生細胞STEDイメージングを用いた神経細胞モデルにおけるミトコンドリア内膜の微細構造の可視化

1. SH-SY5Y細胞の増殖と分化 細胞増殖および維持のための培地の調製完全な高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、4.5 g/L D-グルコース、4 mM L-グルタミン、110 mg/Lピルビン酸ナトリウム)を調製し、最終的な1%(v/v)抗生物質-抗真菌薬(10,000単位/mLペニシリン、10,000 μg/mLストレプトマイシン、および25 μg/mLアムホテリシンB)およびさまざまな量のウシ胎児血清(FBS)( 材料表を参照)を添加します。分化培地中のFBS量は、最終的な10%、5%、または2%(v/v)のFBSの間で変化します。 セルのメンテナンス細胞を10%(v/v)FBSを添加したDMEMで維持し、37°C、5%CO2で静置し、5%(v/v)FBSを含むDMEMで播種して分化させます。凍結細胞ストックを、10%(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO)とともに1-2 x 107 細胞/mLでFBSに保存しました。 レチノイン酸(RA)の調製7.51 mg のオールトランス-RA(材料表を参照)を新たに調製した 95% エタノール 5 mL に溶解し、5 mM ストック溶液を得ます。メーカーのプロトコル81 の製品情報シートから得られた 350 nm の吸光度 (ɛ = 44,300 M-1 cm-1) で、エタノール中で 5 μM の原液を希釈して濃度を確認します。5 mM ストックを 4 °C で光から保護して最大 6 週間保管します。 カバーガラスコーティングのためのポリ-D-リジンの調製注:ベンダーサイト82のDocuments & Downloadsセクションにあるpoly-D-lysine(PDL)製品プロトコルは、さまざまな培養容器をコーティングするための情報を提供します。このプロトコルには、無菌#1.5ホウケイ酸カバーガラス底部を備えたウェルあたり4cm2 の面積を持つ2ウェルチャンバー容器に基づくボリュームが含まれています( 材料表を参照)。PDLの原液をダルベッコPBS(DPBS、カルシウム、マグネシウムなし)で2倍に希釈して50 μg/mLにします。注:#1.5または#1.5Hカバーガラスはどちらも許容可能な厚さであり、画質に不可欠です。他の厚さは球面収差を誘発するため、避ける必要があります。 PDLによるカバーガラスコーティング注意: カバーガラスは、バイオセーフティキャビネット内で紫外線(UV)に10〜15分間さらして、さらに滅菌することができます。1.2 mL の 50 μg/mL PDL 溶液を細胞培養キャビネット内の滅菌チャンバーカバーガラスの各ウェルに塗布し、室温で 1 時間インキュベートします。PDL溶液を除去し、3.6 mLの蒸留水で3回すすぎます。最終洗浄が完了したら、コーティングチャンバーを空気にさらして2時間乾燥させてから、すすぎ、すぐに使用するか、4°Cの密閉容器で最大2週間保管します。注:過剰なPDLは細胞に有毒である可能性があるため、カバーガラスを完全にすすいでください。 RAによるSH-SY5Y細胞の分化注:継代15より上のセルは使用しないでください。細胞は80%〜90%のコンフルエントで継代されます。区別手順は異なりますが、同様の手順に従います。神経芽細胞腫から成熟ニューロンへの追加の分化は、脳由来神経栄養因子(BDNF)68,83,84,85によるさらなる治療で得られますが、このプロトコルでは行われませんでした。オプション:カバーガラスに播種する前に、少なくとも24時間細胞を確立します。凍結ストックから細胞を調製するには、1 mLの凍結バイアルを急速に解凍し、10Sを添加した9 mLの予熱培地に添加し、350 x g で10分間(室温)スピンダウンし、上清を捨ててDMSOを除去します。細胞ペレットを予熱した培地5 mLに再懸濁し、細胞をT-25フラスコに播種します。細胞が80%〜90%のコンフルエントに達したら、細胞をカウントして播種し、該当する場合は分化させます。0日目:細胞を播種します。凍結ストックまたは作業用フラスコからチャンバー付きカバーグラスに細胞を播種します。播種密度は1.5×104 セル/cm2。注:培養面積が 4 cm 2 の標準的な2 ウェルチャンバーカバーグラスの 1 つのウェルには、6.0 x 104 セルが必要です。未分化のままの細胞には、10%(v/v)FBSを添加したDMEMを播種し、分化させる細胞には、5%(v/v)FBSを添加したDMEMを播種する必要があります。 1日目:関節リウマチ分化治療開始。5%(v/v)FBS、1%(v/v)抗生物質-抗真菌薬、および最終濃度10 μMのRAまたは同じ添加量のエタノールを添加したDMEMを調製し、この鑑別手順のビヒクルコントロールとして使用します。播種に使用したチャンバー付きカバーガラスの培地を取り除き、1x PBSですすぎ、新しいDMEMをウェルに加えます。 3日目:培地を新しいRAまたはエタノール含有培地と交換します。1日目から培地を除去し、2%(v/v)FBS、1%(v/v)抗生物質-抗真菌薬、および10 μM RAまたは同添加量の95%エタノールを添加した新しい培地と交換して、この分化手順のビヒクルコントロールとして使用します。播種に使用したチャンバー付きカバーガラスの培地を取り除き、1x PBSですすぎ、ウェルに新しい培地を追加します。 6日目:細胞のイメージングを行います。注:細胞分化時間はプロトコルによって異なるが、RAへの6日間の曝露は、SH-SY5Y細胞にニューロン様表現型を誘導するのに十分である86。セクション3と4で詳細を記載したライブイメージングを実行します(図2)。 2. 初代ラット海馬ニューロン培養 ラット海馬ニューロン単離のための材料調製。新たに添加したDMEMを調製します。10%(v/v)熱不活化FBS、1%(v/v)ピルビン酸ナトリウム溶液、および1%(v/v)ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)を添加したDMEM(高グルコース、ピルビン酸ナトリウムなし)の混合物をろ過滅菌します。4°Cで最大2週間保存してください。 新しい補充されたニューロン増殖培地を調製します。2%(v/v)のB27サプリメント、0.25%(v/v)のグルタミンサプリメント、および1%(v/v)のペニシリン-ストレプトマイシンを添加したニューロン増殖培地の混合物をろ過滅菌します( 材料表を参照)。4°Cで最大2週間保存してください。 初代海馬ニューロン培養を準備します。以前に発表された研究87 に従って、および解剖されたE18ラット海馬が得られる製造元のサイトの製品プロトコル88 ( 材料表を参照)に従って、一次海馬ニューロン培養を準備します。このプロトコルは<2%のastrocytesが付いている大抵ニューロンの人口で起因する。注:この組織が出荷される休止状態培地は、このプロトコルの将来のステップに使用されます。廃棄しないでください。 組織解離のための材料と培地を準備します。パスツールピペットを炎で焼いて開口部の直径を小さくし、ホイルで保管して、使用まで汚染を防ぎます。調製したDMEM、1X Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS)、およびニューロン増殖培地を37°Cに予熱します。 15 mLのコニカルチューブに滅菌ピンセットでDNAaseのフレークを2つ加えます。 組織解離を行います。解剖したE18ラット海馬が保管されている冬眠培地をできるだけ多く除去してから、DNAaseを含む15 mLのコニカルチューブに組織を入れ、37°Cで短時間インキュベートします。 900 μL の 1X HBSS を加え、続いて 100 μL の 0.5% トリプシンを加えます。組織を37°Cで15分間インキュベートします。注:PDLコーティングプレートは、このインキュベーション時間中に使用されるまで、保管から取り出してインキュベーターに入れることができます。 組織のホモジナイズと細胞カウントを行います。トリプシンとインキュベーションした後、培地を除去し、前のステップで予熱した冬眠培地DNAase 1 mLを組織に加え、パスツールピペットでホモジナイズします。メディアは不透明に見えますが、均質化が進むにつれて徐々に透明になります。 解離したニューロンを予熱した 4 mL の DMEM で新しいチューブに追加し、セルカウンターを使用して細胞をカウントします。 細胞プレーティングを行い、初代細胞を増殖させます。DMEMで約1.65 x 104 cells/cm2 の密度で細胞を播種します。2ウェルチャンバーカバーグラス(4 cm 2)の場合、2 mL DMEMでウェルあたり65,000〜70,000個の細胞を播種します。細胞を37°C、5%CO2 で2時間インキュベートしてから、接着性を確認します。細胞が接着し始めたら、1 mLの培地を取り除き、同量の休止状態培地と交換し、穏やかに攪拌して混合します。培地が混合されたら、このプロセスを繰り返し、存在する培地の半分を取り除き、同じ量のニューロン増殖培地と交換してから、穏やかに混合します。注:プレーティングの日は in vitro (DIV) 0 と見なされ、細胞は DIV 7 でイメージングする準備ができています(図 2)。 3. 生細胞イメージング用細胞の調製 注:細胞の種類と起源(すなわち、培養細胞と初代細胞)は、染色要件が異なる場合があります。詳細については、公開されたレポートを参照してください62,63. PKmitoオレンジの調製注:一般的にIMMを染色する他の色素は64,65,66報告されており、市販されている。PKMOは、このプロトコルで使用される唯一のものです。粉末PKMO( 材料表を参照)を、製造元の指示に従ってDMSOに再懸濁する89。細胞から培地を吸引し、予熱したフェノールレッド遊離培地で洗浄します。分化状態に応じて2%(v/v)のFBSまたは10%(v/v)、最終濃度20 mMまでのHEPES、および1%(v/v)の抗生物質-抗真菌剤を添加した、予熱したフェノールレッドフリーDMEMにPKMOのストックを調製してから、メーカーの指示に従って細胞を染色します。PKMOを含まないこの製剤は、生細胞イメージング培地です。 PKMOによる細胞染色細胞を色素とともに37°C、5%CO2 で30分間インキュベートします。生細胞イメージング培地で細胞を3回洗浄し、最終洗浄では37°C、5%CO2で30分間インキュベートします。 あらかじめ温めた新鮮な生細胞イメージング培地を添加します。これで、細胞をイメージングする準備が整いました。注:急性治療(薬物やストレッサーなど)は、使用する場合、ライブイメージングの前に追加されます。「考察」セクションおよび 補足図1を参照してください。 4. STED顕微鏡による生細胞のイメージング 注:このプロトコルは、倒立顕微鏡を中心に構築されたSTEDシステムを使用し、 材料表で指定されているシステムを使用します。このシステムには、パルス励起レーザー(公称出力~300μWの561nmレーザー)とパルス775nmのSTED空乏レーザー(公称出力1.2W)、連続調整可能なガルバノスキャナー、および615/20nmフィルターベースのアバランシェフォトダイオード検出器(APD)が装備されています。ここでは、STED用の100倍/1.40の油浸レンズを使用しています。画像取得にはライトボックスソフトウェアを使用します。提供されるすべての詳細は、このソフトウェアとシステムのセットアップに直接関連しています。 イメージングの一般的なガイドラインと手順細胞の生存率を維持するためにステージトップインキュベーターまたは環境チャンバーを使用しますが、短期間の室温実験も許容されます。これらの手順は、上記の STED セットアップに固有です。 イメージング用のレーザーセットとフィルターセットを選択します。オレンジ色の色素のパラメータを使用するには、染色に使用する染料を [Dye List] から選択するか、使用する色素に最も近いスペクトル特性を持つ色素を選択します。これらをダブルクリックするか、サンプルリストにドラッグしてアクティブにします。サンプルリストには「ここに染料をドラッグしてください」と表示されます。 画像化する領域を選択します。概要で、四角形の ROI ボタン を選択し、クリックしてドラッグして領域を形作ることで、関心のあるミトコンドリアの周囲に関心領域 (ROI) を作成します。ROI のサイズ変更と回転は、コーナーの上にマウスを置いたときに表示される ROI のコーナー または 曲線エッジ を使用して行うことができます。メモ: 推奨されるイメージングパラメータの概要を 表 1 に示します。これらのパラメータは、このSTEDセットアップおよび色素の組み合わせについて以前に報告されたものを用いて経験的に調整された63。 ゲートを設定します。「一般」(General) メニューの横で、「ゲート」(Gating) メニューを選択するか、クリックしたままにしてメニューをビューに追加します。STED検出器のゲーティングは、ここに示すように、1-1.05〜7.85 nsに調整することをお勧めします。ゲーティング時間はさまざまで、1-1.05 nsから7-7.05 nsまで短くなります。 サンプルに応じて強度を適切に調整してください。注:一般的に、STEDに使用される励起電力は共焦点に使用される出力の2〜3倍であるため、共焦点に使用される5%の励起レーザー出力を必要とするサンプルは、STED取得中に10%〜15%の励起レーザー出力を使用できます。STEDの励起レーザーを15%-20%に設定し、STED空乏レーザーを20%-25%に設定し、10ラインの蓄積を行います。20〜25nmのピクセルサイズで4μsのピクセル滞留時間を使用します。ピンホールは、より密集したミトコンドリアの光学的切片を改善するために、培養細胞では1.0 AU、初代ラット海馬細胞では0.7 AUに保たれました。注:共焦点画像とSTED画像の両方を取得して並べて比較することもできます(図3A、B、図4A)、またはSTEDのみを取得することもできます。 時系列/z 系列の追加情報時系列を選択します。[時間] ドロップダウン メニューを選択します。タイムラプスに必要な反復回数(ここでは5秒を使用)と時間間隔(ここでは25秒または30秒を使用)を定義します(図3C、D、図4B)。注:間隔が取得時間よりも短い場合、反復は遅延なく続行されます。タイムラプスを実行するときは、潜在的なドリフトを避けるために、完璧なフォーカスユニットまたは同様のフォーカストラッキングを使用することを強くお勧めします。 音量範囲を設定します。必要に応じて Z ボリューム範囲を設定するには、 Volume オプションを有効にし、範囲の両端を調整します。2Dイメージ投射のためのこのプロトコルで使用されるステップサイズは150-200 nmだった。生のSTEDのデコンボリューションに必要なナイキストサンプリングに関する推奨ステップサイズは、オンラインツール90で計算することができる。注:STEDの枯渇レーザー出力と画像化された平面の数により、色素の光退色と細胞への光曝露が有害なレベルに増加する可能性があります。取得後に光毒性および光損傷の兆候がないか確認します。 5. ミトコンドリア超微細構造の加工・解析ツール 注:画像処理(デコンボリューション)はオプションですが、通常、公開用のSTED画像を作成および分析するときに使用されます。以下で説明するように、個々のクリステの最適なセグメンテーションには、コントラストを改善し、ノイズを低減するためのデコンボリューションを強くお勧めします(図2)。 STED画像デコンボリューション注:このプロトコルでデコンボリューションに使用されるソフトウェアは、 材料表に記載されています。画像の微視的パラメータを設定します。注:顕微鏡のメタデータが画像の 顕微鏡パラメータに正しく入力されていることを確認してください。これには、封入媒体の屈折率が含まれます。浸漬媒体;ピクセルサイズ;励起波長、発光波長、および枯渇波長。およびその他の関連情報。これらのパラメーターを持つテンプレートは、再利用のために保存できます。 ソフトウェアアルゴリズムで生のSTED画像をデコンボリューションします。デコンボリューションソフトウェアで自動デコンボリューションアルゴリズムにアクセスすることで、ハンズオフのデコンボリューション画像処理が可能になります。 [Express ] ボタンを選択し、デコンボリューションの種類を Fast、Standard、Aggressive、または Conservative に設定して、さまざまな程度のデコンボリューションパワーを設定します。Express DeconvolutionをAggressive設定で使用した代表的な画像を示します(図3、図 4、 図5)。 デコンボリューションソフトウェアからICS2形式で画像を保存します。 手動デコンボリューションの場合は、次の手順を実行します。簡単に言うと、手動デコンボリューションを実行する場合は、一貫性を保つためにデコンボリューションウィザードのテンプレートを保存し、ウィザードの開始時にテンプレートをロードするオプションを用意します。測定点像分布関数(PSF)情報は、アクイジションの設定とパラメータで生成された場合に使用します。 必要に応じて、デコンボリューションソフトウェアで画像を自動安定化する前に、生のSTED画像を切り抜きます。デコンボリューションソフトウェアパッケージへのアドオンにより、熱ドリフトや色収差などのイメージングアーチファクトの可能性を特定の補正することができます。 次に、対数ヒストグラムを生成して、手動または自動でバックグラウンド減算を実行します。従来の最尤推定 (CMLE) デコンボリューション アルゴリズムを選択します。注: デコンボリューションの場合、調整する主な値は、S/N 比のしきい値、反復回数、および品質しきい値です。これらの値は調整でき、デコンボリューションをプレビューして最適な設定を決定できます。 セグメンテーションと粒子解析注: このプロトコルは、オープンソースソフトウェアである FIJI (Is Just ImageJ) を使用します ( 材料表)を使用して、セグメンテーションと分析を行います。CellProfiler、Icy、Ilastik、QuPathなど、他の同等のソフトウェアもこれらの目的に利用できます。セグメンテーション用の画像を準備します。デコンボリューションソフトウェアから .obf raw STED イメージまたは .ics2 ファイルを開くには、[ファイル] → [開く] に移動するか、ファイルをクリックして ImageJ ツールバーにドラッグします。ここから、セグメンテーションの前に画像をセグメント化しやすいようにする処理を行うことができます。 変更の一貫性を保つには、「プラグイン → マクロ (Plugins Macros )」→「プラグイン (Plugins )」→「新規 → マクロ (New Macro) からキーコマンドを記録し、コピーして新しいマクロにペーストします。マクロを実行する前に、処理するイメージを必ず選択してください。注:サイズと形状の定量化で一般的に許容される変更には、トリミング、Zスタックの投影、およびスムージングを無効にした背景の減算が含まれます。変更は、データセット内の画像間で一貫して実行し、報告する必要があります。 トレーニング可能なWekaセグメンテーション設定の調整注:ミトコンドリアの半自動セグメンテーションツールおよびダウンストリーム分析の使用に関するステップバイステップの説明を含む追加の詳細が公開されている91。[Plugins → Segmentation → Trainable Weka Segmentation] にある Trainable Weka Segmentation (TWS)92 プラグインで、デコンボリューションされた STED 画像を開きます。セグメンテーション設定で、ガウスぼかし、膜投影、ソーベルフィルター機能を選択します。膜厚の既定値は 1 で、膜パッチ サイズの既定値は 19 です。 クラス1または2のいずれかを「Cristae」としてラベル付けし、もう一方を「Background」としてラベル付けします(図2)。モデルは、[ 分類子の保存 ] ボタンで保存することもできます。[ 分類子の読み込み ] を選択して、これらの設定を他の画像に再利用します。 TWS クラス・トレースを実行します。線ツールまたはその他の図形を使用して、クリステまたは背景の一部を強調します。少なくともいくつかの背景の選択には、クリステの間にスペースを含める必要があります。いずれかのクラスに割り当てる構造の上に線を引き、右側の [追加 ] ボタンを選択して cristae または background を選択します。トレースをダブルクリックすると、そのラベルから構造が削除されます。 TWS 分類トレーニングを実行します。左側の [分類子のトレーニング] ボタンを選択して、プラグインに提供された情報に基づいてマップを生成します。セグメント化されたクラスのオーバーレイは、[オーバーレイの切り替え]ボタンでオンとオフを切り替えることができ、オーバーレイの不透明度は[設定]で調整できます。分類器は、追加のラベルで再トレーニングできます。問題がなければ、 [Get Probability](確率の取得) ボタンを選択します。 粒子を測定します。クリステ確率マップを使用して、イメージのしきい値を設定してマスクを生成し、[ 解析] →[ パーティクルの解析]に移動します。一般的には、デフォルトの閾値タイプを使用し、範囲を調整して、クリステ全体が考慮されるようにすることができます。粒子の解析によって得られる測定値は、測定値 の解析 →設定(Analyze Set Measurements)で調整できます。注:クリステの面積、周囲長、真円度、アスペクト比などのサイズと形状のパラメータの例は、選択した測定値に基づいて測定および表示されます(図2、 図5A、 補足表1)。 オプション: デコンボリューションされたイメージと同じ次元の生の STED イメージを選択し、マネージャーから ROI を適用してから、ROI マネージャーで [測定 ] を選択して強度値を取得します。 ラインプロットを取得します。ラインプロットは、デコンボリューションされたSTED画像から生成されました。多点線を描き、線の太さを数ピクセル幅に調整してノイズを平均化し、ミトコンドリアに合うように線をスプラインします(図2、 図5B)。生成された折れ線グラフは、ピークtoピーク距離を測定し、特定の範囲におけるクリステの周期性と分布を報告するために使用されます。注:関連して、クリステ密度は、ミトコンドリアの外側部分を測定することによって決定される、特定の領域内の独立したクリステの数として報告できます。ミトコンドリア領域は、デコンボリューションまたは生のSTED画像にフィルタを適用してマスクを生成することによって決定することができる。面積を測定する前に、マスクがミトコンドリアの輪郭に正確にフィットしていることを確認してください。