Ce protocole présente un flux de travail pour la propagation, la différenciation et la coloration de cellules SH-SY5Y en culture et de neurones primaires de l’hippocampe de rat pour la visualisation et l’analyse de l’ultrastructure mitochondriale à l’aide de la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED).
Les mitochondries jouent de nombreux rôles essentiels dans la cellule, notamment la production d’énergie, la régulation de l’homéostasie du Ca2+ , la biosynthèse des lipides et la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Ces processus médiés par les mitochondries jouent des rôles spécialisés dans les neurones, coordonnant le métabolisme aérobie pour répondre aux besoins énergétiques élevés de ces cellules, modulant la signalisation Ca2+ , fournissant des lipides pour la croissance et la régénération des axones et ajustant la production de ROS pour le développement et la fonction neuronaux. Le dysfonctionnement mitochondrial est donc un facteur central des maladies neurodégénératives. La structure et la fonction mitochondriales sont inextricablement liées. La membrane interne morphologiquement complexe avec des plis structurels appelés crêtes abrite de nombreux systèmes moléculaires qui exécutent les processus de signature de la mitochondrie. Les caractéristiques architecturales de la membrane interne sont ultrastructurales et donc trop petites pour être visualisées par la microscopie résolue traditionnelle limitée par diffraction. Ainsi, la plupart des connaissances sur l’ultrastructure mitochondriale proviennent de la microscopie électronique sur des échantillons fixes. Cependant, les technologies émergentes de la microscopie à fluorescence à super-résolution offrent désormais une résolution allant jusqu’à quelques dizaines de nanomètres, ce qui permet de visualiser les caractéristiques ultrastructurales des cellules vivantes. L’imagerie à super-résolution offre donc une capacité sans précédent à imager directement les détails fins de la structure mitochondriale, de la distribution des protéines à l’échelle nanométrique et de la dynamique des crêtes, fournissant ainsi de nouvelles informations fondamentales qui relient les mitochondries à la santé et à la maladie humaines. Ce protocole présente l’utilisation de la microscopie à super-résolution à déplétion par émission stimulée (STED) pour visualiser l’ultrastructure mitochondriale de cellules vivantes de neuroblastome humain et de neurones primaires de rat. Cette procédure est organisée en cinq sections : (1) croissance et différenciation de la lignée cellulaire SH-SY5Y, (2) isolement, placage et croissance des neurones primaires de l’hippocampe du rat, (3) procédures de coloration des cellules pour l’imagerie STED vivante, (4) procédures pour les expériences STED sur cellules vivantes utilisant un microscope STED comme référence, et (5) conseils pour la segmentation et le traitement d’images à l’aide d’exemples pour mesurer et quantifier les caractéristiques morphologiques de la membrane interne.
Les mitochondries sont des organites eucaryotes d’origine endosymbiotique qui sont responsables de la régulation de plusieurs processus cellulaires clés, notamment le métabolisme intermédiaire et la production d’ATP, l’homéostasie ionique, la biosynthèse des lipides et la mort cellulaire programmée (apoptose). Ces organites sont topologiquement complexes, contenant un système à double membrane qui établit plusieurs sous-compartiments1 (Figure 1A). La membrane mitochondriale externe (OMM) interface avec le cytosol et établit des contacts inter-organites directs 2,3. La membrane mitochondriale interne (IMM) est une membrane d’économie d’énergie qui maintient des gradients d’ions stockés principalement sous forme de potentiel de membrane électrique (ΔΨm) pour piloter la synthèse d’ATP et d’autres processus nécessitant de l’énergie 4,5. L’IMM est subdivisée en membrane limite interne (IBM), qui est étroitement apprimée à l’OMM, et en structures saillantes appelées crêtes qui sont liées par la membrane des crêtes (CM). Cette membrane délimite le compartiment le plus interne de la matrice de l’espace intracristallin (ICS) et de l’espace intermembranaire (IMS).
Les mitochondries ont une morphologie dynamique basée sur des processus continus et équilibrés de fission et de fusion qui sont régis par des mécanoenzymes de la superfamille des dynamines6. La fusion permet une connectivité accrue et la formation de réseaux réticulaires, tandis que la fission conduit à la fragmentation mitochondriale et permet l’élimination des mitochondries endommagées par mitophagie7. La morphologie mitochondriale varie selon le type de tissu8 et le stade de développement9 et est régulée pour permettre aux cellules de s’adapter à des facteurs tels que les besoins énergétiques 10,11 et les facteurs de stress 12. Les caractéristiques morphométriques standard des mitochondries, telles que l’étendue de la formation du réseau (interconnectées ou fragmentées), le périmètre, la surface, le volume, la longueur (rapport hauteur/largeur), la rondeur et le degré de ramification, peuvent être mesurées et quantifiées par microscopie optique standard car les tailles de ces caractéristiques sont supérieures à la limite de diffraction de la lumière (~200 nm)13.
L’architecture des crêtes définit la structure interne des mitochondries (Figure 1B). La diversité des morphologies des crêtes peut être classée en deux grandes catégories : plates (lamellaires ou discoïdales) ou tubulaires-vésiculaires14. Toutes les crêtes se fixent à l’IBM par des structures tubulaires ou en forme de fente appelées jonctions de crêtes (CJ) qui peuvent servir à compartimenter l’IMS de l’ICS et l’IBM du CM15. La morphologie des crêtes est régulée par des complexes protéiques clés de l’IMM, y compris (1) le site de contact mitochondrial et le système d’organisation des crêtes (MICOS) qui réside au niveau des CJ et stabilise les contacts IMM-OMM 16, (2) la GTPase de l’atrophie optique 1 (OPA1) qui régule le remodelage des crêtes17,18,19, et (3) la F1FO ATP synthase qui forme des assemblages oligomères stabilisateurs aux extrémités des crêtes (CTs)20, Chapitre 21. De plus, l’IMM est enrichi en phospholipides non bicouches phosphatidyléthanolamine et cardiolipine qui stabilisent l’IMM22 très incurvé. Les crêtes sont également dynamiques, démontrant des changements morphologiques dans diverses conditions, telles que différents états métaboliques 23,24, avec différents substrats respiratoires 25, sous famine et stress oxydatif 26,27, avec apoptose28,29, et avec le vieillissement 30. Récemment, il a été démontré que les crêtes pouvaient subir des événements de remodelage majeurs sur une échelle de temps de quelques secondes, soulignant leur nature dynamique31. Plusieurs caractéristiques des crêtes peuvent être quantifiées, y compris les dimensions des structures à l’intérieur des crêtes individuelles (par exemple, la largeur CJ, la longueur et la largeur des crêtes) et les paramètres qui relient les cristas individuelles à d’autres structures (par exemple, l’espacement intra-crête et l’angle d’incidence des crêtes par rapport à l’OMM)32. Ces paramètres quantifiables montrent une corrélation directe avec la fonction. Par exemple, l’étendue de la production d’ATP mitochondrial est positivement liée à l’abondance des crêtes, quantifiée par la densité des crêtes ou le nombre de crêtes normalisé à une autre caractéristique (par exemple, les crêtes par zone OMM)33,34,35. Parce que la morphologie IMM est définie par des caractéristiques à l’échelle nanométrique, elle comprend une ultrastructure mitochondriale, qui nécessite des techniques d’imagerie qui fournissent une résolution supérieure à la limite de diffraction de la lumière. Comme décrit ci-dessous, ces techniques comprennent la microscopie électronique et la microscopie à super-résolution (nanoscopie).
Les cellules neurales et gliales du système nerveux central (SNC) sont particulièrement dépendantes de la fonction mitochondriale. En moyenne, le cerveau ne représente que 2 % du poids corporel total, mais utilise 25 % du glucose corporel total et représente 20 % de la consommation d’oxygène corporel, ce qui le rend vulnérable aux déficiences du métabolisme énergétique36. Les maladies neurodégénératives progressives (ND), notamment la maladie d’Alzheimer (MA), la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie de Huntington (MH), la sclérose en plaques (SEP) et la maladie de Parkinson (MP), sont parmi les pathologies les plus étudiées à ce jour, les efforts de recherche allant de la compréhension des fondements moléculaires de ces maladies à la recherche de prévention et d’interventions thérapeutiques potentielles. Les ND sont associés à une augmentation du stress oxydatif provenant en partie des espèces réactives de l’oxygène (ROS) générées par la chaîne de transport d’électrons mitochondriales (ETC)37, ainsi qu’à une altération de la manipulation du calcium mitochondrial 38 et du métabolisme des lipides mitochondriaux39. Ces altérations physiologiques s’accompagnent de défauts notés dans la morphologie mitochondriale qui sont associés à AD 40,41,42,43,44, ALS45,46, HD47,48,49, MS50 et 51,52,53. Ces défauts structurels et fonctionnels peuvent être couplés par des relations de cause à effet complexes. Par exemple, étant donné que la morphologie des crêtes stabilise les enzymes OXPHOS54, les ROS mitochondriaux ne sont pas seulement générés par l’ETC, mais ils agissent également pour endommager l’infrastructure dans laquelle réside l’ETC, favorisant un cycle ROS feed-forward qui améliore la susceptibilité aux dommages oxydatifs. De plus, il a été démontré que la désorganisation des crêtes déclenche des processus tels que la libération d’ADN mitochondrial (ADNmt) et les voies inflammatoires liées aux troubles auto-immuns, métaboliques et liés à l’âge55. Par conséquent, l’analyse de la structure mitochondriale est essentielle pour une compréhension complète des ND et de leurs fondements moléculaires.
Les méthodes populaires d’observation des crêtes, y compris la microscopie électronique à transmission, la tomographie électronique et la cryotomographie électronique (cryo-ET), et la tomographie à rayons X, en particulier la tomographie cryo-molle, ont révélé des résultats importants et des travaux avec une variété de types d’échantillons 56,57,58,59,60 . Malgré les progrès récents vers une meilleure observation de l’ultrastructure organellaire, ces méthodes s’accompagnent toujours de la mise en garde de nécessiter la fixation d’échantillons et, par conséquent, ne peuvent pas capturer directement la dynamique en temps réel des crêtes. La microscopie à fluorescence à super-résolution, en particulier sous la forme de la microscopie à illumination structurée (SIM), de la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM), de la microscopie de localisation photoactivée (PALM), de la microscopie à expansion (ExM) et de la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED), est devenue un moyen populaire de visualiser les structures nécessitant une résolution inférieure à la limite de diffraction qui contraint les méthodes classiques de microscopie optique. Lorsque l’ExM est utilisé en conjonction avec une autre technique de super-résolution, les résultats sont impressionnants, mais l’échantillon doit être fixé et coloré dans un gel61. En comparaison, SIM, PALM/STORM et STED ont tous été utilisés avec succès avec des échantillons vivants, et de nouveaux colorants prometteurs qui colorent généralement l’IMM fournissent une approche nouvelle et facile pour l’imagerie en direct de la dynamique des cristae mitochondriales 62,63,64,65,66. Les progrès récents dans les colorants vivants pour l’imagerie STED ont amélioré la luminosité et la photostabilité des colorants, et ces colorants ciblent l’IMM à un degré de spécificité plus élevé que leurs prédécesseurs. Ces développements permettent la collecte d’expériences à long terme en timelapse et en z-stack avec l’imagerie à super-résolution, ouvrant la porte à une meilleure analyse de l’ultrastructure et de la dynamique mitochondriales sur cellules vivantes.
Les protocoles d’imagerie des cellules vivantes des cellules SH-SY5Y indifférenciées et différenciées colorées avec le colorant PKmito Orange (PKMO) à l’aide de STED63 sont fournis. La lignée cellulaire SH-SY5Y est un dérivé trois fois sous-cloné de la lignée cellulaire parentale, SK-N-SH, générée à partir d’une biopsie de la moelle osseuse du neuroblastome métastatique67,68,69,70. Cette lignée cellulaire est un modèle in vitro couramment utilisé dans la recherche sur la ND, en particulier avec des maladies telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de Parkinson, dans lesquelles le dysfonctionnement mitochondrial est fortement impliqué 10,43,71,72,73. La capacité de différencier les cellules SH-SY5Y en cellules ayant un phénotype semblable à celui des neurones en manipulant des milieux de culture s’est avérée un modèle approprié pour la recherche en neurosciences sans s’appuyer sur des cellules neuronales primaires10,74. Dans ce protocole, de l’acide rétinoïque (AR) a été ajouté au milieu de culture cellulaire pour induire la différenciation des cellules SH-SY5Y. La polyarthrite rhumatoïde est un dérivé de la vitamine A et il a été démontré qu’elle régule le cycle cellulaire et favorise l’expression des facteurs de transcription qui régulent la différenciation neuronale75. Un protocole de culture et d’imagerie de cellules vivantes de neurones isolés de l’hippocampe du rat est également fourni. Il a été démontré que l’hippocampe est affecté par la dégénérescence mitochondriale et, avec le cortex, joue un rôle important dans le vieillissement et la ND 76,77,78,79,80.
Ce protocole présente l’utilisation de la lignée cellulaire SH-SY5Y du neuroblastome humain et des neurones primaires de l’hippocampe de rat avec le nouveau colorant PKMO ciblant l’IMM pour l’imagerie STED sur cellules vivantes. En raison de la nouveauté de PKMO, il y a actuellement peu de publications utilisant ce colorant pour l’imagerie STED en direct. L’utilisation de ces types de cellules pour l’imagerie STED pose des défis, en particulier parce que les cellules neuronales ont des mitochondries plus étroites. L’une des limites de ce protocole est le colorant PKMO utilisé, car il peut être toxique pour les cellules. Différentes cellules et lignées cellulaires réagissent différemment au colorant, de sorte qu’il peut être nécessaire d’ajuster la concentration du colorant et le temps d’incubation afin d’optimiser les résultats pour un signal fort sans endommager les cellules. Une solution suggérée est de réduire la concentration et d’augmenter le temps de coloration63 ; Cependant, cela peut entraîner une coloration plus médiocre sans augmenter la viabilité cellulaire.
À l’instar du PKMO, le colorant commercial Live Orange mito (Table of Materials) présente également une certaine toxicité cellulaire. Ce colorant a été utilisé pour une variété de cellules en culture, mais n’a pas été en mesure de présenter une coloration comparable dans les cellules SH-SY5Y différenciées par PR avec succès avec les mêmes paramètres que leurs homologues indifférenciés (nos observations non publiées). Cependant, des protocoles de coloration adaptés peuvent être optimisés pour cette sonde et les types de cellules choisis. Avec ce colorant, des temps de déclenchement du détecteur de 1-1,05 à 7-7,05 ns ont été utilisés, tous les autres paramètres du tableau 1 demeurant les mêmes. En général, la coloration des cellules avec 200-250 nM de mito d’orange vivante pendant 45 min a donné des résultats comparables à ceux des résultats de PKMO. Une coloration à concentration plus élevée pendant moins de temps ou une coloration à plus faible concentration pendant la même durée ou un peu plus longtemps peut donner des résultats différents et peut être favorable à d’autres types de cellules ou conditions de croissance.
L’imagerie des neurones primaires de l’hippocampe du rat diffère des cellules immortalisées en raison de la nature des projections axonales et dendritiques ainsi que de la distribution mitochondriale au moment de l’imagerie. L’une des difficultés de cette partie du protocole est que la densité de semis détermine si les cultures primaires seront en mesure d’adhérer et de croître sainement, et qu’à des densités plus élevées, les projections ont tendance à proliférer par le DIV 10. Par conséquent, les mitochondries imagées à partir de ces neurones primaires proviendront probablement du corps cellulaire et non des projections ; Cependant, une croissance réussie à partir d’une densité cellulaire de départ plus faible donne de meilleurs résultats d’imagerie à des périodes de croissance ultérieures. La clé est d’assurer un arrière-plan faible et une lumière floue pour obtenir le meilleur contraste pour STED. Pour répondre aux préoccupations concernant la population cellulaire, la culture de cellules primaires de l’hippocampe dans des milieux de croissance neuronaux supplémentés en vitamine B27 empêche la croissance des cellules gliales, et la source rapporte que <5 % des cellules sont des astrocytes et que l’absence de supplément de NbActiv1 dans le milieu de croissance réduit le nombre d’astrocytes dans les cultures à <2 %87. Pour les cellules SH-SY5Y en culture et les neurones primaires de l’hippocampe de rat, le revêtement PDL utilisé pour la croissance contribue à la brume de fond dans les images. Un rapport signal/bruit suffisant est obtenu avec les réglages indiqués dans le Tableau 1 et la déconvolution supprime la majeure partie du bruit de fond observé.
En plus de l’imagerie abordée ici, il est également possible d’ajouter des traitements ou du stress aux cellules avant ou pendant l’imagerie. Par exemple, l’ajout de peroxyde d’hydrogène tert-butyle (tBHP) induit un stress oxydatif, et il est possible de surveiller les changements dans les mitochondries au fil du temps après l’ajout. L’ajout d’β amyloïde (Aβ) avec un marqueur fluorescent permet de suivre la distribution de ce peptide par rapport aux mitochondries ainsi que la structure mitochondriale dans le temps. La santé mitochondriale a été fortement impliquée dans la maladie d’Alzheimer et est largement reconnue pour jouer un rôle dans la toxicité de l’Aβ 43,71,72. Notamment, l’état de différenciation des cellules SH-SY5Y affecte la localisation des précurseurs de la protéine Aβ (AβPP)85, et les expériences utilisant l’AβPP doivent être soigneusement construites.
À titre d’exemple de la façon dont ce protocole peut être adapté, il est montré que la variante fluorescente Aβ(1-42)-HiLyte 647 peut être ajoutée aux cellules colorées par PKMO 15 min avant l’imagerie (Figure supplémentaire 1). Les paramètres d’imagerie sont similaires (tableau supplémentaire 2), la principale différence étant qu’un sténopé plus petit est nécessaire pour l’imagerie de mitochondries plus étroites. L’imagerie de l’Aβ-HiLyte647 avec STED nécessite moins d’excitation globale (6 % à 8 %) et d’épuisement de STED (10 % à 12 %) de puissance laser et moins d’accumulations (six). Le déclenchement du détecteur est également étendu de 0,1 à 10 ns. Bien qu’il ne soit pas nécessaire d’obtenir une résolution de Aβ par STED, le rapport signal/bruit global et la taille des particules d’Aβ des STED brutes étaient meilleurs que ceux des images confocales, et une déconvolution ultérieure peut également être effectuée. La collecte d’images STED et la déconvolution des projections brutes de la pile Z STED de Aβ semblent particulièrement utiles lors de la fusion avec des images STED brutes ou déconvoluées STED de la coloration PKMO (Figure supplémentaire 1B,C). Les deux canaux ont été collectés en une seule étape. Des mesures de localisation en fonction du temps, similaires à celles énumérées à la figure 2 et illustrées à la figure 5, le cas échéant, et aux différences d’architecture des crêtes peuvent être obtenues après un traitement de contrainte ou d’autres ajouts.
D’autres méthodes possibles de double marquage dans les cellules vivantes STED des mitochondries qui ne sont pas rapportées ici mais qui ont été rapportées par d’autres incluent l’utilisation de protéines marquées SNAP93, de protéines marquées Halo et l’utilisation d’autres colorants perméables aux cellules avec des cibles génériques, telles que l’ADNmt63. Notamment, la stratégie de marquage de SNAP et de marquage Halo influence l’intensité et la longévité du signal de fluorescence qui en résulte lors de l’imagerie94. De plus, bien que ce protocole présente plusieurs exemples d’analyses qui peuvent être appliquées à des mitochondries segmentées, il existe de nombreuses autres analyses que les progiciels peuvent effectuer sur ces images.
The authors have nothing to disclose.
Les neurones primaires de l’hippocampe du rat ont été fournis par le Dr George Lykotrafitis et Shiju Gu du département de génie biomédical de l’Université du Connecticut (Storrs, CT, États-Unis). L’instrument Abberior STED hébergé dans l’installation de microscopie optique avancée du Center for Open Research Resources and Equipment a été acquis grâce à une subvention du NIH S10OD023618 attribuée à Christopher O’Connell. Cette recherche a été financée par une subvention du NIH R01AG065879 attribuée à Nathan N. Alder.
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
0.4% Trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red | Gibco | 15400054 | |
100 X antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens | Olympus | Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4 | |
All-trans-retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Amyloid-β (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg) | AnaSpec | AS-64161 | Other fluorescent conjugates available |
B27 supplement (50 X), serum free | Gibco | 17504044 | |
Cell Counter (Countess II FL) | Life Technologies | AMQAF1000 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804-R | |
Counter slides | Invitrogen | C10283 | |
Conical tubes (15 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
Cuvettes (Quartz Cells) | Starna Cells, Inc. | 9-Q-10 | Used with Spectrometer as described in Section 1.3 |
DMEM (high glucose with sodium pyruvate) | Gibco | 11995073 | Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1 |
DMEM (high glucose no sodium pyruvate) | Gibco | 11965092 | Used for primary cell materials as described in Section 2 |
DMEM (phenol red-free) | Gibco | 31053028 | Used for imaging as described in Section 3 |
DMSO | Sigma | D8418 | |
DNAase I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2 |
DPBS (no calcium, no magnesium) | Gibco | 14190144 | |
E18 Rat Hippocampus | Transnetyx Tissue | SDEHP | |
Ethanol (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP28184 | |
Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated | Gibco | 26140079 | For cultured cells, in Section 1 |
Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco | 10082147 | For primary cell culture, Section 2 |
Filter sterilization unit (0.1 µm, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 5660010 | |
FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in | — | — | Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text |
GlutaMAX supplement (100 X) | Gibco | 35050061 | Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2 |
Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers | Hausser Scientific | 267110 | |
HBSS (no calcium, no magnesium) | Gibco | 14170120 | Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2 |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10) | Scientific Volume Imaging (SVI) | — | The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5 |
IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus | Olympus | — | This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4 |
Lightbox software (V. 16.3.16118) | Abberior | — | Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4 |
Live Orange Mito dye | Abberior | LVORANGE-0146-30NMOL | Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion |
Neurobasal media | Gibco | 21103049 | Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2 |
Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass | Nunc | 155379 | Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5 |
Pasteur Pipets (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 22183632 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
PKmito Orange dye | Spirochrome | SC053 | |
Poly-D-lysine | Gibco | A3890401 | |
SH-SY5Y Cell line | ATCC | CRL2266 | |
Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | Used for primary cell materials described in Section 2 |
Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis) | Thermo Fisher Scientific | 840309000 | |
STED Expert Line microscope | Abberior | — | STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior’s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol |
T25 flask (TC-treated, filter cap) | Thermo Fisher Scientific | 156367 | Other culture vessels and sizes available |