استخدام صفائف ألياف الكربون النانوية المحاذية رأسيا على ركائز صلبة أو مرنة لتوصيل الجزيئات الحيوية والأصباغ إلى النباتات
Summary
نصف هنا طرق التصنيع الدقيق للألياف النانوية الكربونية المحاذية رأسيا (VACNFs) ، ونقل VACNFs إلى ركائز مرنة ، وتطبيق VACNFs على كل من الركائز الصلبة والمرنة على النباتات لتوصيل الجزيئات الحيوية والصبغة.
Abstract
يمثل توصيل الجزيئات الحيوية والأصباغ غير المنفذة للنباتات السليمة تحديا كبيرا. المواد النانوية هي أدوات صاعدة لتوصيل الحمض النووي إلى النباتات. على الرغم من إثارة هذه الأدوات الجديدة ، إلا أنها لم يتم تطبيقها على نطاق واسع بعد. من الصعب بشكل خاص تطبيق المواد النانوية المصنعة على ركيزة صلبة (دعامة) بنجاح على هياكل النباتات المنحنية. تصف هذه الدراسة عملية التصنيع الدقيق لمصفوفات ألياف الكربون النانوية المحاذية رأسيا ونقلها من ركيزة صلبة إلى ركيزة مرنة. نحن نوضح بالتفصيل ونوضح كيف يمكن استخدام هذه الألياف (على ركائز صلبة أو مرنة) للتحويل العابر أو الصبغة (على سبيل المثال ، الفلوريسين) إلى النباتات. نوضح كيف يمكن نقل VACNFs من ركيزة السيليكون الصلبة إلى ركيزة مرنة من الإيبوكسي SU-8 لتشكيل صفائف VACNF مرنة. للتغلب على الطبيعة الكارهة للماء ل SU-8 ، تم طلاء الألياف الموجودة في الفيلم المرن بطبقة رقيقة من أكسيد السيليكون (2-3 نانومتر). لاستخدام هذه الألياف لتسليمها إلى أعضاء النبات المنحنية ، نقوم بإيداع قطرة 1 ميكرولتر من الصبغة أو محلول الحمض النووي على جانب الألياف من أفلام VACNF ، وننتظر 10 دقائق ، ونضع الأفلام على العضو النباتي ونستخدم مسحة بحركة متدحرجة لدفع الألياف إلى الخلايا النباتية. باستخدام هذه الطريقة ، حققنا توصيل الصبغة والحمض النووي في أعضاء النبات ذات الأسطح المنحنية.
Introduction
لم يصبح التحول النباتي (العابر والمستقر) قابلا للتحقيق على نطاق واسع في جميع الأنسجة والأنواع النباتية. التحول العابر للنباتات هو عملية يتم من خلالها إدخال الجينات المشفرة في البلازميدات مؤقتا في النباتات ولكن لا يتم دمجها بشكل ثابت في الجينوم. الطرق التقليدية التي تستخدم قصف الجسيمات أو البكتيريا الزراعية أو التثقيب الكهربائي أو معالجة البولي إيثيلين جلايكول للبروتوبلاستيدات بطيئة أو يمكن أن تكون مرهقة. علاوة على ذلك ، فهي لا تنطبق على كل أنواع النباتات1،2،3،4. يعد استخدام المواد النانوية لتوصيل الحمض النووي مجالا مزدهرا لا يزال في مهده5. كما تم استخدام المواد النانوية ، وتحديدا ألياف الكربون النانوية بنجاح لتوصيل البروتينات والديكسترانس والأصباغ إلى أوراق النبات دون التسبب في استجابة الجرح6. الهدف من هذا العمل هو توفير بروتوكول مفصل لاستخدام نوع واحد من المواد النانوية ، ألياف الكربون النانوية ، لتوصيل الجزيئات الحيوية أو الأصباغ إلى النباتات. نركز هنا على الحمض النووي باعتباره الجزيء الحيوي المفضل، والذي يسمح بالتحول العابر للخلايا في مختلف أعضاء النبات.
في السابق ، أظهر Morgan et al.7 استخدام ألياف الكربون النانوية الملصقة على ركيزة السيليكون الصلبة لتحويل أوراق الخس ، N. benthamiana ، والحور ، وأوراق وجذور Arabidopsis. على الرغم من أن التحولات كانت ناجحة على مجموعة متنوعة من الأعضاء ، إلا أن الألياف كانت أكثر صعوبة في تطبيقها على الأنسجة النباتية ذات الأسطح المنحنية ، مثل الجذور أو الفاكهة. لقد فكرنا في أن الدعم المرن للألياف النانوية قد يحسن كفاءة توصيلها من خلال التوافق بشكل أفضل مع شكل العضو.
هنا ، نقوم بتفصيل الطرق المستخدمة لتصنيع وتصميم ألياف الكربون النانوية المحاذية رأسيا ، ونقل VACNFs إلى ركائز مرنة ، وتطبيق VACNFs على كل من الركائز الصلبة والمرنة للنباتات لتوصيل الجزيئات الحيوية والأصباغ. تم إنتاج ألياف الكربون النانوية باستخدام ترسيب البخار الكيميائي المعزز بالبلازما التحفيزية بالتيار المباشر (dc C-PECVD) مع محفز Ni. تم التحكم في موضع وقطر وارتفاع نقاط محفز Ni باستخدام مزيج من الطباعة الحجرية لحزمة الإلكترون ، وتبخر المعادن ، وعمليات الرفع كما وصفها Melechko et al.8,9. باستخدام مقاومة شعاع إلكتروني مزدوج الطبقة ، يمكن ترسيب محفز Ni أكثر سمكا على الركيزة لإعطاء ألياف أطول10. يعتمد نقل الألياف من الركيزة الصلبة إلى الركيزة المرنة على تعديل الطرق الموضحة في Fletcher et al.11 ، مع الطرق الحالية التي تتخلى عن استخدام طبقة كربون غير متبلورة أو طبقة مقاومة للضوء قربانية. يتم تحقيق رفع SU-8 مع نقل الألياف من خلال الاستفادة من إجهاد الشد الجوهري الناتج عن نقص الخبز والتعرض السفلي ل SU-812،13،14. SU-8 ، بوليمر معقد ، كاره للماء بشكل طبيعي ، مما يجعل استخدامه لتسهيل توصيل الحمض النووي أمرا صعبا. لمواجهة الطبيعة الكارهة للماء ل SU-8 ، نقوم بتطبيق طبقة رقيقة من أكسيد السيليكون عن طريق ترسيب الطبقة الذرية15 بعد تضمين الألياف في SU-8. يستخدم تطبيق الألياف على ركيزة صلبة لتوصيل الجزيئات الحيوية / الصبغة قوة تأثير نقر الملقط الموصوف في Davern et al.6 والطرق على النبات وعلى الرقاقة الموصوفة في Morgan et al.7. يتم تطبيق أفلام VACNF المرنة على أسطح النباتات المنحنية عن طريق تجفيف الحمض النووي أو قطرات الصبغة على الفيلم كما هو الحال مع طريقة الرقاقة من Morgan et al.7ثم لف الأفلام على أسطح النباتات المنحنية باستخدام قضيب مكياج صغير16,17. يوضح الشكل 1 طرقا مختلفة لتطبيق الألياف في ركائز صلبة ومرنة على النباتات.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة ، قدمنا طرقا لبناء صفائف ألياف الكربون النانوية المحاذاة رأسيا ، ونقل الألياف إلى ركيزة مرنة ، وتطبيق الألياف إما في ركيزة صلبة أو مرنة على النباتات لاستخدامها في توصيل الجزيئات الحيوية أو الأصباغ إلى النباتات. وصفنا طريقتين عامتين ، الطريقة على الرقاقة والطريقة على النبات ، لترسب المواد المدخلة وأظهرنا نتائج ناجحة في الألياف على ركيزة صلبة بالإضافة إلى طريقة الرقاقة باستخدام أفلام VACNF. تطبيق هذه الألياف أبسط في الممارسة والنظرية من طرق تحويل النبات التقليدية (قصف الجسيمات ، تحويل البروتوبلاست عن طريق PEG أو التثقيب الكهربائي) ويمكن استخدامها للنباتات المتمردة على التحول بوساطة Agrobacterium. ومع ذلك ، يتم تحويل عدد قليل من الخلايا فقط.
تم إنتاج ألياف الكربون النانوية المحاذاة رأسيا في مركز مختبر أوك ريدج الوطني لعلوم المواد النانوية من خلال برنامج المستخدم الخاص بهم. يمكن للمستخدمين التقدم بطلب لاستخدام هذا المرفق لإنتاج VACNFs. بدلا من ذلك ، يمكن إنتاج رقائق VACNF في غرف نظيفة مع آلات ترسيب البخار الكيميائي المحسنة بالبلازما بالتيار المباشر مع مصدر كربون22,23. مع الطرق الموصوفة ، هناك بعض الخطوات التي تعتبر حاسمة لإنتاج الألياف ونقل الألياف وتطبيق رقائق / أفلام VACNF. لكي يعمل تطبيق الألياف ، يجب أن تكون الألياف مستقيمة ولها قطر مستدق يبلغ <200 نانومتر عند الطرف للتسليم في الخلايا النباتية لتكون ناجحة 6,7 (الشكل 3). لإنشاء ألياف نانوية كربونية ذات حجم ودرجة معينة ، هناك مجموعة متنوعة من المعلمات التي يمكن تغييرها ، بما في ذلك حجم النقطة ، والملعب الجانبي ، وكمية المحفز المودعة. لتحديد حجم النقطة الأمثل لاستخدامه في إنتاج ألياف الكربون النانوية ، تمت زراعة الألياف من أحجام نقطية مختلفة (كما هو موضح في الشكل 5). وجدنا أن أقطار 300 نانومتر أنتجت أفضل الألياف ، ومن ثم تم اختيار حجم النقطة هذا (الشكل 5). بعد العثور على المعلمات الصحيحة ، تطلعنا إلى استخدام الرقائق التي تحتوي على >50٪ من الألياف ذات الهندسة المثالية (مستقيم وقطر طرف <200 نانومتر). للتحقق من هندسة الألياف ، استخدمنا المجهر الإلكتروني الماسح لتصوير مجالات الرؤية العشوائية على عينة من رقائق / أفلام VACNF.
بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون للألياف حد أدنى معين للطول لتحقيق التسليم داخل الخلايا النباتية. تكمن أهمية إنتاج ألياف ذات أطوال مختلفة في أنه يمكن استخدام ألياف أطول لاختراق طبقات الأنسجة العميقة. تعتبر الألياف الأطول (>40 ميكرومتر في الطول) ضرورية للأغشية المرنة حيث يعمل نقل الألياف عن طريق كسر الألياف من قاعدتها ويتطلب وضع طبقات SU-8 فوق الألياف. سمك العمل لطبقة SU-8 المستخدمة لهذا البروتوكول هو 20-35 ميكرومتر. الحد الأدنى للارتفاع اللازم لإنجاز التسليم داخل البشرة من النباتات المختلفة (منحنية أو مسطحة) هو 10-15 ميكرومتر 6,7. نتيجة لذلك ، فإن الألياف ذات الأطوال >40 ميكرومتر ضرورية لأفلام VACNF. هناك العديد من المعلمات المختلفة التي يجب مراعاتها عند إنتاج ألياف الكربون النانوية: مادة المحفز ، وهندسة المحفز ، وسمك مادة المحفز بالإضافة إلى الظروف داخل غرفة PECVD (نسبة الغاز ، والضغط ، ودرجة الحرارة ، والتيار ، وارتفاع رأس الدش ، ووقت النمو) 8،9،24،25. لإنتاج ألياف الكربون النانوية أطول من 25 ميكرومتر المستخدمة من قبل Morgan et al.7 و Davern et al.6 ، قمنا بزيادة كمية محفز Ni ، وقمنا بتغيير نسبة الأسيتيلين : الأمونيا ، وزدنا التيار ووقت النمو. بالإضافة إلى ذلك، أولينا المزيد من الاهتمام لهندسة المادة الحفازة. لإنتاج ألياف مستقيمة طويلة ، يجب أن يكون للمحفز المترسب شكل عفريت هوكي بدلا من شكل يشبه البركان (الشكل 4). تنشأ هياكل البركان من بقايا مقاومة الضوء بعد الإقلاع. لمنع تكوين البراكين ، تم استخدام طبقة مزدوجة من PMMA لإنشاء تقويض أثناء الطباعة الحجرية لحزمة الإلكترون26. يساعد التقويض في رفع المحفز المعدني المترسب (الشكل 2). الطبقة السميكة من المحفز مهمة لنمو VACNFs الطويلة. تم فحص مورفولوجيا VACNFs بواسطة Merkulova et al.24. ترجع المحاذاة الرأسية ل VACNFs إلى كل من نمو طرف محفز Ni ومحاذاة جهد DC عموديا على الركيزة (الشكل 6). يصف رأس الدش هندسة مفاعل PECVD (الشكل 6) ويعمل كمصدر لإمكانات المجال الكهربائي27.
لتحديد مجموعة النقاط الحفازة باستخدام الطباعة الحجرية لحزمة الإلكترون ، قمنا بتطبيق مقاومة شعاع الإلكترون (polymethyl methacrylate) ، ثم استخدمنا الحزمة الإلكترونية لعمل ثقوب صغيرة في المقاومة بشكل معين وفي مواقع محددة على الرقاقة. تم وضع ثقوب بالقطر المطلوب على شبكة منتظمة مع التباعد المحدد (الملعب) وتم تحميل ملف يحدد النمط المطلوب في أداة الطباعة الحجرية لحزمة الإلكترون قبل تحميل الركيزة في الجهاز. بالإضافة إلى ارتفاع الألياف ، هناك معلمة مهمة أخرى لنقل الألياف بنجاح وهي مقدار الوقت الذي يقضيه في حمام الأسيتون. يجب ترك أفلام VACNF في حمام الأسيتون لفترة كافية بحيث تبدأ حوافها في التجعد ؛ إذا تركت في حمام الأسيتون لفترة قصيرة جدا ، فمن الصعب رفع الرقائق وقد تنكسر. كلما كانت الرقائق أقدم ، كلما طالت مدة بقائها في حمام الأسيتون. بعد حمام الأسيتون ، تم وضع الأفلام / الرقائق في الأيزوبروبانول والماء لإزالة الأسيتون الوصول وكذلك لإزالة مقاومة الضوء الواقية على الألياف.
لأداء طلاء الدوران ، يتم وضع الرقائق أو قطع الويفر على ظرف فراغ في طلاء الدوران ، ويتم التحقق من الموضع المركزي للرقاقة باستخدام وظيفة الاختبار الخاصة بطلاء الدوران. يتم تطبيق بركة صغيرة (~ 2.5 سم في القطر) من المقاومة على مركز الرقاقة ونسج (3000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية) يتم تضمين صور الألياف قبل وبعد طلاء الدوران في الشكل 8 الذي يوضح الحفاظ على هندسة الألياف (الارتفاع والاتجاه ودرجة الصوت). يؤدي وجود الألياف إلى مقاومة جيدة في قاعدة الألياف وينتج عنها طبقات أكثر سمكا من المتوقع. تم استكشاف الطلاء الدوار بعد نمو VACNF من قبل مجموعات أخرى11,18.
خطوة أخرى في العملية ذات أهمية حيوية هي ضمان تطبيق القدر المناسب من القوة على رقائق / أفلام VACNF. تعتمد آلية التوصيل على الألياف التي تصنع ثقوبا صغيرة في جدران الخلايا عبر القوة الدافعة للملقط الذي ينقر على ركائز صلبة 6,7 أو يتدحرج باستخدام قضيب المكياج الصغير على ركائز مرنة. قد تنفصل الألياف أو لا تنفصل وتظل مضمنة في الخلايا النباتية 6,7 دون التأثير على النتيجة ، ولكن الممارسة جنبا إلى جنب مع فحص امتصاص الصبغة وتلف الأنسجة ضرورية للحصول على الضغط الصحيح. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم اختيار نقاط زمنية مناسبة للتصوير بعد تسليم الحمض النووي باستخدام رقائق / أفلام VACNF حيث يختلف وقت التعبير القابل للكشف بين الأنواع النباتية وأنواع النواقل التي يتم تسليمها7 (الشكل 16).
على الرغم من أن هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على النباتات ، إلا أن لها بعض القيود. على سبيل المثال ، لا تؤدي إضافة طبقة رقيقة من أكسيد السيليكون إلى أفلام VACNF دائما إلى أن تكون الأفلام محبة للماء تماما بسبب الطبقة الواقية من مقاومة الضوء المضافة أعلى SU-8. إذا تحققت هذه المشكلة ، يمكن تطبيق طبقات أكثر سمكا من أكسيد السيليكون على VACNFs. لاختبار ما إذا كانت الأفلام كارهة للماء أو محبة للماء ، يمكن وضعها في الماء. إذا غرقت الأفلام ، فهي محبة للماء ، وإذا طفت ، فهي كارهة للماء. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون هناك اختلاف بين دفعات الألياف المنتجة. هناك العديد من المعلمات التي يمكن تغييرها عند زراعة الألياف في آلة dc -PECVD ؛ ما هو موضح في هذا البروتوكول هو مجموعة من المعلمات لكميتين مختلفتين من محفز النيني. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن التحكم في الاتجاه البلوري لمحفز Ni28 وستؤدي بعض التفرعات حتما إلى الألياف.
بينما أظهرنا توصيل صبغة الفلوريسئين والحمض النووي إلى الخلايا النباتية باستخدام ركائز صلبة ومرنة لهذه الورقة ، يجب أن تكون الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على الجزيئات الحيوية الأخرى ونهج التعديل الوراثي ، على سبيل المثال ، إسكات RNAi للأنظمة النباتية مثل التفاح أو الفواكه الأخرى حيث يستغرق الأمر سنوات لإنتاج خطوط معدلة وراثيا مستقرة. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذه الألياف لتقديم مواد التحرير الجيني أو للتحولات المستقرة في النباتات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تصنيع صفائف الألياف النانوية في مركز علوم المواد النانوية ، وهو مكتب تابع لوزارة الطاقة لمرفق مستخدم العلوم (معرف الاقتراح: CNMS2019-103 و CNMS2022-A-1182). يتم تقديم الدعم من CNMS من خلال نظام اقتراح خاضع لمراجعة الأقران ويتم تقديمه مجانا للمتقدمين الناجحين الذين يعتزمون نشر نتائجهم (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). نشكر كيفن ليستر و CNMS على المساعدة في إنتاج صفائف الألياف النانوية. نشكر الدكتور جون كوجمن والدكتور تيموثي ماكنايت والدكتور أمبر ويب وداريل بريجز وترافيس بي على المناقشات النقدية حول التصميم التجريبي. نشكر الدكتور آدم روندينون على مخطط آلة PECVD. نشكر ليزلي كارول على الرسوم التوضيحية العلمية. تم تمويل هذا العمل من قبل برنامج علوم التصوير الحيوي ، وزارة الطاقة الأمريكية ، مكتب العلوم ، البحوث البيولوجية والبيئية ، DE-SC0019104 ، ووزارة الزراعة الأمريكية ، 2021-67013-34835. تم دعم JMM من قبل وزارة الزراعة الأمريكية: المعهد الوطني للأغذية والزراعة: زمالة ما قبل الدكتوراه لمبادرة الزراعة وبحوث الأغذية 2021-67034-35167.
Materials
| 13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct | Fastenal | 690535 | |
| 2-Propanol (IPA) | Fischer Scientific | A451-4 | |
| 4" Lid | Entegris | H22-401-0615 | Wafer Carriers |
| 4" tray | Entegris | H22-40-0615 | Wafer Carriers |
| Accretech SS10 dicing saw | Accreteck | SS10 | |
| Acetone | Fischer Scientific | A18-4 | |
| Acetone used in the cleanroom at ORNL | JT Baker | 9005-05 | |
| Apples | Grocery store | No product number | |
| Arabidopsis thaliana | Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago | No product number | |
| Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine | Oak Ridge National Laboratory | Custom-built | |
| Cobham Green lettuce | Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis | No product number | Butterhead lettuce |
| Fluorescein dye | Sigma Aldrich | F2456-2.5G | |
| Gel-box | Gel-Pak | AD-23C-00-X4 | |
| Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool | Heidelberg | DWL 66 | |
| ImageJ | National Institues of Health | No product number | |
| Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL | Doe and Ingalls | CMOS Grade 9079-05 | |
| JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system | JEOL | 8100 | |
| Kimwipes | Kimtech | Kimberly-Clark Professional 34120 | |
| Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish | VWR | 11019-554 | |
| Layout Editor | juspertor GmbH | No product number | |
| LSM 710 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| LSM 800 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| Make-up applicator | Amazon | G2PLUS | 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS |
| Merlin field emission scanning electron microscope | Zeiss | Merlin | |
| MIBK/IPA (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) | Microchem | M089025 | |
| Onions | Grocery store | No product number | |
| Oxford FlexAl atomic layer deposition | Oxford | FlexAl | |
| PMMA 495 A4 | Microchem | M130004 | |
| PMMA 950 A4 | Microchem | M230004 | Can dilute down to A2 |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Amazon | KS-6304-21-11 | Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc |
| Precision tweezers | Aven Inc. | 18032TT | |
| pUBQ10:YFP-GW | Arabidopsis Biological Resource Center | CD3-1948 | |
| Silicon etcher (used for descum) | Oxford | Plasmalab | |
| Silicon rubber kit | Smooth-On Inc | Ecoflex 00-20 | |
| Silicon wafers | Pure Wafer | 4N0.001-.005SSP-INV | |
| Spin coater | Brewer Sciences | Model 100CB | |
| SPR 955cm 0.7 | Megaposit | 10018314 | |
| Strawberries | Grocery store | No product number | |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 Series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 2000 Series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Suss MicroTec contact aligner | Suss MicroTec | MA6/BA6 | |
| Table top microscope | Phenom XL | used for checking Ni catalysts after metal deposition | |
| Thermionics VE-240 e-beam evaporator | Thermionics | VE-240 |
References
- Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
- Gou, Y. J., et al. Optimization of the protoplast transient expression system for gene functional studies in strawberry (Fragaria vesca). Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 141, 41-53 (2020).
- Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 149, 1-26 (2017).
- Ren, R., et al. Highly efficient protoplast isolation and transient expression system for functional characterization of flowering related genes in Cymbidium orchids. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2264 (2020).
- Kumar, S., et al. Nanovehicles for plant modifications towards pest-and disease-resistance traits. Trends in Plant Science. 25 (2), 198-212 (2020).
- Davern, S. M., et al. Carbon nanofiber arrays: a novel tool for microdelivery of biomolecules to plants. PLoS One. 11 (4), e0153621 (2016).
- Morgan, J. M., et al. An efficient and broadly applicable method for transient transformation of plants using vertically aligned carbon nanofiber arrays. Frontiers in Plant Science. 13, 1051340 (2022).
- Melechko, A. V., et al. Vertically aligned carbon nanofibers and related structures: Controlled synthesis and directed assembly. Journal of Physics D: Applied Physics. 97, 041301 (2005).
- Melechko, A. V., Desikan, R., McKnight, T. E., Klein, K. L., Rack, P. D. Synthesis of vertically aligned carbon nanofibres for interfacing with live systems. Journal of Physics D: Applied Physics. 42 (19), 193001 (2009).
- Nelson-Fitzpatrick, N. . Novel Materials for the Design of Cantilever Transducers [dissertation]. , (2011).
- Fletcher, B. L., et al. Transfer of flexible arrays of vertically aligned carbon nanofiber electrodes to temperature-sensitive substrates. Advanced Materials. 18 (13), 1689-1694 (2006).
- Keller, S., Blagoi, G., Lillemose, M., Haefliger, D., Boisen, A. Processing of thin SU-8 films. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (12), 125020 (2008).
- Wouters, K., Puers, R. Diffusing and swelling in SU-8: insight in material properties and processing. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (9), 095013 (2010).
- Jamal, M., Zarafshar, A. M., Gracias, D. H. Differentially photo-crosslinked polymers enable self-assembling microfluidics. Nature Communications. 2, 527 (2011).
- Williams, R., Goodman, A. M. Wetting of thin layers of SiO2 by water. Applied Physics Letters. 25 (10), 531-532 (1974).
- Kundu, A., Nogueira Campos, M. G., Santra, S., Rajaraman, S. Precision vascular delivery of agrochemicals with micromilled microneedles (µMMNs). Scientific Reports. 9, 14008 (2019).
- Acanda, Y., Welker, S., Orbović, V., Levy, A. A simple and efficient agroinfiltration method for transient gene expression in Citrus. Plant Cell Reports. 40 (7), 1171-1179 (2021).
- Pearce, R., et al. Synthesis and properties of SiNx coatings as stable fluorescent markers on vertically aligned carbon nanofibers. AIMS Materials Science. 1 (2), 87-102 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Crafts, A. S. Translocation in plants. Plant Physiology. 13 (4), 791 (1938).
- Martens, H. J., Hansen, M., Schulz, A. Caged probes: a novel tool in studying symplasmic transport in plant tissues. Protoplasma. 223, 63-66 (2004).
- Liu, J., Essner, J., Li, J. Hybrid supercapacitor based on coaxially coated manganese oxide on vertically aligned carbon nanofiber arrays. Chemistry of Materials. 22 (17), 5022-5030 (2010).
- Saleem, A. M., et al. Low temperature and cost-effective growth of vertically aligned carbon nanofibers using spin-coated polymer-stabilized palladium nanocatalysts. Science and Technology of Advanced Materials. 16, 015007 (2015).
- Merkulov, V. I., Lowndes, D. H., Wei, Y. Y., Eres, G., Voelkl, E. Patterned growth of individual and multiple vertically aligned carbon nanofibers. Applied Physics Letters. 76 (24), 3555-3557 (2000).
- Retterer, S. T., Melechko, A., Hensley, D. K., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Positional control of catalyst nanoparticles for the synthesis of high density carbon nanofiber arrays. Carbon. 46 (11), 1378-1383 (2008).
- Rooks, M. J., Wind, S., McEuen, P., Prober, D. E. Fabrication of 30-nm-scale structures for electron transport studies using a polymethylmethacrylate bilayer resist. Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics Processing and Phenomena. 5 (1), 318-321 (1987).
- Lee, G., Sohn, D. K., Seok, S. H., Ko, H. S. The effect of hole density variation in the PECVD reactor showerhead on the deposition of amorphous carbon layer. Vacuum. 163, 37-44 (2019).
- Fowlkes, J. D., et al. Control of catalyst particle crystallographic orientation in vertically aligned carbon nanofiber synthesis. Carbon. 44 (8), 1503-1510 (2006).
