Utilizzo di array di nanofibre di carbonio allineati verticalmente su substrati rigidi o flessibili per la somministrazione di biomolecole e coloranti alle piante

Il netto vantaggio dei chip VACNF su substrati rigidi o flessibili è la capacità di fornire biomolecole o coloranti in punti specifici di una pianta (Figura 1). In questo caso, abbiamo utilizzato le letture della fluorescenza per valutare l’erogazione. Utilizzando diverse piante, substrati e metodi di somministrazione (su chip o su pianta), possono esserci differenze nei tempi di comparsa della fluoresceina colorante. Per determinare se i chip/film VACNF funzionano per la consegna, un approccio rapido consiste nell’utilizzare le fibre per la somministrazione del colorante (Figura 9). Le immagini etichettate con tempi diversi nella Figura 9 sono campi visivi diversi dagli stessi campioni. Quando si utilizza il metodo su pianta, il colorante fluoresceina può essere osservato immediatamente dopo il parto utilizzando la microscopia a fluorescenza. Inoltre, se lo stesso campo visivo viene ripreso nel tempo dopo aver somministrato il colorante fluoresceina a una pianta, l’intensità del segnale diventa meno luminosa nel tempo (Figura 10). Il colorante fluoresceina potrebbe potenzialmente spostarsi dal campo visivo ad altre aree della foglia attraverso i plasmodesmi20,21. Rispetto al metodo on-plant, nel metodo on-chip con fibre sul substrato rigido, il colorante si muove più lentamente in tutta l’area impalata (Figura 9). Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che il colorante si stacca dalle fibre/si reidrata nelle cellule e quindi impiega più tempo per muoversi. Le fibre nel substrato flessibile erano adatte per la somministrazione di colorante a superfici curve come fragole e mele (Figura 11 e Figura 12). Utilizzando un substrato flessibile con fragole, è stato osservato subito un forte segnale di fluoresceina (Figura 11), mentre ci sono volute 2 ore per vedere un forte segnale di fluoresceina nelle mele (Figura 12B,D). Il successo della somministrazione di plasmidi che codificano marcatori fluorescenti può essere determinato utilizzando la microscopia a fluorescenza per trovare il segnale risultante (Figura 12F, Figura 13 e Figura 14). I controlli sono necessari per determinare se la pianta scelta non ha un’autofluorescenza simile al marcatore fluorescente che vogliamo fornire dalle fibre. L’uso delle sole fibre è utile per determinare se la forza d’impatto applicata con le pinzette provoca danni al tessuto vegetale o se la fluorescenza osservata all’interno del campione è dovuta ai VACNF, che sono intrinsecamente fluorescenti a causa del loro strato di nitruro di silicio18 (Figura 13C-D). Le fibre impalate nel tessuto vegetale non inducono la risposta della ferita come valutato dalla produzione diH 2 O2 6. Infine, utilizzando il controllo di +DNA, -Fibers è necessario per confermare che il DNA non sta entrando nella pianta attraverso il solo tapping e conferma che le fibre sono necessarie per la consegna nelle cellule vegetali (Figura 13E-F). Non dovrebbero esserci differenze distinte quando si utilizzano i metodi di somministrazione on-plant o on-chip utilizzando i VACNF su un substrato rigido, come indicato dalla mancanza di differenze significative nei valori di fluorescenza (Figura 13I). L’utilizzo di pellicole flessibili VACNF con rilascio di DNA su chip ha portato a una trasformazione transitoria di successo delle cellule epidermiche in mele e cipolle acquistate in negozio (Figura 12F e Figura 14). Gli esperimenti falliti possono avere fibre rotte in diversi campi visivi, ma non ci sarà alcun segnale di fluorescenza risultante dal tentativo di fornire DNA plasmidico o colorante. Se viene applicata troppa pressione alla pianta, ci sarà un evidente danno tissutale (Figura 15). Questo danno meccanico può apparire come piccoli fori o aree trasparenti nella pianta, come se uno strato di cellule fosse stato rimosso quando si guarda la pianta al microscopio. A volte saranno visibili le impronte del chip. Un esperimento in cui l’espressione di proteine fluorescenti non viene rilevata dopo la consegna del DNA può anche essere dovuto all’uso di DNA di bassa qualità, quindi può essere utile preparare DNA fresco. Figura 1: Schema della somministrazione di coloranti/DNA ai tessuti vegetali utilizzando fibre su substrati rigidi e flessibili. (A) Somministrazione di coloranti/DNA mediati da fibre su piante. Una gocciolina da 1 μL di soluzione colorante/DNA viene posizionata sulla superficie di una foglia e il chip VACNF viene posizionato sopra la gocciolina. Usando un paio di pinzette, il chip viene delicatamente picchiettato nel tessuto. Il substrato rigido viene rimosso lasciando nanofibre all’interno del tessuto. (B) Rilascio di DNA mediato da fibre su chip. Una goccia di 1 μL di colorante o soluzione di DNA viene colata a goccia sul chip VACNF ed essiccata per 15 minuti. Il chip con il DNA semiessiccato viene posizionato sopra la superficie fogliare e picchiettato nel tessuto come nel pannello A. (C) Consegna del DNA su pellicola SU-8 su chip. Le fibre vengono trasferite dal substrato di silicio rigido al supporto flessibile SU-8. Una gocciolina da 1 μL di soluzione di colorante/DNA viene gettata a goccia sul film VACNF ed essiccata per 10 minuti. La pellicola VACNF con il colorante/DNA semiessiccato viene quindi arrotolata su una superficie vegetale curva utilizzando un applicatore per il trucco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Flusso di lavoro per la realizzazione di array di nanofibre di carbonio allineati verticalmente. Per produrre VACNF, un doppio strato di polimetilmetacrilato (PMMA 495 A4 seguito da PMMA 950 A2) viene rivestito in spin su un wafer di silicio. La litografia a fascio di elettroni viene utilizzata per definire una matrice di punti di 300 nm di diametro. Il resist viene quindi sviluppato in metilisobutilico-chetone/isopropanolo (MIBK/IPA), 1:3 per 1,5 min. Utilizzando un evaporatore metallico, uno strato adesivo di Ti (10 nm) viene applicato al wafer, seguito da uno strato di Ni (130 nm o 150 nm). Il resist rimanente viene quindi rimosso tramite lift-off (sonicazione del bagno in acetone). La geometria dei punti catalizzatori viene ispezionata tramite SEM. Se i catalizzatori assomigliano a dischi da hockey e sono piatti, vengono inseriti nella macchina per la deposizione chimica da vapore potenziata al plasma (PECVD) e le fibre vengono coltivate. Le fibre sono state quindi ispezionate con SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Immagini SEM di nanofibre di carbonio ideali allineate verticalmente . (A) Micrografia elettronica di VACNF con un passo di ~35 μm e un’altezza di 10-15 μm, ripresa con un angolo di 30°. Questa immagine è duplicata nella Figura 7C. (B) Micrografia elettronica di VNCF con passo di ~20 μm e altezza di 20-30 μm, e ripresa con un angolo di 30°. (C) Micrografia elettronica di VANCF con passo di ~35 μm, altezza 50-60 μm e ripresa con un angolo di 30°. (D) Micrografia elettronica della punta VACNF con diametro <200 nm. C'è una variazione nei diametri della punta della fibra (150-300 nm). Poiché le fibre sono state visualizzate con un angolo di 30°, le altezze sembrano essere inferiori all'altezza effettiva di un fattore di sin(30°)=1/2. I pannelli A e B sono stati ristampati con il permesso di Morgan et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Immagini SEM della geometria del catalizzatore prima della crescita dei VACNF. (A) Immagine SEM del catalizzatore dopo il decollo. Si noti che il fotoresist è presente intorno al bordo del catalizzatore, risultando in una forma vulcanica. (B,C) Le immagini SEM mostrano le forme del vulcano del catalizzatore dopo l’utilizzo di un PMMA a strato singolo. (D) Forma desiderata del catalizzatore del disco da hockey realizzato con doppi strati di PMMA. Poiché le fibre sono state visualizzate con un angolo di 30° nei pannelli A, B e D, le altezze sembrano essere inferiori all’altezza effettiva di un fattore di sin(30°) = 1/2. Le barre della scala rappresentano 100 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Effetto della dimensione del punto del catalizzatore sulla crescita delle fibre: per stabilire il diametro ottimale del materiale del catalizzatore, le fibre sono state coltivate da dimensioni del punto comprese tra 200 e 600 nm. Le dimensioni dei punti che vanno da 400 a 600 nm hanno portato alla deumidificazione del catalizzatore e alla crescita di più fibre. La migliore geometria della fibra è stata prodotta da un diametro di 300 nm. I punti più piccoli portavano a un’altezza della fibra insufficiente. A causa del fatto che le fibre sono state fotografate con un angolo di 30°, le altezze sembrano essere inferiori all’altezza effettiva di un fattore di sin(30°) = 1/2. Le immagini sono state scattate utilizzando la micrografia elettronica a scansione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Illustrazione schematica del sistema di deposizione chimica da vapore potenziato da corrente continua – plasma (dc-PECVD) utilizzato presso l’Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Il sistema personalizzato all’ORNL ha un grande soffione che funge da reattore per i gas di alimentazione e l’uscita per il plasma. Il soffione è stato mantenuto a un potenziale CC di 300 V rispetto alla fase riscaldata per il substrato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Flusso di lavoro per il trasferimento di fibre da un substrato rigido a un substrato flessibile. Dopo la sintesi e l’ispezione delle nanofibre, ogni wafer viene rivestito in spin con SU-8 2015 a 4000 giri/min per 45 secondi. Il wafer viene poi cotto per 3 minuti a 95 °C. Quindi il wafer viene esposto alla luce UV e modellato in un allineatore di maschere a 95 mJ/cm2. Dopo la postcottura per 6 minuti a 95 °C, il wafer viene sviluppato nel rivelatore SU-8 per 15 secondi, risciacquato con alcool isopropilico e asciugato con gas N2 . Uno strato protettivo di SPR 955 CM 0,7 viene rivestito in centrifuga sul wafer a 3000 giri/min e cotto a 90 °C per 30 secondi. Uno strato di ossido di silicio (2-3 nm) viene quindi aggiunto al wafer tramite deposizione di strato atomico (ALD) (22 cicli a 100 °C) per rendere il substrato flessibile idrofilo15. Il wafer viene quindi tagliato a cubetti in quadrati di 3 mm x 3 mm con una sega per cubetti. Al momento dell’uso, i singoli trucioli vengono posti nell’acetone fino a quando SU-8 inizia ad arricciarsi e diventa concavo (>30 min). A questo punto, lo strato SU-8 sulla maggior parte dei chip può essere afferrato sul bordo con pinzette affilate e staccato dal substrato di silicio sottostante come una pellicola quadrata intatta di 3 mm. Il film viene quindi lavato successivamente in alcool isopropilico e acqua per 5 minuti ciascuno e utilizzato immediatamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8: Immagini SEM del trasferimento di fibre da un substrato rigido a un substrato flessibile. Le immagini mostrate sono rappresentative ma provengono da campioni diversi. (A) Fibre lunghe dopo la crescita di PECVD (stessa immagine della Figura 2C). (B,C) Fibre dopo l’applicazione di SU-8. La resina epossidica sgorga intorno alla base delle fibre. La lunghezza della fibra esposta variava da 5 μm a 30 μm. (D) Le fibre incorporate nel Su-8 dopo il decollo hanno mantenuto la loro geometria. A causa del fatto che le fibre sono state visualizzate con un angolo di 30°, le altezze sembrano essere inferiori all’altezza effettiva di un fattore di sin(30°)=1/2. Il pannello A è stato ristampato con il permesso di Morgan et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 9: Somministrazione di colorante alle foglie di Arabidopsis utilizzando metodi on-chip e on-plant con fibre su substrati rigidi. (A-P) Le immagini sono state acquisite utilizzando la microscopia confocale. Metodo su chip (A-H): 1 μL di colorante fluoresceina da 10 μM è stato essiccato per 15 minuti su chip VACNF, quindi i chip sono stati picchiettati sul lato abassiale delle foglie di Arabidopsis con una pinzetta. (A-D) Foglie fotografate entro 5-15 minuti dalla consegna. (E-H) Lascia l’immagine 1 ora dopo il parto. (A, E) + Tintura, + Fibre. Controlli: (B,F) -Colorante, -Fibre; (C,G) -Colorante, + Fibre; (D,H) + Tintura, -Fibre. (I-P) Metodo sulla pianta: 1 μL di colorante fluoresceina da 10 μM è stato posizionato sulla superficie della pianta, i trucioli sono stati posizionati in modo tale che entrassero in contatto con la gocciolina e sono state utilizzate pinzette per picchiettare il chip sul lato abassiale delle foglie di Arabidopsis. (I-L) ripreso entro 5-15 minuti dopo il parto e (M-P) ripreso 1 ora dopo il parto. (I,M) +Colorante, +Fibre. Controlli: (J,N) -Colorante, -Fibre; (K,O) -Colorante, +Fibre; (L,P) + Tintura, -Fibre. I pannelli A-P sono immagini planari singole da z-stack. Le barre della scala sono di 20 μm. Le fibre hanno un passo di 35 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 10: Andamento temporale della somministrazione del colorante in Arabidopsis tramite metodo on-plant con substrato rigido. Le immagini sono state acquisite utilizzando la microscopia confocale. Utilizzando il metodo on-plant, una gocciolina da 1 μL di soluzione colorante fluoresceina (10 μM) è stata posizionata sulla superficie di una foglia e il chip VACNF è stato posizionato sopra la gocciolina. Usando un paio di pinzette, il chip è stato delicatamente picchiettato sul tessuto. +Dye, +Fibers immagini della stessa area sono state acquisite ogni 5 minuti. Le barre della scala sono di 20 μm. Le fibre hanno un passo di 35 μm. I pannelli sono immagini planari singole da z-stack. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 11: Somministrazione del colorante alla frutta fragola utilizzando pellicole VACNF. (A-H) Le immagini sono state acquisite utilizzando la microscopia confocale. Utilizzando il metodo on-chip, le goccioline di colorante sono state essiccate su pellicole VACNF, che sono state poi fatte rotolare sulle superfici dei frutti utilizzando un applicatore per il trucco. Il colorante fluoresceina (10 μM) è stato somministrato alle cellule di fragola e sottoposto a imaging dopo (A) 10 minuti e (B) 1 ora. (C,D) Nessun controllo del trattamento (-Colorante, -Fibre). (E,F) -Controlli coloranti, +fibre dopo 10 minuti e 1 ora, rispettivamente. (G,H) +Colorante, -Fibre controlla rispettivamente dopo 10 minuti e 1 ora. Le barre della scala sono di 40 μm. I pannelli A-H sono proiezioni massime di 188 μm z-stack. Le fibre hanno un passo di 35 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 12: Rilascio del colorante e trasformazione transitoria delle mele tramite pellicole VACNF. (A-F) Le immagini sono state generate utilizzando la microscopia confocale. Utilizzando il metodo on-chip, goccioline da 1 μL di colorante fluoresceina (10 μM, B e D) o 1 μL di plasmide codificante pUBQ10:YFP (DNA−YFP) (200 ng) sono state essiccate su pellicole VACNF, che sono state poi arrotolate sulle superfici dei frutti utilizzando un applicatore per il trucco. Il colorante fluoresceina è stato somministrato all’epidermide della mela e visualizzato dopo (B) 10 minuti e (D) 2 ore. (D) Il colorante ha impiegato un po’ di tempo per diffondersi nelle cellule dopo il parto. Rilascio ed espressione di DNA-YFP tramite film VACNF dopo (F) 48 h. (A,C,E) nessun controllo del trattamento (-Dye/DNA-YFP, -Fibres). Le barre della scala sono di 40 μm. I pannelli A-D sono immagini planari singole da z-stack. I pannelli E e F sono la proiezione massima degli z-stack da 53 μm. Il passo della fibra è di 35 μm. Le frecce indicano i segnali di fluoresceina o YFP. * indica le fibre. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 13: Trasformazione transitoria delle foglie di Arabidopsis utilizzando metodi VACNF su pianta o su chip. (A-H) Le immagini sono state acquisite utilizzando la microscopia confocale 48 ore dopo la consegna del DNA. (A,C,E,G) Metodo su pianta: 1 μL di plasmide codificante pUBQ10:YFP (DNA−YFP) (200 ng) è stato posizionato sul lato abassiale delle foglie di Arabidopsis. I trucioli sono stati posizionati in modo tale da entrare in contatto con la gocciolina e le pinzette sono state utilizzate per picchiettare il chip nel tessuto fogliare. (B, D, F, H) Metodo su chip: 1 μL di DNA−YFP (200 ng) è stato essiccato per 15 minuti su chip VACNF e poi i trucioli sono stati picchiettati sul lato abassiale delle foglie di Arabidopsis con una pinzetta. +DNA-YFP, +Fibre per (A) on-plant e (B) on-chip. Controlli: (C,D) -DNA-YFP, + fibre; (E,F) +DNA-YFP, -Fibre; e (G,H) -DNA, −Fibre. (I) Grafico dell’intensità media relativa del segnale di fluorescenza di 25, 20 × 20 μm da immagini di 5 repliche biologiche combinate da 2-3 esperimenti utilizzando la fluorescenza dal canale YFP. Le regioni contenenti stomi (*) sono state escluse a causa dell’autofluorescenza. L’intensità media della fluorescenza dalla condizione -DNA-YFP, -Fibre è stata sottratta da ciascuna media. L’ANOVA a 2 vie (e il test di Tukey) è stata utilizzata per il test di significatività e le barre di errore rappresentano l’errore standard della media. Lettere diverse mostrano differenze significative tra i trattamenti (P < 0,0001). Tutte le immagini mostrate sono proiezioni massime di 40 μm z−stacks. Le barre della scala sono di 20 μm. Le frecce bianche indicano le fibre nelle immagini. Il passo della fibra è di 35 μm. Questa figura è stata ristampata con il permesso di Morgan et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 14: Trasformazione transitoria delle cipolle mediante pellicole VACNF. Le immagini sono state acquisite utilizzando la microscopia confocale 48 ore dopo la consegna del DNA. Utilizzando il metodo on-chip, 1 μL di DNA plasmidico codificante pUBQ 10:YFP (DNA-YFP) (200 ng) goccioline sono state essiccate su pellicole VACNF per10 minuti, che sono state poi arrotolate sulle superfici degli organi vegetali. (A) Il DNA-YFP è stato somministrato e YFP è stato espresso nell’epidermide della cipolla. (B) Nessun controllo del trattamento; (C) controllo (+DNA-YFP, -Fibre) e (D) controllo (-DNA-YFP, +Fibre). Le barre della scala sono di 40 μm. Le fibre hanno un passo di 35 μm. Le immagini sono proiezioni massime di z-stack da 115 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 15: Danno tissutale nella lattuga dovuto all’applicazione di pellicola VACNF . (A-D) Le immagini sono state generate utilizzando la microscopia confocale. (A) Il metodo on-chip è stato utilizzato per fornire DNA alle foglie di lattuga tramite pellicole VACNF. Le goccioline di DNA pUBQ 10:YFP (200 ng) sono state essiccate per10 minuti su pellicole VACNF, che sono state poi arrotolate sul lato abassiale delle foglie di lattuga staccate e conservate in una camera di umidità per 4 giorni. (B) controllo (-DNA-YFP, +Fibre). (C) controllo (+DNA-YFP, -Fibre) e (D) nessun trattamento (-DNA-YFP, -Fibre). Le barre della scala sono di 40 μm. I VACNF hanno un passo di 35 μm. Le frecce indicano i danni alle piante derivanti dal rotolamento del substrato flessibile con troppa forza. Si noti che la somministrazione di DNA mediata da VACNF nella lattuga è stata ottenuta con successo in altri esperimenti7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 16: Flusso di lavoro della consegna mediata da VACNF negli impianti. Nella fase I, controllare la geometria delle fibre utilizzando il SEM. Per una corretta erogazione, le fibre hanno bisogno di una punta con un diametro di <200 nm. Se si utilizzano fibre su substrato flessibile, il passo successivo sarebbe quello di confermare che le fibre vengono trasferite a SU-8 e di controllare l'altezza delle fibre esposte tramite SEM. Nella fase II, abbiamo testato l'utilità delle fibre cercando di fornire il colorante nella pianta/organo di scelta utilizzando un substrato rigido o flessibile. Utilizzare una goccia da 1 μL, posizionandola sulla superficie della pianta o asciugandola brevemente sul chip/pellicola. Con questo passaggio e tutti gli altri passaggi, è imperativo utilizzare i controlli appropriati (-Tintura,-Fibre; -Colorante, +Fibre; e +Colorante,-Fibre) per essere sicuri che il segnale provenga da un’erogazione del colorante in buona fede . Nella fase III, confermare che il gene di interesse è presente nel plasmide, determinare la concentrazione di DNA da somministrare e testare la quantità ottimale di tempo dopo il parto per verificare l’espressione. Nella fase IV, l’esito è stato valutato utilizzando la microscopia confocale per verificare l’espressione del marcatore consegnato. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Morgan et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.