送達する方法について詳述する。炭素ナノファイバーは、Ni触媒を用いた直流触媒プラズマ化学気相成長法(dc C-PECVD)を用いて作製した。Ni触媒ドットの位置、直径、高さは、Melechkoらによって記述されているように、電子ビームリソグラフィー、金属蒸着、およびリフトオフプロセスの組み合わせを使用して制御されました8,9。2層電子ビームレジストを用いることで、より厚いNi触媒を基板上に堆積させ、より長い繊維10を得ることができる。硬質基板からフレキシブル基板への繊維転写は、Fletcherら11に記載の方法の修正に基づいており、現在の方法は、非晶質炭素層または犠牲フォトレジスト層の使用を控えている。繊維転写によるSU-8のリフトオフは、SU-812,13,14のアンダーベークと露出不足から生じる固有の引張応力を利用することによって達成されます。複合ポリマーであるSU-8は、自然に疎水性であるため、DNA送達を促進するための使用は困難です。SU-8の疎水性を打ち消すために、SU-8に繊維を埋め込んだ後、原子層堆積15を介して酸化ケイ素の薄層を塗布します。生体分子/色素送達のための硬質基板上の繊維の適用は、Davern et al.6 で説明されているピンセットタッピングの衝撃力と、Morgan et al.7 で説明されているオンプラントおよびオンチップ法を利用します。柔軟なVACNFフィルムは、Morganらのオンチップ法7と同様に、まずフィルム上のDNAまたは色素の液滴を半乾燥させ、次に小さなメイクアップアプリケーターを使用して湾曲した植物表面にフィルムを転がすことによって、湾曲した植物表面に適用されます16,17。図1は、硬質および軟質基質の繊維を植物に適用するためのさまざまなアプローチを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、カーボンナノファイバーアレイを垂直に配列し、その繊維をフレキシブル基板に転写し、硬質または軟質の基板にファイバーを植物に塗布し、生体分子や色素を植物に送達する方法を紹介しました。導入した材料を堆積させるには、オンチップ法とオンプラント法の2つの一般的なアプローチを説明し、VACNF膜を用いたオンチップ法だけでなく、硬質基板上に繊維を作製することに成功した結果を示しました。これらの繊維の応用は、従来の植物形質転換法(粒子衝撃、PEGまたはエレクトロポレーションによるプロトプラスト形質転換)よりも実践的にも理論的にも単純であり、アグロバクテリウムを介した形質転換に抵抗性のある植物に使用できます。ただし、変換されるセルはごくわずかです。
垂直に配向したカーボンナノファイバーは、オークリッジ国立研究所ナノフェーズ材料科学センターのユーザープログラムを通じて製造されました。利用者は、VACNFの製造のためにこの施設の使用を申請することができます。あるいは、VACNFチップは、炭素源22,23を備えた直流プラズマ強化化学気相成長装置を備えたクリーンルームで製造することができます。説明されている方法では、繊維の製造、繊維の転写、およびVACNFチップ/フィルムの応用に不可欠ないくつかのステップがあります。繊維の塗布が機能するためには、植物細胞への送達を成功させるためには、繊維がまっすぐで先端の先細り直径が<200 nmでなければなりません6,7(図3)。特定のサイズとピッチのカーボンナノファイバーを作成するために、ドットサイズ、横方向のピッチ、触媒の堆積量など、さまざまなパラメータを変更することができます。カーボンナノファイバーの製造に使用する最適なドットサイズを選択するために、さまざまなドットサイズからファイバーを成長させました(図5を参照)。直径300 nmのファイバーが最適であることがわかったため、このドットサイズを選択しました(図5)。適切なパラメータを見つけた後、理想的な形状(ストレート、チップ径50%のチップを使用することを検討しました。ファイバーの形状を確認するために、走査型電子顕微鏡を使用して、VACNFチップ/フィルムのサンプル上のランダムな視野を画像化しました。
さらに、繊維は植物細胞内で送達するために一定の最小長を持っている必要があります。異なる長さの繊維を製造することの重要性は、より長い繊維を使用してより深い組織層に浸透できることです。より長い繊維(長さ>40μm)は、繊維が根元から繊維を切断することによって繊維転写が機能し、繊維の上にSU-8を層状にする必要があるため、柔軟なフィルムに不可欠です。このプロトコルに使用されるSU-8層の作業厚さは20〜35μmです。様々な植物(湾曲または平ら)の表皮内で送達を達成するために必要な最小の高さは10〜15μmである6,7。そのため、VACNF膜には>40μmの長さの繊維が必要となる。カーボンナノファイバーを製造する際には、触媒材料、触媒形状、触媒材料の厚さ、PECVDチャンバー内の条件(ガス比、圧力、温度、電流、シャワーヘッドの高さ、成長時間)など、いくつかの異なるパラメータを考慮する必要があります8,9,24,25。Morganら7とDavernら6が用いた25μm以上の炭素ナノファイバーを製造するために、Ni触媒の量を増やし、アセチレンとアンモニアの比率を変化させ、電流と成長時間を長くしました。さらに、触媒材料の形状にも注意を払いました。背の高い直線繊維を製造するためには、堆積した触媒が火山のような形状ではなく、ホッケーパックの形状である必要がありました(図4)。火山構造は、リフトオフ後のフォトレジストの残骸から発生します。火山の形成を防ぐために、PMMAの二重層が電子ビームリソグラフィー26中にアンダーカットを作成するために使用されました。アンダーカットは、堆積した金属触媒のリフトオフを助けます(図2)。触媒の厚い層は、背の高いVACNFの成長に重要です。VACNFの形態はMerkulova et al.24によって調べられている。VACNFの垂直方向の配向は、Ni触媒チップ型の成長と、基板に垂直な直流電位の配向の両方によるものです(図6)。シャワーヘッドは、PECVD反応器(図6)の形状を記述し、電界27の電位の源として機能する。
電子線リソグラフィーで触媒ドットの配列を確定するために、電子線レジスト(ポリメチルメタクリレート)を塗布し、電子ビームを用いてレジストに特定の形状とウェーハ上の特定の位置に小さな穴を開けました。所望の直径の穴を規定の間隔(ピッチ)で規則的なグリッド上に配置し、所望のパターンを指定したファイルを電子ビームリソグラフィー装置にロードしてから、基板をマシンにロードしました。繊維の高さに加えて、繊維の転写を成功させるためのもう一つの重要なパラメータは、アセトン浴で費やされる時間です。VACNFフィルムは、エッジがカールし始めるまでアセトン浴に長時間放置する必要があります。アセトン浴に放置する時間が短すぎると、チップが浮き上がりにくくなり、破損する可能性があります。チップが古ければ古いほど、アセトン浴に長くとどまらなければなりません。アセトン浴に続いて、フィルム/チップをイソプロパノールと水に入れて、アクセスアセトンを除去し、繊維上の保護フォトレジストを除去しました。
スピンコートを行うには、スピンコーター内の真空チャックにウェーハまたはウェーハ片を配置し、スピンコーターのテスト機能を使用してウェーハの中心位置を確認します。小さな水たまり(直径~2.5cm)のレジストをウェーハの中心に塗布し、紡糸(3000rpm×45秒)するスピンコート前後の繊維の画像は、繊維形状(高さ、配向、ピッチ)の保存を示す図8に示されている。繊維が存在すると、繊維の根元にレジストが湧き上がり、予想以上に厚い層になります。VACNF成長後のスピンコーティングは、他のグループによって研究されています11,18。
このプロセスのもう一つのステップで非常に重要なのは、VACNFチップ/フィルムに適切な量の力が加えられるようにすることです。送達機構は、ピンセットの衝撃力によって細胞壁に小さな穿刺を行う繊維に依存している6,7、または柔軟な基板上でミニメイクアップアプリケーターで転がる。繊維は、結果に影響を与えることなく、植物細胞に分解されて埋め込まれたままになる場合とそうでない場合があります6,7が、適切な圧力を得るためには、色素の取り込みと組織損傷の検査と併せて練習する必要があります。さらに、検出可能な発現までの時間は植物種や送達されるベクターの種類によって異なるため、VACNFチップ/フィルムを用いたDNA導入後の適切なイメージング時点を選択することが重要です7(図16)。
この方法は植物に広く適用できますが、いくつかの制限があります。例えば、VACNF膜に酸化ケイ素の薄層を添加しても、SU-8の上にフォトレジストの保護層が追加されるため、必ずしも完全に親水性になるとは限りません。この問題が現実のものとなった場合、VACNFにはより厚い酸化ケイ素の層を施すことができます。フィルムが疎水性か親水性かをテストするには、フィルムを水に入れることができます。フィルムが沈むと親水性になり、浮くと疎水性になります。さらに、生産される繊維のバッチ間にばらつきがある可能性があります。dc-PECVDマシンで繊維を成長させるときに変更できるいくつかのパラメータがあります。このプロトコルで記述されているものは、2つの異なる量のNi触媒のパラメータのセットです。さらに、Ni触媒の結晶方位は制御できず28 、分岐は必然的に繊維に生じる。
この論文では、硬質基質と軟質基質の両方を使用して、フルオレセイン色素とDNAを植物細胞に送達することを実証しましたが、この方法は、他の生体分子や遺伝子組み換えアプローチ、たとえば、安定したトランスジェニック株を産生するのに何年もかかるリンゴやその他の果物などの植物系のRNAiサイレンシングに広く適用できるはずです。さらに、これらの繊維は、遺伝子編集材料の送達や植物の安定した形質転換にも使用できます。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ナノファイバーアレイは、エネルギー省科学局のユーザー施設であるナノフェーズ材料科学センターで作製されました(提案ID:CNMS2019-103およびCNMS2022-A-1182)。CNMSからの支援は、査読付きプロポーザルシステムを通じて授与され、成果を公表する予定の合格者には無償で提供されます(http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml)。ナノファイバーアレイの製造に協力してくれたKevin Lester氏とCNMSに感謝します。実験計画法について批判的な議論をしてくれたJohn Caughmen博士、Timothy McKnight博士、Amber Webb博士、Daryl Briggs博士、Travis Bee氏に感謝します。PECVD装置の回路図を提供してくださったAdam Rondinone博士に感謝します。科学的なイラストを描いてくれたレスリー・キャロルに感謝します。この研究は、米国エネルギー省、科学・生物・環境研究局、DE-SC0019104、および米国農務省のバイオイメージング科学プログラム(2021-67013-34835)から資金提供を受けました。JMMは、米国農務省:国立食糧農業研究所:農業および食品研究イニシアチブ博士課程前フェローシップ2021-67034-35167の支援を受けました。
Materials
| 13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct | Fastenal | 690535 | |
| 2-Propanol (IPA) | Fischer Scientific | A451-4 | |
| 4" Lid | Entegris | H22-401-0615 | Wafer Carriers |
| 4" tray | Entegris | H22-40-0615 | Wafer Carriers |
| Accretech SS10 dicing saw | Accreteck | SS10 | |
| Acetone | Fischer Scientific | A18-4 | |
| Acetone used in the cleanroom at ORNL | JT Baker | 9005-05 | |
| Apples | Grocery store | No product number | |
| Arabidopsis thaliana | Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago | No product number | |
| Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine | Oak Ridge National Laboratory | Custom-built | |
| Cobham Green lettuce | Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis | No product number | Butterhead lettuce |
| Fluorescein dye | Sigma Aldrich | F2456-2.5G | |
| Gel-box | Gel-Pak | AD-23C-00-X4 | |
| Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool | Heidelberg | DWL 66 | |
| ImageJ | National Institues of Health | No product number | |
| Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL | Doe and Ingalls | CMOS Grade 9079-05 | |
| JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system | JEOL | 8100 | |
| Kimwipes | Kimtech | Kimberly-Clark Professional 34120 | |
| Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish | VWR | 11019-554 | |
| Layout Editor | juspertor GmbH | No product number | |
| LSM 710 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| LSM 800 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| Make-up applicator | Amazon | G2PLUS | 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS |
| Merlin field emission scanning electron microscope | Zeiss | Merlin | |
| MIBK/IPA (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) | Microchem | M089025 | |
| Onions | Grocery store | No product number | |
| Oxford FlexAl atomic layer deposition | Oxford | FlexAl | |
| PMMA 495 A4 | Microchem | M130004 | |
| PMMA 950 A4 | Microchem | M230004 | Can dilute down to A2 |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Amazon | KS-6304-21-11 | Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc |
| Precision tweezers | Aven Inc. | 18032TT | |
| pUBQ10:YFP-GW | Arabidopsis Biological Resource Center | CD3-1948 | |
| Silicon etcher (used for descum) | Oxford | Plasmalab | |
| Silicon rubber kit | Smooth-On Inc | Ecoflex 00-20 | |
| Silicon wafers | Pure Wafer | 4N0.001-.005SSP-INV | |
| Spin coater | Brewer Sciences | Model 100CB | |
| SPR 955cm 0.7 | Megaposit | 10018314 | |
| Strawberries | Grocery store | No product number | |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 Series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 2000 Series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Suss MicroTec contact aligner | Suss MicroTec | MA6/BA6 | |
| Table top microscope | Phenom XL | used for checking Ni catalysts after metal deposition | |
| Thermionics VE-240 e-beam evaporator | Thermionics | VE-240 |
References
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