JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

استخدام تصوير الخلايا الحية المنقولة جنسيا لتصور البنية التحتية للغشاء الداخلي للميتوكوندريا في نماذج الخلايا العصبية

Published: June 30, 2023
doi:
10.3791/65561
, , ,
1Center for Open Research Resources and Equipment,University of Connecticut, 2Department of Molecular and Cell Biology,University of Connecticut

Summary

يقدم هذا البروتوكول سير عمل لنشر وتمايز وتلطيخ خلايا SH-SY5Y المستزرعة والخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران لتصور وتحليل البنية الفوقية للميتوكوندريا باستخدام الفحص المجهري لاستنفاد الانبعاثات المحفزة (STED).

Abstract

تلعب الميتوكوندريا العديد من الأدوار الأساسية في الخلية ، بما في ذلك إنتاج الطاقة ، وتنظيم توازن الكالسيوم2+ ، والتخليق الحيوي للدهون ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). تأخذ هذه العمليات بوساطة الميتوكوندريا أدوارا متخصصة في الخلايا العصبية ، وتنسيق التمثيل الغذائي الهوائي لتلبية متطلبات الطاقة العالية لهذه الخلايا ، وتعديل إشارات Ca2+ ، وتوفير الدهون لنمو المحور العصبي وتجديده ، وضبط إنتاج ROS لتطوير الخلايا العصبية ووظيفتها. وبالتالي فإن ضعف الميتوكوندريا هو المحرك المركزي للأمراض التنكسية العصبية. يرتبط هيكل الميتوكوندريا ووظيفتها ارتباطا وثيقا. يحتوي الغشاء الداخلي المعقد شكليا مع الطيات الهيكلية المسماة cristae على العديد من الأنظمة الجزيئية التي تؤدي عمليات توقيع الميتوكوندريا. السمات المعمارية للغشاء الداخلي هي بنية فائقة ، وبالتالي ، أصغر من أن يتم تصورها بواسطة الفحص المجهري التقليدي المحدود الحيود. وبالتالي ، فإن معظم الأفكار حول البنية الفوقية للميتوكوندريا جاءت من المجهر الإلكتروني على عينات ثابتة. ومع ذلك ، فإن التقنيات الناشئة في الفحص المجهري الفلوري فائق الدقة توفر الآن دقة تصل إلى عشرات النانومتر ، مما يسمح بتصور ميزات البنية التحتية في الخلايا الحية. لذلك يوفر التصوير فائق الدقة قدرة غير مسبوقة على تصوير التفاصيل الدقيقة لبنية الميتوكوندريا وتوزيعات البروتين النانوية وديناميكيات cristae مباشرة ، مما يوفر رؤى أساسية جديدة تربط الميتوكوندريا بصحة الإنسان والمرض. يقدم هذا البروتوكول استخدام الفحص المجهري فائق الدقة لاستنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) لتصور البنية التحتية للميتوكوندريا لخلايا الورم الأرومي العصبي البشري الحي والخلايا العصبية الأولية للفئران. تم تنظيم هذا الإجراء في خمسة أقسام: (1) نمو وتمايز خط خلية SH-SY5Y ، (2) عزل وطلاء ونمو الخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران ، (3) إجراءات تلطيخ الخلايا للتصوير الحي للأمراض المنقولة جنسيا ، (4) إجراءات تجارب الخلايا الحية STED باستخدام مجهر STED كمرجع ، و (5) إرشادات للتجزئة ومعالجة الصور باستخدام أمثلة لقياس وقياس السمات المورفولوجية للغشاء الداخلي.

Introduction

الميتوكوندريا هي عضيات حقيقية النواة من أصل تكافلي داخلي مسؤولة عن تنظيم العديد من العمليات الخلوية الرئيسية ، بما في ذلك التمثيل الغذائي الوسيط وإنتاج ATP ، والتوازن الأيوني ، والتخليق الحيوي للدهون ، وموت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج). هذه العضيات معقدة طوبولوجيا ، وتحتوي على نظام غشاء مزدوج ينشئ مقصورات فرعية متعددة1 (الشكل 1 أ). يتفاعل غشاء الميتوكوندريا الخارجي (OMM) مع السيتوسول ويؤسس اتصالات مباشرة بين العضيات 2,3. غشاء الميتوكوندريا الداخلي (IMM) هو غشاء يحافظ على الطاقة يحافظ على التدرجات الأيونية المخزنة بشكل أساسي كجهد غشاء كهربائي (ΔΨm) لدفع تخليق ATP والعمليات الأخرى التي تتطلب الطاقة 4,5. ينقسم IMM أيضا إلى غشاء الحدود الداخلية (IBM) ، والذي يتم ضغطه بشكل وثيق على OMM ، والهياكل البارزة التي تسمى cristae المرتبطة بغشاء cristae (CM). يحدد هذا الغشاء حجرة المصفوفة الأعمق من الفضاء داخل الغشاء (ICS) والفضاء بين الأغشية (IMS).

تحتوي الميتوكوندريا على مورفولوجيا ديناميكية تعتمد على عمليات مستمرة ومتوازنة من الانشطار والاندماج التي تحكمها الإنزيمات الميكانيكية لعائلة الدينامينالفائقة 6. يسمح الاندماج بزيادة الاتصال وتشكيل الشبكات الشبكية ، في حين أن الانشطار يؤدي إلى تجزئة الميتوكوندريا ويمكن من إزالة الميتوكوندريا التالفة بواسطة الميتوفاجي7. يختلف مورفولوجيا الميتوكوندريا حسب نوع الأنسجة8 والمرحلةالتنموية 9 ويتم تنظيمها للسماح للخلايا بالتكيف مع العوامل بما في ذلك الاحتياجات النشطة 10,11 والضغوطات 12. يمكن قياس السمات المورفومترية القياسية للميتوكوندريا ، مثل مدى تكوين الشبكة (مترابطة مقابل مجزأة) ، والمحيط ، والمساحة ، والحجم ، والطول (نسبة العرض إلى الارتفاع) ، والاستدارة ، ودرجة التفرع ، وقياسها بواسطة المجهر الضوئي القياسي لأن أحجام هذه الميزات أكبر من حد حيود الضوء (~ 200 نانومتر) 13.

تحدد بنية Cristae البنية الداخلية للميتوكوندريا (الشكل 1 ب). يمكن تصنيف تنوع أشكال cristae على نطاق واسع على أنها مسطحة (رقائقي أو قرصي) أو أنبوبيحويصلي 14. يتم إرفاق جميع cristae في IBM من خلال هياكل أنبوبية أو تشبه الفتحة تسمى تقاطعات cristae (CJs) التي يمكن أن تعمل على تجزئة IMS من ICS و IBM من CM15. يتم تنظيم مورفولوجيا Cristae بواسطة مجمعات البروتين الرئيسية في IMM ، بما في ذلك (1) موقع اتصال الميتوكوندريا ونظام تنظيم cristae (MICOS) الموجود في CJs ويستقر اتصالات IMM-OMM16 ، (2) الضمور البصري 1 (OPA1) GTPase الذي ينظم إعادة تشكيل cristae17،18،19 ، و (3) F1FO ATP سينسيز الذي يشكل تجميعات قليلة القسيمات المثبتة عند أطراف cristae (CTs)20 ، 21. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إثراء IMM في الدهون الفوسفاتية غير ثنائية الطبقة فوسفاتيديل إيثانولامين وكارديوليبين التي تعمل على استقرار IMM22 المنحني للغاية. Cristae هي أيضا ديناميكية ، مما يدل على التغيرات المورفولوجية في ظل ظروف مختلفة ، مثل حالات التمثيل الغذائي المختلفة 23,24 ، مع ركائز تنفسية مختلفة 25 ، تحت الجوع والإجهاد التأكسدي 26,27 ، مع موت الخلايا المبرمج 28,29 ، ومع الشيخوخة 30. لقد ثبت مؤخرا أن cristae يمكن أن يخضع لأحداث إعادة عرض رئيسية على مقياس زمني من الثواني ، مما يؤكد طبيعتها الديناميكية31. يمكن قياس العديد من ميزات cristae ، بما في ذلك أبعاد الهياكل داخل cristae الفردية (على سبيل المثال ، عرض CJ وطول crista والعرض) والمعلمات التي تربط crista الفردية بالهياكل الأخرى (على سبيل المثال ، التباعد داخل cristae وزاوية حادث cristae بالنسبة إلى OMM)32. تظهر معلمات cristae القابلة للقياس الكمي ارتباطا مباشرا بالوظيفة. على سبيل المثال ، يرتبط مدى إنتاج ATP للميتوكوندريا بشكل إيجابي بوفرة cristae ، ويتم قياسه كميا ككثافة cristae أو رقم cristae طبيعي لميزة أخرى (على سبيل المثال ، cristae لكل منطقة OMM)33،34،35. نظرا لأن مورفولوجيا IMM يتم تعريفها من خلال ميزات المقياس النانوي ، فإنها تشتمل على بنية فائقة للميتوكوندريا ، والتي تتطلب تقنيات تصوير توفر دقة أكبر من حد حيود الضوء. كما هو موضح أدناه ، تشمل هذه التقنيات المجهر الإلكتروني والمجهر فائق الدقة (الفحص النانوي).

تعتمد الخلايا العصبية والدبقية في الجهاز العصبي المركزي (CNS) بشكل خاص على وظيفة الميتوكوندريا. في المتوسط ، يشكل الدماغ 2٪ فقط من إجمالي وزن الجسم ، ولكنه يستخدم 25٪ من إجمالي الجلوكوز في الجسم ويمثل 20٪ من استهلاك الأكسجين في الجسم ، مما يجعله عرضة لضعف استقلاب الطاقة36. تعد الأمراض التنكسية العصبية التقدمية (NDs) ، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) ، والتصلب الجانبي الضموري (ALS) ، ومرض هنتنغتون (HD) ، والتصلب المتعدد (MS) ، ومرض باركنسون (PD) ، من أكثر الأمراض التي تمت دراستها على نطاق واسع حتى الآن ، مع جهود بحثية تتراوح من فهم الأسس الجزيئية لهذه الأمراض إلى البحث عن الوقاية والتدخلات العلاجية المحتملة. ترتبط NDs بزيادة الإجهاد التأكسدي الذي ينشأ جزئيا من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) الناتجة عن سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا (ETC) 37 ، بالإضافة إلى معالجة الكالسيوم الميتوكوندرياالمتغيرة 38 واستقلاب الدهون في الميتوكوندريا39. هذه التغيرات الفسيولوجية مصحوبة بعيوب ملحوظة في مورفولوجيا الميتوكوندريا المرتبطة ب AD 40،41،42،43،44 ، ALS45،46 ، HD 47،48،49 ، MS50 ، و PD 51،52،53. يمكن أن تقترن هذه العيوب الهيكلية والوظيفية بعلاقات معقدة بين السبب والنتيجة. على سبيل المثال ، بالنظر إلى أن مورفولوجيا cristae تعمل على استقرار إنزيمات OXPHOS54 ، فإن أنواع الأكسجين التفاعلية للميتوكوندريا لا يتم إنشاؤها بواسطة ETC فحسب ، بل تعمل أيضا على إتلاف البنية التحتية التي توجد فيها مجموعة الاتصالات في حالات الطوارئ ، مما يعزز دورة التغذية إلى الأمام ROS التي تعزز التعرض للضرر التأكسدي. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن عدم تنظيم cristae يؤدي إلى عمليات مثل إطلاق الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) والمسارات الالتهابية المرتبطة باضطرابات المناعة الذاتية والتمثيل الغذائي والاضطرابات المرتبطة بالعمر55. لذلك ، فإن تحليل بنية الميتوكوندريا هو المفتاح لفهم كامل ل NDs وأسسها الجزيئية.

كشفت الطرق الشائعة لعرض cristae ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني النافذ ، والتصوير المقطعي الإلكتروني والتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد (cryo-ET) ، والتصوير المقطعي بالأشعة السينية ، ولا سيما التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة بالتبريد ، عن نتائج مهمة وتعمل مع مجموعة متنوعة من أنواع العينات56،57،58،59،60. على الرغم من التطورات الحديثة نحو مراقبة أفضل للبنية الفائقة للعضيات ، لا تزال هذه الطرق تأتي مع تحذير من طلب تثبيت العينة ، وبالتالي ، لا يمكنها التقاط ديناميكيات cristae في الوقت الفعلي مباشرة. أصبح الفحص المجهري الفلوري فائق الدقة ، لا سيما في أشكال الفحص المجهري للإضاءة الهيكلية (SIM) ، ومجهر إعادة البناء البصري العشوائي (STORM) ، والمجهر التعريفي المنشط ضوئيا (PALM) ، والمجهر التوسعي (ExM) ، والمجهر المستنفد للانبعاث المحفز (STED) ، طرقا شائعة لعرض الهياكل التي تتطلب دقة أقل من حد الحيود الذي يقيد الطرق الكلاسيكية للفحص المجهري الضوئي. عند استخدام ExM جنبا إلى جنب مع تقنية أخرى فائقة الدقة ، تكون النتائج مثيرة للإعجاب ، ولكن يجب تثبيت العينة وتلطيخها في هلام61. بالمقارنة ، تم استخدام كل من SIM و PALM / STORM و STED بنجاح مع العينات الحية ، وتوفر الأصباغ الجديدة والواعدة التي تلطخ IMM بشكل عام نهجا جديدا وسهلا للتصوير المباشر لديناميكيات الميتوكوندريا كريستاي62،63،64،65،66. أدت التطورات الحديثة في الأصباغ الحية للتصوير STED إلى تحسين سطوع الصبغة وثبات الضوء ، وتستهدف هذه الأصباغ IMM بدرجة أعلى من الخصوصية من سابقاتها. تسمح هذه التطورات بجمع تجارب الفاصل الزمني طويل الأجل و z-stack مع التصوير فائق الدقة ، مما يفتح الباب أمام تحليل أفضل للخلايا الحية للبنية الفائقة للميتوكوندريا وديناميكياتها.

هنا ، يتم توفير بروتوكولات لتصوير الخلايا الحية لخلايا SH-SY5Y غير المتمايزة والمتمايزة الملطخة بصبغة PKmito Orange (PKMO) باستخدام STED63. خط خلية SH-SY5Y هو مشتق مستنسخ ثلاث مرات من خط الخلية الأبوية ، SK-N-SH ، تم إنشاؤه من خزعة نخاع العظم للورم الأرومي العصبي النقيلي67،68،69،70. هذا الخط الخلوي شائع الاستخدام في نموذج المختبر في أبحاث ND ، خاصة مع أمراض مثل AD و HD و PD ، حيث يكون خلل الميتوكوندريا متورطا بشكل كبير10،43،71،72،73. أثبتت القدرة على تمييز خلايا SH-SY5Y إلى خلايا ذات نمط ظاهري يشبه الخلايا العصبية من خلال التلاعب بوسائط الثقافة نموذجا مناسبا لأبحاث علم الأعصاب دون الاعتماد على الخلايا العصبية الأولية10,74. في هذا البروتوكول ، تمت إضافة حمض الريتينويك (RA) إلى وسط زراعة الخلايا للحث على تمايز خلايا SH-SY5Y. التهاب المفاصل الروماتويدي هو أحد مشتقات فيتامين أ وقد ثبت أنه ينظم دورة الخلية ويعزز التعبير عن عوامل النسخ التي تنظم التمايز العصبي75. كما يتم توفير بروتوكول لزراعة وتصوير الخلايا الحية للخلايا العصبية المعزولة من قرن آمون الفئران. لقد ثبت أن الحصين يتأثر بانحطاط الميتوكوندريا ، ويلعب ، جنبا إلى جنب مع القشرة ، دورا مهما في الشيخوخة و ND76،77،78،79،80.

Protocol

1. انتشار وتمايز خلايا SH-SY5Y تحضير الوسائط لنمو الخلايا وصيانتهاتحضير وسط النسر المعدل الكامل عالي الجلوكوز من Dulbecco (DMEM ، 4.5 جم / لتر D-glucose ، 4 mM L-glutamine ، 110 mg / L Peruvate الصوديوم) المكمل بمضاد حيوي ومضاد حيوي نهائي بنسبة 1٪ (v / v) (10000 وحدة / مل من البنسلين ، 10000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 25 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين B) ، وكميات متفاوتة من مصل الجنين البقري (FBS) (انظر جدول المواد). تختلف مبالغ FBS في وسائط التمايز بين 10٪ أو 5٪ أو 2٪ (v / v) FBS. صيانة الخلاياالحفاظ على الخلايا في DMEM مع استكمال 10٪ (v / v) FBS ووضعها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، ثم البذور في DMEM تحتوي على 5٪ (v / v) FBS للتمايز. تم تخزين مخزون الخلايا المجمدة في FBS مع 10٪ (v / v) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) عند 1-2 × 107 خلايا / مل. تحضير حمض الريتينويك (RA)قم بإذابة 7.51 مجم من جميع الترانس آر إيه (انظر جدول المواد) في 5 مل من الإيثانول الطازج بنسبة 95٪ للحصول على محلول مخزون 5 مللي مول. تحقق من التركيز مع الامتصاص عند 350 نانومتر (ɛ = 44300 M-1 cm-1) ، تم الحصول عليها من ورقة معلومات المنتج من بروتوكولالشركة المصنعة 81 ، باستخدام تخفيف محلول المخزون عند 5 ميكرومتر في الإيثانول. قم بتخزين مخزون 5 مللي متر محمي من الضوء عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أسابيع. إعداد بولي-D-ليسين لطلاء coverslipملاحظة: يوفر بروتوكول منتج poly-D-lysine (PDL) ، الموجود ضمن قسم المستندات والتنزيلات في موقع البائع82 ، معلومات لطلاء مجموعة متنوعة من أوعية الاستزراع.يتضمن هذا البروتوكول أحجاما تعتمد على وعاء ذو غرفتين بمساحة 4 سم2 لكل بئر مع قيعان زجاجية معقمة # 1.5 من البورسليكات (انظر جدول المواد). قم بتخفيف محلول مخزون PDL مرتين إلى 50 ميكروغرام / مل باستخدام برنامج PBS من Dulbecco (DPBS ؛ بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيوم).ملاحظة: غطاء الزجاج # 1.5 أو # 1.5H كلاهما سماكات مقبولة ، وهي ضرورية لجودة الصورة. ستؤدي السماكات الأخرى إلى حدوث انحراف كروي ويجب تجنبها. طلاء Coverslip مع PDLملاحظة: يمكن أن تتعرض أغطية الغطاء للأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 10-15 دقيقة في خزانة السلامة البيولوجية لمزيد من التعقيم.ضع 1.2 مل من محلول PDL 50 ميكروغرام / مل على كل بئر من أغطية الحجرة المعقمة في خزانة زراعة الخلايا واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. قم بإزالة محلول PDL واشطفه ثلاث مرات بالماء المقطر 3.6 مل. بعد الانتهاء من الغسيل النهائي ، اترك الحجرة المطلية تجف لمدة ساعتين معرضة للهواء قبل الشطف والاستخدام على الفور أو تخزينها بحاوية محكمة الغلق عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.ملاحظة: اشطف أغطية الغطاء جيدا لأن PDL الزائد يمكن أن يكون ساما للخلايا. تمايز خلايا SH-SY5Y مع التهاب المفاصل الروماتويديملاحظة: لا تستخدم الخلايا فوق المقطع 15. يتم تمرير الخلايا عند التقاء 80٪ -90٪. تختلف إجراءات التمايز ولكنها تتبع خطوات مماثلة. يتم الحصول على تمايز إضافي من الأورام البدائية العصبية إلى الخلايا العصبية الناضجة مع مزيد من العلاج بعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF)68،83،84،85 ، ولكن لم يتم إجراؤه في هذا البروتوكول.اختياري: قم بإنشاء خلايا لمدة 24 ساعة على الأقل قبل البذر على غطاء الزجاج. لتحضير الخلايا من المخزونات المجمدة ، قم بإذابة 1 مل من قارورة الخلايا المجمدة بسرعة وأضفها إلى 9 مل من الوسائط الدافئة مسبقا مع 10٪ FBS ، ثم قم بتدويرها لأسفل عند 350 × جم لمدة 10 دقائق (في درجة حرارة الغرفة) وتخلص من المادة الطافية لإزالة DMSO. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من الوسائط المسخنة مسبقا وخلايا البذور في دورق T-25. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -90٪ ، تمر الخلايا عن طريق عدها وبذرها للتمايز عند الاقتضاء.اليوم 0: خلايا البذور.قم بزرع الخلايا على غطاء زجاجي من المخزونات المجمدة أو قارورة عاملة. استخدم كثافة بذر 1.5 × 104 خلايا / سم2.ملاحظة: سيتطلب بئر واحد في غطاء زجاجي قياسي بغرفتين مع مساحة استزراع 4 سم2 6.0 × 104 خلايا. يجب أن تزرع الخلايا التي ستبقى غير متمايزة مع DMEM المكمل ب 10٪ (v / v) FBS ، ويجب أن يتم زرع الخلايا التي سيتم تمييزها باستخدام DMEM مع 5٪ (v / v) FBS. اليوم 1: ابدأ علاج تمايز التهاب المفاصل الروماتويدي.تحضير DMEM المكمل ب 5٪ (v / v) FBS ، 1٪ (v / v) مضاد حيوي مضاد حيوي ، وتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر RA أو إيثانول من نفس حجم المادة المضافة ليكون بمثابة التحكم في السيارة لإجراء التمايز هذا. قم بإزالة الوسائط الموجودة في غطاء الحجرة المستخدم للبذر ، واشطفه باستخدام 1x PBS ، وأضف DMEM الجديد إلى الآبار. اليوم 3: استبدل الوسائط بوسائط جديدة تحتوي على RA- أو الإيثانول.قم بإزالة الوسائط من اليوم الأول واستبدلها بوسائط جديدة مكملة ب 2٪ (v / v) FBS ، و 1٪ (v / v) مضاد حيوي مضاد حيوي ، وإما 10 ميكرومتر RA أو 95٪ إيثانول من نفس حجم المادة المضافة لتكون بمثابة التحكم في السيارة لإجراء التمايز هذا. قم بإزالة الوسائط الموجودة في غطاء الحجرة المستخدم للبذر ، واشطفها باستخدام 1x PBS ، وأضف وسائط جديدة إلى الآبار. يوم 6: إجراء تصوير الخلايا.ملاحظة: تختلف أوقات تمايز الخلايا حسب البروتوكول ، ولكن ستة أيام من التعرض لالتهاب المفاصل الروماتويدي كافية للحث على نمط ظاهري يشبه الخلايا العصبية في خلايا SH-SY5Y86.قم بإجراء التصوير المباشر ، مع التفاصيل في القسمين 3 و 4 (الشكل 2). 2. ثقافة الخلايا العصبية الحصين الفئران الأولية إعداد المواد لعزل الخلايا العصبية الحصين الفئران.تحضير DMEM المكمل الطازج.قم بتصفية وتعقيم خليط من DMEM (نسبة عالية من الجلوكوز ، بدون بيروفات الصوديوم) المكمل ب 10٪ (v / v) FBS المعطل بالحرارة ، و 1٪ (v / v) محلول بيروفات الصوديوم ، و 1٪ (v / v) البنسلين – الستربتومايسين (10000 وحدة / مل). يحفظ لمدة تصل إلى 2 أسابيع عند 4 درجات مئوية. تحضير وسائط نمو الخلايا العصبية المكملة الطازجة.قم بتصفية وتعقيم خليط من وسائط نمو الخلايا العصبية المكملة بمكمل B27 بنسبة 2٪ (v / v) ، و 0.25٪ (v / v) مكمل الجلوتامين ، و 1٪ (v / v) من البنسلين والستربتومايسين (انظر جدول المواد). يحفظ لمدة تصل إلى 2 أسابيع عند 4 درجات مئوية. تحضير ثقافة الخلايا العصبية الحصين الأولية.تحضير ثقافة الخلايا العصبية الحصين الأولية بعد العمل المنشورسابقا 87 ومن بروتوكول المنتج على موقع الشركة المصنعة الذي يتم من خلاله الحصول على قرن آمون الفئران E18 الذي تم تشريحه88 (انظر جدول المواد). ينتج عن هذا البروتوكول مجموعة عصبية في الغالب مع <2٪ من الخلايا النجمية.ملاحظة: سيتم استخدام وسائط السبات التي يتم شحن هذا النسيج بها للخطوات المستقبلية في هذا البروتوكول. لا تتخلص منه. تحضير المواد والوسائط لتفكك الأنسجة.قم بإشعال ماصة باستور لتقليل قطر الفتحة وتخزينها في ورق القصدير لمنع التلوث حتى الاستخدام. قم بتسخين DMEM المحضر ، ومحلول الملح المخزن 1X Hank (HBSS) ، ووسائط نمو الخلايا العصبية إلى 37 درجة مئوية. أضف 2 رقائق من DNAase مع ملاقط معقمة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أداء تفكك الأنسجة.قم بإزالة أكبر قدر ممكن من وسائط السبات التي يتم تخزين قرن آمون الفئران E18 المقسط فيها قدر الإمكان قبل وضع الأنسجة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على DNAase وحضنه لفترة وجيزة عند 37 درجة مئوية. أضف 900 ميكرولتر من 1X HBSS متبوعا ب 100 ميكرولتر من 0.5٪ تربسين. احتضان المنديل على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.ملاحظة: يمكن إزالة الألواح المطلية ب PDL من التخزين ووضعها في حاضنة حتى استخدامها خلال وقت الحضانة هذا. أداء تجانس الأنسجة وعد الخلايا.بعد الحضانة مع التربسين ، قم بإزالة الوسائط وإضافة 1 مل من وسائط السبات المسخنة مسبقا من الحمض النووي من الخطوة السابقة إلى الأنسجة وتجانسها مع ماصة باستور. ستبدو وسائل الإعلام مبهمة ثم واضحة تدريجيا مع استمرار التجانس. أضف الخلايا العصبية المنفصلة إلى أنبوب جديد يحتوي على 4 مل من DMEM المسخن مسبقا ثم عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا. أداء طلاء الخلايا ونمو الخلايا الأولية.خلايا الصفيحة بكثافة حوالي 1.65 × 104 خلايا / سم2 في DMEM. بالنسبة لغطاء زجاجي بغرفتين (4 سم 2) ، بذرة 65,000 – 70,000 خلية لكل بئر مع2 مل DMEM. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة2 ساعة قبل التحقق من الالتصاق. بمجرد أن تبدأ الخلايا في الالتصاق ، قم بإزالة 1 مل من الوسائط واستبدلها بنفس الحجم من وسائط السبات ، ثم حرك برفق للخلط. بمجرد خلط الوسائط ، كرر هذه العملية وقم بإزالة نصف الوسائط الموجودة واستبدلها بنفس الحجم من وسائط نمو الخلايا العصبية ، ثم اخلطها برفق.ملاحظة: يعتبر يوم الطلاء يوما في المختبر (DIV) 0 ، وتكون الخلايا جاهزة للتصوير عند DIV 7 (الشكل 2). 3. تحضير الخلايا لتصوير الخلايا الحية ملاحظة: يمكن أن تختلف أنواع الخلايا وأصلها (أي الخلايا المستزرعة والأولية) في متطلبات التلطيخ. انظر التقارير المنشورة لمزيد من التفاصيل62,63. تحضير PKmito البرتقالملاحظة: تم الإبلاغ عن الأصباغ الأخرى التي تلطخ IMM بشكل عام64،65،66 وهي متاحة تجاريا. PKMO هو الوحيد المستخدم في هذا البروتوكول.أعد تعليق مسحوق PKMO (انظر جدول المواد) في DMSO وفقا لتعليمات الشركة المصنعة89. نضح الوسائط من الخلايا واغسلها في وسائط خالية من الفينول الأحمر المسخن مسبقا. قم بإعداد مخزون من PKMO في DMEM المسخن مسبقا والخالي من الفينول الأحمر المكمل ب 2٪ (v / v) FBS أو 10٪ (v / v) اعتمادا على حالة التمايز ، HEPES إلى تركيز نهائي يبلغ 20 mM ، و 1٪ (v / v) مضاد حيوي مضاد حيوي قبل تلطيخ الخلايا باتباع تعليمات الشركة المصنعة. هذه التركيبة ، بدون PKMO ، هي وسائط تصوير الخلايا الحية. تلطيخ الخلايا مع PKMOاحتضان الخلايا بالصبغة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام وسائط تصوير الخلايا الحية ، وللغسيل النهائي احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2. أضف وسائط تصوير حية جديدة ومسخنة مسبقا. الخلايا جاهزة الآن للتصوير.ملاحظة: تضاف العلاجات الحادة (مثل الأدوية و / أو الضغوطات) ، عند استخدامها ، قبل التصوير الحي. انظر قسم المناقشة والشكل التكميلي 1. 4. تصوير الخلايا الحية بواسطة المجهر STED ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول نظام STED مبني حول مجهر مقلوب ، مع النظام المحدد في جدول المواد. تم تجهيز هذا النظام بليزر إثارة نابض (ليزر 561 نانومتر بقوة اسمية ~ 300 ميكروواط) وليزر استنفاد نابض 775 نانومتر STED (الطاقة الاسمية 1.2 واط) ، ماسح ضوئي galvano قابل للتعديل باستمرار ، وكاشف الصمام الثنائي الضوئي للانهيار الجليدي القائم على مرشح 615/20 نانومتر (APD). يتم استخدام عدسة غمر الزيت 100x / 1.40 ل STED هنا. يستخدم برنامج Lightbox للحصول على الصور. ترتبط جميع التفاصيل المقدمة مباشرة بهذا البرنامج وإعداد النظام. إرشادات وخطوات عامة للتصويراستخدم حاضنة على سطح المسرح أو غرفة بيئية للحفاظ على صلاحية الخلية ، ولكن تجارب درجة حرارة الغرفة قصيرة المدى مقبولة أيضا. هذه الخطوات خاصة بإعداد STED الموضح أعلاه. حدد مجموعات الليزر والمرشحات للتصوير.استخدم معلمات الصبغة البرتقالية عن طريق اختيار الصبغة (الصبغات) المستخدمة في التلوين من قائمة الصبغ ، أو الصبغة ذات الخصائص الطيفية الأقرب إلى الصبغة (الصبغات) المستخدمة. اجعلها نشطة بالنقر المزدوج أو سحبها إلى قائمة النماذج ، حيث تقول “اسحب الصبغة (الأصباغ) هنا”. حدد منطقة لتصويرها.في نظرة عامة ، قم بإنشاء منطقة اهتمام (ROI) حول الميتوكوندريا ذات الأهمية عن طريق تحديد زر عائد الاستثمار المستطيل والنقر والسحب لتشكيل المنطقة. يمكن تغيير حجم عائد الاستثمار وتدويره باستخدام زوايا عائد الاستثمار أو الحواف المنحنية التي تظهر أثناء تحريك الماوس فوق زاوية.ملاحظة: يمكن العثور على ملخص لمعلمات التصوير المقترحة في الجدول 1. تم تعديل هذه المعلمات تجريبيا باستخدام تلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا لإعداد STED ومجموعةالصبغة 63. إعداد البوابة.بجوار القائمة عام ، حدد القائمة Gating أو انقر مع الاستمرار لإضافة القائمة إلى طريقة العرض. يوصى بتعديل بوابة كاشف STED إلى 1-1.05 إلى 7.8-7.85 نانوثانية ، كما هو موضح هنا. يمكن أن تختلف أوقات البوابات وتكون قصيرة من 1-1.05 إلى 7-7.05 نانوثانية. اضبط الشدة بشكل مناسب وفقا للعينة.ملاحظة: بشكل عام ، تبلغ قوة الإثارة المستخدمة في الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي 2-3 أضعاف الطاقة المستخدمة في التركيز ، لذلك يمكن للعينة التي تتطلب طاقة ليزر إثارة بنسبة 5٪ للبؤر البؤري استخدام طاقة ليزر إثارة بنسبة 10٪ -15٪ أثناء اكتساب الأمراض المنقولة جنسيا.اضبط ليزر الإثارة ل STED على 15٪ -20٪ وليزر استنفاد STED على 20٪ -25٪ مع تراكمات 10 خطوط. استخدم وقت سكون بكسل يبلغ 4 ميكرو ثانية بحجم بكسل 20-25 نانومتر. تم الاحتفاظ بالثقب عند 1.0 AU للخلايا المستزرعة و 0.7 AU لخلايا الحصين الأولية للفئران من أجل تحسين التقسيم البصري في الميتوكوندريا الأكثر كثافة.ملاحظة: يمكن الحصول على كل من الصور البؤرية وصور الأمراض المنقولة جنسيا للمقارنة جنبا إلى جنب (الشكل 3 أ ، ب ، الشكل 4 أ) أو يمكن الحصول على الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي فقط. معلومات إضافية عن السلاسل الزمنية/السلسلة zحدد السلسلة الزمنية.حدد القائمة المنسدلة الوقت. حدد عدد التكرارات (5 المستخدمة هنا) والفاصل الزمني (25 أو 30 ثانية المستخدمة هنا) المطلوبة للفاصل الزمني (الشكل 3C ، D ، الشكل 4B).ملاحظة: إذا كان الفاصل الزمني أقصر من وقت الاستحواذ، فستستمر التكرارات دون أي تأخير. عند إجراء الفاصل الزمني ، يوصى بشدة باستخدام وحدة تركيز بؤري مثالية أو تتبع تركيز مماثل لتجنب الانحراف المحتمل. اضبط نطاق مستوى الصوت.اضبط نطاق وحدة التخزين z حسب الرغبة من خلال تمكين خيار Volume وضبط طرفي النطاق. كانت أحجام الخطوات المستخدمة في هذا البروتوكول للتصوير ثنائي الأبعاد 150-200 نانومتر. يمكن حساب حجم الخطوة الموصى به فيما يتعلق بأخذ عينات Nyquist المطلوبة لإزالة الالتفاف من الأمراض المنقولة جنسيا الخام باستخدام الأدوات عبر الإنترنت90.ملاحظة: يمكن أن تؤدي طاقة الليزر المستنفدة للأمراض المنقولة جنسيا وعدد الطائرات التي تم تصويرها إلى زيادة التبييض الضوئي للصبغة والتعرض للضوء للخلية إلى مستويات ضارة. تحقق من وجود علامات السمية الضوئية والتلف الضوئي بعد الاستحواذ. 5. أدوات المعالجة والتحليل للبنية الفوقية للميتوكوندريا ملاحظة: تعد معالجة الصور (أي إزالة الالتفاف) اختيارية ولكنها تستخدم عادة عند إنشاء صور STED وتحليلها للنشر. يقترح بشدة إزالة الالتفاف لتحسين التباين وتقليل الضوضاء من أجل التجزئة المثلى للمعيار الفردي ، كما هو موضح أدناه (الشكل 2). إزالة التفاف صورة الأمراض المنقولة جنسياملاحظة: يتم توفير البرنامج المستخدم لإزالة الالتفاف في هذا البروتوكول في جدول المواد.اضبط المعلمات المجهرية للصورة.ملاحظة: تأكد من إدخال بيانات تعريف المجهر بشكل صحيح في صورة المعلمات المجهرية. وهذا يشمل تصاعد معامل الانكسار المتوسط. وسط الغمر حجم بكسل الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث والنضوب ؛ وأي معلومات أخرى ذات صلة. يمكن حفظ القوالب التي تحتوي على هذه المعلمات لإعادة استخدامها. قم بإلغاء تعقيد الصور الأولية المنقولة جنسيا باستخدام خوارزمية البرنامج.يسمح الوصول إلى خوارزميات إزالة الالتفاف الآلية في برنامج إزالة الالتفاف بمعالجة صور إزالة الالتفاف بدون تدخل. حدد الزر Express واضبط نوع فك الالتفاف على سريع أو قياسي أو عدواني أو محافظ لدرجات متفاوتة من قوة الالتفاف. يتم عرض الصور التمثيلية باستخدام إزالة الالتفاف السريع مع الإعدادات العدوانية (الشكل 3 والشكل 4 والشكل 5). احفظ الصور من برنامج إزالة الالتفاف بتنسيق ICS2. لإزالة الالتفاف اليدوي ، قم بتنفيذ الخطوات التالية.باختصار ، عند إجراء فك الالتفاف اليدوي ، احفظ قوالب معالج فك الالتفاف من أجل الاتساق ولديك خيار تحميل قالب عند بدء تشغيل المعالج. استخدم معلومات دالة انتشار النقطة المقاسة (PSF) إذا تم إنشاؤها باستخدام إعداد الاستحواذ والمعلمات. قم بقص صورة STED الخام ، إذا لزم الأمر ، قبل أن يقوم برنامج إزالة الالتفاف بتثبيت الصورة تلقائيا. تسمح الوظائف الإضافية لحزم برامج إزالة الالتفاف بتعويض محدد لعناصر التصوير المحتملة مثل الانجراف الحراري والانحرافات اللونية. بعد ذلك ، قم بإنشاء مدرج تكراري لوغاريتمي لإجراء طرح الخلفية يدويا أو تلقائيا. حدد خوارزمية فك الالتفاف الكلاسيكية لتقدير الاحتمال الأقصى (CMLE).ملاحظة: بالنسبة لإزالة الالتفاف ، فإن القيم الأساسية التي يجب ضبطها هي عتبة نسبة الإشارة إلى الضوضاء وعدد التكرارات وعتبة الجودة. يمكن ضبط هذه القيم ، ويمكن معاينة إزالة الالتفاف لتحديد الإعدادات المثلى. تجزئة وتحليل الجسيماتملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول برنامج FIJI (Is Just ImageJ) ، وهو برنامج مفتوح المصدر (انظر جدول المواد)، للتجزئة والتحليل. تتوفر برامج أخرى مماثلة ، بما في ذلك CellProfiler و Icy و Ilastik و QuPath ، لهذه الأغراض.تحضير الصور للتجزئة.افتح صور STED الخام .obf أو ملفات .ics2 من برنامج فك الالتفاف بالانتقال إلى ملف → فتح أو النقر فوق الملفات وسحبها إلى شريط أدوات ImageJ. من هنا ، يمكن إجراء أي معالجة تجعل الصور أسهل في التقسيم قبل التجزئة. للحفاظ على اتساق التغييرات، قم بتسجيل الوظائف باستخدام المكونات الإضافية → وحدات الماكرو → تسجيل الأوامر الرئيسية ونسخها ولصقها في ماكرو جديد، من المكونات الإضافية → جديد → ماكرو. تأكد من تحديد الصورة المراد معالجتها قبل تشغيل الماكرو.ملاحظة: تتضمن التعديلات المقبولة عموما لتحديد الحجم والشكل الاقتصاص وإسقاط مكدس z وطرح الخلفية مع تعطيل التجانس. يجب إجراء التعديلات بشكل متسق بين الصور داخل مجموعة البيانات والإبلاغ عنها. ضبط إعدادات تجزئة Weka القابلة للتدريبملاحظة: تم نشر تفاصيل إضافية مع إرشادات خطوة بخطوة لاستخدام أداة التجزئة شبه الآلية وتحليلات المصب للميتوكوندريا91.افتح صور STED غير المعقدة في المكون الإضافي Trainable Weka Segmentation (TWS) 92 ، الموجود ضمن الإضافات → تجزئة → تجزئة Weka القابلة للتدريب. في إعدادات التجزئة، حدد التمويه الغاوسي وإسقاطات الغشاء وميزات مرشح سوبل . سمك الغشاء الافتراضي هو 1 ، وحجم رقعة الغشاء الافتراضي هو 19. قم بتسمية الفئة 1 أو 2 باسم “Cristae” والأخرى باسم “الخلفية” (الشكل 2). يمكن أيضا حفظ النماذج باستخدام زر حفظ المصنف . حدد مصنف التحميل لإعادة استخدام هذه الإعدادات للصور الأخرى. إجراء عمليات تتبع فئة TWS.استخدم أداة الخط أو الأشكال الأخرى لتمييز بعض المعايير أو الخلفية. يجب أن تتضمن بعض تحديدات الخلفية على الأقل مسافات بين cristae. ارسم خطا فوق الهيكل لتعيينه لأي من الفئتين ، ثم حدد الزر إضافة إلى على الجانب الأيمن إما للمعيار أو الخلفية. انقر نقرا مزدوجا فوق تتبع لإزالة البنية من تلك التسمية. أداء تدريب تصنيف TWS.حدد زر مصنف القطار على الجانب الأيسر لإنشاء خريطة بناء على المعلومات المقدمة إلى المكون الإضافي. يمكن تبديل تراكب الفئات المجزأة وإيقاف تشغيله باستخدام زر تبديل التراكب ، ويمكن ضبط عتامة التراكب في الإعدادات. يمكن إعادة تدريب المصنف بملصقات إضافية. بمجرد الرضا ، حدد الزر “الحصول على احتمال”. قياس الجسيمات.باستخدام خريطة احتمالية cristae ، قم بتحديد عتبة الصورة لإنشاء قناع ثم انتقل إلى تحليل → تحليل الجسيمات. بشكل عام ، يمكن استخدام نوع العتبة الافتراضية وتعديل النطاق لضمان حساب المعيار بالكامل. يمكن تعديل القياسات التي يوفرها تحليل الجسيمات عن طريق تحليل → تعيين القياسات.ملاحظة: يتم قياس وعرض أمثلة لمعلمات الحجم والشكل مثل المساحة والمحيط والدائرية ونسبة العرض إلى الارتفاع للمعيار بناء على القياسات المحددة (الشكل 2 ، الشكل 5 أ ، الجدول التكميلي 1). اختياري: حدد صورة STED الأولية بنفس أبعاد الصورة غير الملتوية وقم بتطبيق عائد الاستثمار من المدير ، ثم حدد القياس في مدير عائد الاستثمار للحصول على قيم الكثافة. الحصول على المؤامرات الخطية.تم إنشاء مخططات خطية من صور STED غير الملتوية. ارسم خطا متعدد النقاط ، واضبط سمك الخط على عرض عدة بكسل لمتوسط الضوضاء ، وقم بتحريك الخط ليناسب الميتوكوندريا (الشكل 2 ، الشكل 5 ب). يتم استخدام مخطط الخط الناتج الذي تم إنشاؤه لقياس المسافات من الذروة إلى الذروة للإبلاغ عن دورية وتوزيع cristae على نطاق معين.ملاحظة: بشكل متصل ، يمكن الإبلاغ عن كثافة cristae على أنها عدد cristae المستقل داخل منطقة معينة كما هو محدد عن طريق قياس الجزء الخارجي من الميتوكوندريا. يمكن تحديد منطقة الميتوكوندريا عن طريق تطبيق مرشح على الصورة غير الملتوية أو الخام STED لإنشاء قناع. تأكد من أن القناع يناسب بدقة الخطوط العريضة للميتوكوندريا قبل قياس المنطقة.

Representative Results

يصف هذا البروتوكول ظروف نمو الخلايا للخلايا المستزرعة والأولية مع التركيز على تصوير الخلايا الحية STED والتحليلات اللاحقة لكريستال الميتوكوندريا. يمكن جمع الإسقاطات التي تم إجراؤها باستخدام ImageJ للميتوكوندريا من خلايا SH-SY5Y غير المتمايزة (الشكل 3A) وخلايا SH-SY5Y المتمايزة RA (الشكل 3B) كمداخن z مع البؤر التقليدية والأمراض المنقولة جنسيا ، ويمكن بعد ذلك فك الصور الأولية للأمراض المنقولة جنسيا. يمكن أيضا إجراء التصوير الفاصل الزمني وفك الالتفاف لاحقا (الشكل 3C ، D). باستخدام معلمات تصوير مختلفة قليلا للخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران (الجدول 1) ، يمكن الحصول على صور متحدة البؤر وخام STED كمداخن z ، ويمكن فك الصور الأولية للأمراض المنقولة جنسيا (الشكل 4 أ). التصوير الفاصل الزمني للميتوكوندريا من الخلايا العصبية الأولية ممكن أيضا (الشكل 4B). بشكل عام ، يجب أن تكون صور الفاصل الزمني قادرة على إظهار الأحداث الديناميكية للميتوكوندريا. عندما تظهر إسقاطات STED الخام و STED z-stack غير الملتوية من العينات المستخدمة للتجزئة متسقة ، يتم إجراء قياسات كمية. يستخدم المكون الإضافي TWS صورة STED غير المعقدة للتقسيم لإنشاء قناع احتمالية ، والذي يتم استخدامه بعد ذلك لإنشاء قناع ثنائي من cristae للحصول على معلمات الحجم والشكل (الشكل 5A). يتم حفظ المناطق من هذا القناع في مدير عائد الاستثمار ويمكن تطبيقها على صورة STED الأولية إذا رغبت في قياس الاختلافات في الكثافة النسبية. يمكن أيضا استخدام إسقاطات STED غير الملتوية لتحديد دورية cristae وكثافتها في منطقة معينة (الشكل 5B). الشكل 1: مورفولوجيا الميتوكوندريا. تحتوي الميتوكوندريا على نظام ثنائي الغشاء يحدد الأجزاء الفرعية المختلفة (A). Cristae هي طيات الغشاء الداخلي مع ميزات محددة (B). الاختصارات: OMM ، غشاء الميتوكوندريا الخارجي. ICS ، الفضاء داخل النص ؛ IMS ، الفضاء بين الأغشية ؛ CM ، غشاء كريستا. IBM ، غشاء الحدود الداخلية ؛ IMM ، غشاء الميتوكوندريا الداخلي. CT ، طرف كريستاي ؛ CJ ، تقاطع كريستاي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: رسم تخطيطي لسير العمل. تزرع خلايا SH-SY5Y أو الخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران على غطاء زجاجي مطلي ب PDL. تزرع خلايا SH-SY5Y بالتوازي لتبقى غير متمايزة أو تخضع لتمايز التهاب المفاصل الروماتويدي على مدار ستة أيام. نمت الخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران على غطاء زجاجي مطلي ب PDL بعد عزلها عن أقسام الحصين لمدة سبعة أيام. بمجرد أن تصبح جاهزة للتصوير ، تم تلطيخ الخلايا ب PKMO وتصويرها بالأمراض المنقولة جنسيا. ثم يتم فك التفاف الصور الأولية المنقولة جنسيا ، وتتم معالجة الصور غير الملتوية في فيجي للحصول على قياسات الحجم والشكل ، مثل كثافة cristae والمساحة والمحيط والدائرية ونسبة العرض إلى الارتفاع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: تصوير الميتوكوندريا في خلايا SH-SY5Y. يتم عرض إسقاطات z-stack لصورة z-stack غير المتمايزة (على اليسار) و STED الخام (في الوسط) و Huygens غير المتمايزة STED (يمين) للميتوكوندريا من خلايا SH-SY5Y غير المتمايزة (A) و RA-DIFFERENTIATED (B) مع تلطيخ PKMO. يتم عرض فاصل زمني بفواصل زمنية مدتها 30 ثانية و 5 تكرارات لخلايا SH-SY5Y المتمايزة من قبل RA (C) مع توسيع المناطق المحددة (المربعات البيضاء) عند (D) باستخدام صور مقاسة لتلك المناطق دون استيفاء. قضبان المقياس: أ ، ب ، 250 نانومتر ؛ C ، D ، 1 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 4: تصوير الميتوكوندريا في الخلايا العصبية الحصينية الأولية للفئران. يتم عرض إسقاطات z-stack التمثيلية البؤرية (يسار) ، و STED الخام (في الوسط) ، و Huygens غير الملتوية STED (يمين) للميتوكوندريا من الخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران (A). يظهر فاصل زمني بفواصل زمنية مقدارها 25 s و5 تكرارات للميتوكوندريا في هذه الخلايا العصبية (ب). قضبان المقياس: A ، 250 نانومتر ؛ ب ، 1 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: معالجة صور STED غير الملتوية في ImageJ. يظهر الاستخدام التمثيلي للمكون الإضافي Trainable Weka Segmentation لقياس حجم وشكل cristae (A). من اليسار إلى اليمين ، يتم عرض الصور التالية: صورة STED غير الملتوية ، وخريطة الاحتمالات بناء على التجزئة من المكون الإضافي TWS ، والقناع من العتبة في FIJI باستخدام خريطة الاحتمالات كإدخال ، والقناع مع عائد الاستثمار المحدد ، وعائد الاستثمار المتراكب على صورة STED الأصلية غير الملتوية. ويمكن الاطلاع في الجدول التكميلي 1 على قياسات المساحة والمحيط والدائرية ونسبة العرض إلى الارتفاع الناتجة المقابلة لهذه الأجسام. يتم عرض مخطط خطي باستخدام صورة STED غير الملتوية لقياس المسافات من الذروة إلى الذروة كقراءة لكثافة cristae (B). قضبان المقياس: 0.5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. حجم بكسل (نانومتر) وقت المكوث (μs) خط acc. إثارة 561 نانومتر أثناء الاستحواذ على STED (٪) 775 نانومتر قوة استنفاد STED (٪) حجم الخطوة (نانومتر) الثقب (أستراليا) الفاصل الزمني (الفترات الزمنية) التكرارات المتتابعة غير مختلف إغراء SH-SY5Y 20 4 10 15 20 200 1.0 30 5 RA-ديفير-نتيتيد SH-SY5Y 20-25 4 10-12 15 20-22 150-200 1.0 30 5 الخلايا العصبية الأولية 20-25 4 10 10 25 200 0.7 30 5 ملاحظة: يمكن أن يختلف حجم البكسل بناء على متطلبات التصوير والغرض من إلغاء التفاف الصور. مطلوب أخذ العينات المناسبة لإزالة الالتفاف. يمكن أن تصل أحجام البكسل لصور STED الخام بدون فك الالتفاف إلى 30 نانومتر. الجدول 1: موجز بارامترات اقتناء الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي. يتم عرض الإعدادات المستخدمة لتصوير 2D STED لكل نوع من أنواع الخلايا ، SH-SY5Y غير المتمايزة ، SH-SY5Y المتمايزة RA ، والخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران. لجميع الفترات المتتابعة ، تم أخذ 5 تكرارات بفواصل زمنية مختلفة بناء على حجم عائد الاستثمار. الشكل التكميلي 1: تصوير خلايا SH-SY5Y بإضافة β الأميلويد (Aβ). يتم عرض صور تمثيلية متحدة البؤر (يسار) و STED خام (وسط) و STED غير ملتف (يمين) لخلايا SH-SY5Y المتمايزة مع صبغة PKMO (أعلى) و Aβ-HiLyte647 (أسفل) (A). يتم عرض إسقاطات z-stack المدمجة ل PKMO STED الخام (الأخضر) مع Aβ STED الخام (أرجواني) (B) أو PKMO STED غير الملتوي (الأخضر) مع Aβ STED غير الملتوي (أرجواني) (C). قضبان المقياس: 0.5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الجدول التكميلي 1: قياسات الحجم والشكل للكريستا المجزأة. يتم عرض قياسات الحجم والشكل للمساحة (μm2) والمحيط (μm) والدائرية ونسبة العرض إلى الارتفاع ، المقابلة للكائنات الموضحة في الشكل 5A من الميتوكوندريا المجزأة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الجدول التكميلي 2: ملخص بارامترات الاكتساب مع عينات β الأميلويد. يتم عرض الإعدادات المستخدمة لتصوير 2D STED ل PKMO و Aβ-HiLyte647 في خلايا SH-SY5Y غير المتمايزة والمتمايزة RA. يمكن استخدام بؤر Aβ-HiLyte647 بمفرده حيث لا يوجد هيكل محدد لحله ؛ يتم عرض صور STED ل Aβ-HiLyte647 هنا لأحجام الجسيمات الأصغر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الملف التكميلي 1: بروتوكول علاج الأميلويد β. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

يقدم هذا البروتوكول استخدام خط خلايا الورم الأرومي العصبي البشري SH-SY5Y والخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران مع صبغة PKMO الجديدة التي تستهدف IMM لتصوير الخلايا الحية STED. نظرا لحداثة PKMO ، لا يوجد حاليا سوى القليل المنشور باستخدام هذه الصبغة للتصوير المباشر للأمراض المنقولة جنسيا. يشكل استخدام هذه الأنواع من الخلايا لتصوير الأمراض المنقولة جنسيا تحديات ، خاصة لأن الخلايا العصبية تحتوي على ميتوكوندريا أضيق. أحد قيود هذا البروتوكول هو صبغة PKMO المستخدمة ، لأنها يمكن أن تكون سامة للخلايا. تستجيب الخلايا وخطوط الخلايا المختلفة بشكل مختلف للصبغة ، وبالتالي ، قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات على تركيز الصبغة ووقت الحضانة لتحسين النتائج للحصول على إشارة قوية دون الإضرار بالخلايا. الحل المقترح هو خفض التركيز وزيادة وقت التلوين63 ؛ ومع ذلك ، قد يؤدي هذا إلى تلطيخ أكثر فقرا دون زيادة صلاحية الخلية.

على غرار PKMO ، تظهر الصبغة التجارية Live Orange mito (جدول المواد) أيضا بعض سمية الخلايا. تم استخدام هذه الصبغة لمجموعة متنوعة من الخلايا المستزرعة ولكنها لم تكن قادرة على إظهار تلطيخ مماثل في خلايا SH-SY5Y المتمايزة RA-MEN بنجاح مع نفس المعلمات مثل نظيراتها غير المتمايزة (ملاحظاتنا غير المنشورة). ومع ذلك ، يمكن تحسين بروتوكولات التلوين القابلة لهذا المسبار وأنواع الخلايا المختارة. مع هذه الصبغة ، تم استخدام أوقات بوابات الكاشف من 1-1.05 إلى 7-7.05 نانوثانية ، مع بقاء جميع المعلمات الأخرى في الجدول 1 كما هي. بشكل عام ، أسفرت خلايا التلوين التي تحتوي على 200-250 نانومتر ميتو برتقالي مباشر لمدة 45 دقيقة عن نتائج مماثلة كما أظهرت نتائج PKMO. يمكن أن يؤدي التلوين عالي التركيز لوقت أقل أو تلطيخ تركيز أقل لنفس الفترة الزمنية أو لفترة أطول قليلا إلى نتائج مختلفة وقد يكون مواتيا لأنواع الخلايا الأخرى أو ظروف النمو.

يختلف تصوير الخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران عن الخلايا الخالدة بسبب طبيعة إسقاطات المحور العصبي والتغصنات بالإضافة إلى توزيع الميتوكوندريا في وقت التصوير. تتمثل إحدى الصعوبات في هذا الجزء من البروتوكول في أن كثافة البذر تحدد ما إذا كانت الثقافات الأولية ستكون قادرة على الالتصاق والنمو بشكل صحي ، وعند الكثافات الأعلى ، تميل التوقعات إلى النمو الزائد بمقدار DIV 10. لذلك ، من المحتمل أن تأتي الميتوكوندريا المصورة من هذه الخلايا العصبية الأولية من جسم الخلية وليس من الإسقاطات. ومع ذلك ، فإن النمو الناجح من انخفاض كثافة الخلايا الأولية يعطي نتائج تصوير أفضل في أوقات النمو اللاحقة. المفتاح هو ضمان خلفية منخفضة وضوء خارج التركيز للحصول على أفضل تباين ل STED. لمعالجة المخاوف المتعلقة بعدد الخلايا ، فإن زراعة خلايا الحصين الأولية في وسائط نمو الخلايا العصبية المكملة ب B27 يمنع نمو الخلايا الدبقية ، ويفيد المصدر أن <5٪ من الخلايا هي خلايا نجمية وأن غياب مكمل NbActiv1 في وسائط النمو يقلل من عدد الخلايا النجمية في الثقافات إلى <2٪ 87. بالنسبة لكل من خلايا SH-SY5Y المستزرعة والخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران ، يساهم طلاء PDL المستخدم للنمو في ضباب الخلفية في الصور. يتم إنجاز إشارة كافية إلى الضوضاء مع الإعدادات المذكورة في (الجدول 1) وإزالة الالتفاف معظم الخلفية التي تمت ملاحظتها.

بالإضافة إلى التصوير المغطى هنا ، من الممكن أيضا إضافة علاجات أو إجهاد للخلايا قبل أو أثناء التصوير. على سبيل المثال ، تؤدي إضافة بيروكسيد الهيدروجين ثلاثي بوتيل (tBHP) إلى الإجهاد التأكسدي ، ومن الممكن مراقبة التغيرات في الميتوكوندريا بمرور الوقت بعد الإضافة. تسمح إضافة β الأميلويد (Aβ) بعلامة الفلورسنت بمراقبة توزيع هذا الببتيد فيما يتعلق بالميتوكوندريا وكذلك بنية الميتوكوندريا بمرور الوقت. كانت صحة الميتوكوندريا متورطة بشكل كبير في مرض الزهايمر وهي مدعومة على نطاق واسع للعب دور في سمية Aβ43،71،72. والجدير بالذكر أن حالة التمايز لخلايا SH-SY5Y تؤثر على توطين سلائف البروتين Aβ (AβPP)85 ، ويجب بناء التجارب باستخدام AβPP بعناية.

كمثال على كيفية تكييف هذا البروتوكول ، يظهر أنه يمكن إضافة المتغير الفلوري Aβ (1-42) -HiLyte 647 إلى الخلايا الملطخة ب PKMO قبل 15 دقيقة من التصوير (الشكل التكميلي 1). تتشابه معلمات التصوير (الجدول التكميلي 2) ، والفرق الرئيسي هو أن هناك حاجة إلى ثقب أصغر عند تصوير الميتوكوندريا الأضيق. يتطلب تصوير Aβ-HiLyte647 باستخدام STED إثارة إجمالية أقل (6٪ -8٪) واستنفاد STED (10٪ -12٪) طاقة ليزر وتراكمات أقل (ستة). يتم تمديد بوابة الكاشف أيضا من 0.1 إلى 10 نانوثانية. على الرغم من أن دقة STED ل Aβ ليست ضرورية ، إلا أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء الإجمالية وحجم جسيمات Aβ ل STED الخام كانت أفضل من تلك الموجودة في الصور متحدة البؤر ، ويمكن أيضا إجراء إزالة الالتفاف اللاحقة. يبدو أن جمع صور الأمراض المنقولة جنسيا وإسقاطات z-stack الأولية STED ل Aβ مفيدة بشكل خاص عند الاندماج مع صور STED الخام أو صور STED غير الملتوية لصبغة PKMO (الشكل التكميلي 1B ، C). تم جمع كلتا القناتين في خطوة إطار واحدة. يمكن الحصول على قياسات التوطين المعتمد على الوقت ، على غرار تلك المدرجة في الشكل 2 والموضحة في الشكل 5 ، عند الاقتضاء ، واختلافات بنية cristae بعد معالجة الإجهاد أو الإضافات الأخرى.

تشمل الطرق الأخرى الممكنة لوضع العلامات المزدوجة في الخلية الحية STED للميتوكوندريا التي لم يتم الإبلاغ عنها هنا ولكن تم الإبلاغ عنها من قبل الآخرين استخدام البروتينات الموسومةب SNAP 93 ، والبروتينات الموسومة بالهالة ، واستخدام أصباغ أخرى منفذة للخلايا ذات أهداف عامة ، مثل mtDNA63. والجدير بالذكر أن استراتيجية وضع العلامات الخاصة بوضع علامات SNAP و Halo تؤثر على شدة إشارة التألق الناتجة وطول العمر عند التصوير94. بالإضافة إلى ذلك ، بينما يقدم هذا البروتوكول العديد من الأمثلة على التحليلات التي يمكن تطبيقها على الميتوكوندريا المجزأة ، هناك العديد من التحليلات الأخرى التي يمكن أن تجريها حزم البرامج على هذه الصور.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم توفير الخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران من قبل الدكتور جورج ليكوترافيتيس وشيجو جو من قسم الهندسة الطبية الحيوية في جامعة كونيتيكت (ستورز ، كونيتيكت ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على أداة Abberior STED الموجودة في مرفق الفحص المجهري الضوئي المتقدم في مركز موارد ومعدات الأبحاث المفتوحة مع منحة المعاهد الوطنية للصحة S10OD023618 الممنوحة لكريستوفر أوكونيل. تم تمويل هذا البحث من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01AG065879 الممنوحة لناثان إن ألدر.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300054
0.4% Trypan blue Invitrogen T10282
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red Gibco 15400054
100 X antibiotic-antimycotic Gibco 15240062
100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens Olympus Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4
All-trans-retinoic acid Sigma R2625
Amyloid-β (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg) AnaSpec AS-64161 Other fluorescent conjugates available
B27 supplement (50 X), serum free Gibco 17504044
Cell Counter (Countess II FL) Life Technologies AMQAF1000
Centrifuge Eppendorf 5804-R
Counter slides Invitrogen C10283
Conical tubes (15 mL) Thermo Fisher Scientific 339650
Cuvettes (Quartz Cells) Starna Cells, Inc. 9-Q-10 Used with Spectrometer as described in Section 1.3
DMEM (high glucose with sodium pyruvate) Gibco 11995073 Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1
DMEM (high glucose no sodium pyruvate) Gibco 11965092 Used for primary cell materials as described in Section 2
DMEM (phenol red-free) Gibco 31053028 Used for imaging as described in Section 3
DMSO Sigma D8418
DNAase I from bovine pancreas Sigma DN25 Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2
DPBS (no calcium, no magnesium) Gibco 14190144
E18 Rat Hippocampus Transnetyx Tissue SDEHP
Ethanol (200 proof) Fisher Bioreagents BP28184
Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated Gibco 26140079 For cultured cells, in Section 1
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco 10082147 For primary cell culture, Section 2
Filter sterilization unit (0.1 µm, 500 mL) Thermo Fisher Scientific 5660010
FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in — — Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text
GlutaMAX supplement (100 X) Gibco 35050061 Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2
Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers Hausser Scientific 267110
HBSS (no calcium, no magnesium) Gibco 14170120 Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2
HEPES Gibco 15630080
Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10) Scientific Volume Imaging (SVI) — The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5
IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus Olympus — This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4
Lightbox software (V. 16.3.16118) Abberior — Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4
Live Orange Mito dye Abberior LVORANGE-0146-30NMOL Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion
Neurobasal media Gibco 21103049 Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2
Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass Nunc 155379 Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5
Pasteur Pipets (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 22183632
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
PKmito Orange dye Spirochrome SC053
Poly-D-lysine Gibco A3890401
SH-SY5Y Cell line ATCC CRL2266
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070 Used for primary cell materials described in Section 2
Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis) Thermo Fisher Scientific 840309000
STED Expert Line microscope Abberior — STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior’s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol
T25 flask (TC-treated, filter cap) Thermo Fisher Scientific 156367 Other culture vessels and sizes available
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Iovine, J. C., Claypool, S. M., Alder, N. N. Mitochondrial compartmentalization: emerging themes in structure and function. Trends in Biochemical Sciences. 46 (11), 902-917 (2021).
  2. Gupta, A., Becker, T. Mechanisms and pathways of mitochondrial outer membrane protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1862 (1), 148323 (2021).
  3. Gordaliza-Alaguero, I., Cantó, C., Zorzano, A. Metabolic implications of organelle-mitochondria communication. EMBO Reports. 20 (9), e47928 (2019).
  4. Klecker, T., Westermann, B. Pathways shaping the mitochondrial inner membrane. Open Biology. 11 (12), 210238 (2021).
  5. Navarro, A., Boveris, A. The mitochondrial energy transduction system and the aging process. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (2), C670-C686 (2007).
  6. Yu, R., Lendahl, U., Nistér, M., Zhao, J. Regulation of mammalian mitochondrial dynamics: opportunities and challenges. Frontiers in Endocrinology. 11, 374 (2020).
  7. Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. The Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
  8. Glancy, B., Kim, Y., Katti, P., Willingham, T. B. The functional impact of mitochondrial structure across subcellular scales. Frontiers in Physiology. 11, 541040 (2020).
  9. Bahat, A., et al. MTCH2-mediated mitochondrial fusion drives exit from naïve pluripotency in embryonic stem cells. Nature Communications. 9 (1), 5132 (2018).
  10. Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
  11. Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial fusion/fission dynamics in neurodegeneration and neuronal plasticity. Neurobiology of Disease. 90, 3-19 (2016).
  12. Zemirli, N., Morel, E., Molino, D. Mitochondrial dynamics in basal and stressful conditions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 564 (2018).
  13. Harwig, M. C., et al. Methods for imaging mammalian mitochondrial morphology: a prospective on mitograph. Analytical Biochemistry. 552, 81-99 (2018).
  14. Pánek, T., Eliáš, M., Vancová, M., Lukeš, J., Hashimi, H. Returning to the fold for lessons in mitochondrial crista diversity and evolution. Current Biology. 30 (10), R575-R588 (2020).
  15. Gottschalk, B., Madreiter-Sokolowski, C. T., Graier, W. F. Cristae junction as a fundamental switchboard for mitochondrial ion signaling and bioenergetics. Cell Calcium. 101, 102517 (2022).
  16. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  17. Frezza, C., et al. OPA1 controls apoptotic cristae remodeling independently from mitochondrial fusion. Cell. 126 (1), 177-189 (2006).
  18. Meeusen, S., et al. Mitochondrial inner-membrane fusion and crista maintenance requires the dynamin-related GTPase Mgm1. Cell. 127 (2), 383-395 (2006).
  19. Patten, D. A., et al. OPA1-dependent cristae modulation is essential for cellular adaptation to metabolic demand. The EMBO Journal. 33 (22), 2676-2691 (2014).
  20. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. The EMBO Journal. 21 (3), 221-230 (2002).
  21. Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  22. Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of nonbilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
  23. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of Cell Biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  24. Dlasková, A., et al. Mitochondrial cristae narrowing upon higher 2-oxoglutarate load. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1860 (8), 659-678 (2019).
  25. Pérez-Hernández, C. A., et al. Mitochondrial ultrastructure and activity are differentially regulated by glycolysis-, krebs cycle-, and microbiota-derived metabolites in monocytes. Biology. 11 (8), 1132 (2022).
  26. Mannella, C. A. Structural diversity of mitochondria: functional implications. Annals of the New York Academy of Sciences. 1147, 171-179 (2008).
  27. Plecitá-Hlavatá, L., Ježek, P. Integration of superoxide formation and cristae morphology for mitochondrial redox signaling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 31-50 (2016).
  28. Scorrano, L., et al. A distinct pathway remodels mitochondrial cristae and mobilizes cytochrome c during apoptosis. Developmental Cell. 2 (1), 55-67 (2002).
  29. Heath-Engel, H. M., Shore, G. C. Mitochondrial membrane dynamics, cristae remodelling and apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 549-560 (2006).
  30. Brandt, T., et al. Changes of mitochondrial ultrastructure and function during ageing in mice and Drosophilia. eLife. 6, e24662 (2017).
  31. Kondadi, A. K., et al. Cristae undergo continuous cycles of membrane remodelling in a MICOS-dependent manner. EMBO Reports. 21, e49776 (2020).
  32. Quintana-Cabrera, R., Mehrotra, A., Rigoni, G., Soriano, M. E. Who and how in the regulation of mitochondrial cristae shape and function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 94-101 (2018).
  33. Nielsen, J., et al. Plasticity in mitochondrial cristae density allows metabolic capacity modulation in human skeletal muscle: Enlarged mitochondrial cristae density in athletes. The Journal of Physiology. 595 (9), 2839-2847 (2017).
  34. Afzal, N., Lederer, W. J., Jafri, M. S., Mannella, C. A. Effect of crista morphology on mitochondrial ATP output: A computational study. Current Research in Physiology. 4, 163-176 (2021).
  35. Heine, K. B., Parry, H. A., Hood, W. R. How does density of the inner mitochondrial membrane influence mitochondrial performance. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (2), R242-R248 (2023).
  36. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
  37. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: a key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24, 1583 (2019).
  38. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  39. Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
  40. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
  41. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid beta-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (35), 13145-13150 (2008).
  42. Gan, X., et al. Inhibition of ERK-DLP1 signaling and mitochondrial division alleviates mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease cybrid cell. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1842 (2), 220-231 (2014).
  43. Baloyannis, S. J., Costa, V., Michmizos, D. Mitochondrial alterations Alzheimer’s disease. American Journal of Alzheimer’s Disease & Other Dementias. 19 (2), 89-93 (2004).
  44. Tillement, L., Lecanu, L., Papadopoulos, V. Alzheimer’s disease: Effects of β-amyloid on mitochondria. Mitochondrion. 11 (1), 13-21 (2011).
  45. Choi, S. Y., et al. C9ORF72-ALS/FTD-associated poly(GR) binds Atp5a1 and compromises mitochondrial function in vivo. Nature Neuroscience. 22 (6), 851-862 (2019).
  46. Smith, E. F., Shaw, P. J., De Vos, K. J. The role of mitochondria in amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 710, 132933 (2019).
  47. Costa, V., et al. Mitochondrial fission and cristae disruption increase the response of cell models of Huntington’s disease to apoptotic stimuli. EMBO Molecular Medicine. 2 (12), 490-503 (2010).
  48. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease: Mitochondrial and Huntington’s disease. The EMBO Journal. 31 (8), 1853-1864 (2012).
  49. Vanisova, M., et al. Mitochondrial organization and structure are compromised in fibroblasts from patients with Huntington’s disease. Ultrastructural Pathology. 46 (5), 462-475 (2022).
  50. de Barcelos, I. P., Troxell, R. M., Graves, J. S. Mitochondrial dysfunction and multiple sclerosis. Biology. 8 (2), 37 (2019).
  51. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441, 1157-1161 (2006).
  52. Meng, H., et al. Loss of Parkinson’s disease-associated protein CHCHD2 affects mitochondrial crista structure and destabilizes cytochrome c. Nature Communications. 8, 15500 (2017).
  53. Lu, L., et al. CHCHD2 maintains mitochondrial contact site and cristae organizing system stability and protects against mitochondrial dysfunction in an experimental model of Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 135 (13), 1588-1596 (2022).
  54. Cogliati, S., et al. Mitochondrial Cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  55. He, B., et al. Mitochondrial cristae architecture protects against mtDNA release and inflammation. Cell Reports. 41 (10), 111774 (2022).
  56. Polo, C. C., et al. Three-dimensional imaging of mitochondrial cristae complexity using cryo-soft X-ray tomography. Scientific Reports. 10, 21045 (2020).
  57. Rybka, V., et al. Transmission electron microscopy study of mitochondria in aging brain synapses. Antioxidants. 8 (6), 171 (2019).
  58. Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 542-548 (2006).
  59. Fry, M. Y., et al. In situ architecture of Opa1-dependent mitochondrial cristae remodeling. biorxiv. , (2023).
  60. Barad, B. A., Medina, M., Fuentes, D., Wiseman, R. L., Grotjahn, D. A. Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline. The Journal of Cell Biology. 222 (4), 202204093 (2023).
  61. Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 617 (2020).
  62. Yang, Z., et al. Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimize phototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging. Chemical Science. 11 (32), 8506-8516 (2020).
  63. Liu, T., et al. Multi-color live-cell STED nanoscopy of mitochondria with a gentle inner membrane stain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (52), e2215799119 (2022).
  64. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11, 3699 (2020).
  65. Zheng, S., et al. Long-term, super-resolution HIDE imaging of the inner mitochondrial membrane in live cells with a cell-permeant lipid probe. biorxiv. , (2022).
  66. Wang, C., et al. A photostable fluorescent marker for the superresolution live imaging of the dynamic structure of the mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15817-15822 (2019).
  67. Feles, S., et al. Streamlining culture conditions for the neuroblastoma cell line sh-sy5y: a prerequisite for functional studies. Methods and Protocols. 5 (4), 58 (2022).
  68. Shipley, M. M., Mangold, C. A., Szpara, M. L. Differentiation of the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line. Journal of Visualized Experiments. (108), e53193 (2016).
  69. Kovalevich, J., Langford, D., Amini, S., White, M. K. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Neuronal Cell Culture. 1078, 9-21 (2013).
  70. Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
  71. Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 62 (3), 1403-1416 (2018).
  72. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
  73. Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction in aging and alzheimer’s disease: strategies to protect neurons. Antioxidants & Redox Signaling. 9 (10), 1647-1658 (2007).
  74. Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
  75. Korecka, J. A., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PLoS ONE. 8 (5), e63862 (2013).
  76. Baghel, M. S., Thakur, M. K. Vdac1 downregulation causes mitochondrial disintegration leading to hippocampal neurodegeneration in scopolamine-induced amnesic mice. Molecular Neurobiology. 56 (3), 1707-1718 (2019).
  77. Jiang, S., et al. Mfn2 ablation causes an oxidative stress response and eventual neuronal death in the hippocampus and cortex. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 5 (2018).
  78. Mu, Y., Gage, F. H. Adult hippocampal neurogenesis and its role in Alzheimer’s disease. Molecular Neurodegeneration. 6, 85 (2011).
  79. Rao, Y. L., et al. Hippocampus and its involvement in Alzheimer’s disease: a review. 3 Biotech. 12 (2), 55 (2022).
  80. Weerasinghe-Mudiyanselage, P. D. E., Ang, M. J., Kang, S., Kim, J. -. S., Moon, C. Structural Plasticity of the hippocampus in neurodegenerative diseases. International Journal of Molecular Sciences. 23 (6), 3349 (2022).
  81. . Poly-D-Lysine Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401 (2023)
  82. Dravid, A., Raos, B., Svirskis, D., O’Carroll, S. J. Optimised techniques for high-throughput screening of differentiated SH-SY5Y cells and application for neurite outgrowth assays. Scientific Reports. 11, 23935 (2021).
  83. Hromadkova, L., et al. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) promotes molecular polarization and differentiation of immature neuroblastoma cells into definitive neurons. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1867 (9), 118737 (2020).
  84. Riegerová, P., et al. Expression and Localization of AβPP in SH-SY5Y cells depends on differentiation state. Journal of Alzheimer’s Disease. 82 (2), 485-491 (2021).
  85. Hoffmann, L. F., et al. Neural regeneration research model to be explored: SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Neural Regeneration Research. 18 (6), 1265-1266 (2022).
  86. Abiraman, K., Tzingounis, A. V., Lykotrafitis, G. K. Ca 2 channel localization and regulation in the axon initial segment. The FASEB Journal. 32 (4), 1794-1805 (2018).
  87. E18 Rat Hippocampus. Transnetyx Tissue Available from: https://tissue.transnetyx.com/E18-Rat-Hippocampus_4 (2023)
  88. Kmito ORANGE – Probe for live cell imaging of mitochondria. Spirochrome Available from: https://spirochrome.com/product/pkmito_orange/ (2023)
  89. Nyquist Calculator. Scientific Volume Imaging Available from: https://svi.nl/Nyquist-Calculator (2023)
  90. Segawa, M., et al. Quantification of cristae architecture reveals time-dependent characteristics of individual mitochondria. Life Science Alliance. 3 (7), e2019000620 (2020).
  91. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  92. Stephan, T., Roesch, A., Riedel, D., Jakobs, S. Live-cell STED nanoscopy of mitochondrial cristae. Scientific Reports. 9, 12419 (2019).
  93. Erdmann, R. S., et al. Labeling strategies matter for super-resolution microscopy: A comparison between HaloTags and SNAP-tags. Cell Chemical Biology. 26 (4), 584-592 (2019).

Tags

Live Cell ImagingSTED MicroscopyMitochondrial UltrastructureNeuronal Cell ModelsMitochondrial FunctionMitochondrial AgingCristae ArchitectureSuper-resolution MicroscopyNeurodegeneration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ng, E. L., Reed, A. L., O’Connell, C. B., Alder, N. N. Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models. J. Vis. Exp. (196), e65561, doi:10.3791/65561 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image