Eliminación selectiva de genes en el plexo coroideo
Summary
Aquí, describimos un método para alterar selectivamente las expresiones génicas en el plexo coroideo mientras se evita cualquier impacto en otras áreas del cerebro.
Abstract
El plexo coroideo (ChP) sirve como una puerta de entrada crítica para la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC) tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. Investigaciones recientes han demostrado que la regulación de la actividad de la CHP puede ofrecer protección contra los trastornos del SNC. Sin embargo, estudiar la función biológica de la ChP sin afectar a otras regiones cerebrales es un reto debido a su delicada estructura. Este estudio presenta un método novedoso para la eliminación de genes en el tejido ChP utilizando virus adenoasociados (AAV) o proteína recombinasa de la enzima de recombinación de ciclación (Cre) que consiste en la secuencia TAT (CRE-TAT). Los resultados demuestran que después de inyectar AAV o CRE-TAT en el ventrículo lateral, la fluorescencia se concentró exclusivamente en la ChP. Utilizando este enfoque, el estudio eliminó con éxito el receptor de adenosina A 2A (A2A R) en la ChP utilizando sistemas de ARN de interferencia (ARNi) o Cre/locus de X-overP1 (Cre/LoxP), y demostró que esta eliminación podría aliviar la patología de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Esta técnica puede tener implicaciones importantes para futuras investigaciones sobre el papel de la ChP en los trastornos del SNC.
Introduction
A menudo se pensaba que el plexo coroideo (ChP) ayudaba a mantener la homeostasis funcional del cerebro mediante la secreción de líquido cefalorraquídeo (LCR) y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)1,2. El aumento de la investigación en las últimas tres décadas ha revelado que la ChP representa una vía distinta para la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC).
Las uniones estrechas (TJs) de la ChP, compuestas por un epitelio ChP monocapa, mantienen la homeostasis inmunológica impidiendo que las macromoléculas y las células inmunitarias entren en el cerebro3. Sin embargo, bajo ciertas condiciones patológicas, el tejido ChP detecta y responde a patrones moleculares asociados al peligro (DAMPs) en el LCR y la sangre, lo que conduce a una infiltración inmune anormal y a una disfunción cerebral 4,5. A pesar de su papel crítico, el pequeño tamaño de la ChP y su ubicación única en el cerebro dificultan el estudio de su función sin afectar a otras regiones cerebrales. Por lo tanto, la manipulación de la expresión génica específicamente en la ChP es un enfoque ideal para comprender su función.
Inicialmente, las líneas transgénicas de enzimas de recombinación de ciclación (Cre), que expresan Cre bajo el control de promotores específicos de genes expresados en la ChP, se utilizaron comúnmente para eliminar genes diana mediante la cría con genes candidatos floxados 6,7,8. Por ejemplo, el factor de transcripción Forkhead box J1 (FoxJ1) se expresa exclusivamente en el epitelio ChP del cerebro prenatal del ratón7. Por lo tanto, la línea FoxJ1-Cre se utilizó a menudo para eliminar genes localizados en la ChP 6,9. Sin embargo, el éxito de esta estrategia depende en gran medida de la especificidad del promotor. Poco a poco se descubrió que el patrón de expresión de FoxJ1 no era lo suficientemente distintivo, ya que FoxJ1 también estaba presente en células epiteliales ciliadas en otras partes del cerebro y del sistema periférico7. Para superar esta limitación, se realizó una inyección intracerebroventricular (ICV) de Cre recombinasa para administrar recombinasa en los ventrículos de las líneas transgénicas floxadas. Esta estrategia mostró una alta especificidad, como lo demuestra la presencia de fluorescencia de tdTomato únicamente en el tejido ChP10,11. Sin embargo, este método todavía está limitado por la disponibilidad de líneas de ratones transgénicos floxed. Para abordar este problema, los investigadores han empleado la inyección de virus adenoasociados (AAV) en ICV para lograr la eliminación específica de ChP o la sobreexpresión de genes diana12,13. Una evaluación exhaustiva de diferentes serotipos de AAV para la infección por ChP reveló que AAV2/5 y AAV2/8 exhiben una fuerte capacidad de infección en la ChP, mientras que no infectan otras regiones cerebrales. Sin embargo, se encontró que AAV2/8 infectaba el epéndimo que rodea a los ventrículos, mientras que el grupo AAV2/5 no mostró infección14. Este método tiene la ventaja de superar las limitaciones de la adquisición de animales transgénicos floxados.
Este artículo describe un protocolo paso a paso para la eliminación de genes en la ChP utilizando dos métodos: ICV de AAV2/5 portador de shRNA del receptor de adenosina A 2A (A 2A R) y proteína recombinasa Cre que consiste en la recombinasa de secuencia TAT (CRE-TAT) para lograr la eliminación específica de ChP de A2A R. Los hallazgos del estudio sugieren que la reducción de A2AR en la ChP puede aliviar la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Este protocolo detallado proporciona una guía útil para los estudios de la función de ChP y la eliminación específica de genes en ChP.
Protocol
Representative Results
Discussion
La investigación presentó dos enfoques distintos para la eliminación dirigida de los genes ChP. El primer enfoque consistió en la inyección ICV de CRE-TAT, que contiene Cre recombinasa, en ratones A2AR flox/flox. El segundo abordaje consistió en la inyección de AAV2/5 portadora de ARNh de A2AR. Mediante la utilización de estas dos estrategias, el trabajo logró la eliminación selectiva de A 2A R dentro de la ChP y pudo demostrar los efectos protectores de la inhibición de la se?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención Nº 31800903, otorgada a W. Zheng) y del Proyecto de Ciencia y Tecnología de Wenzhou (Nº Y2020426, otorgado a Y. Y. Weng) para este trabajo.
Materials
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
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