脈絡叢における遺伝子の標的ノックダウン

脈絡叢(ChP)は、脳脊髄液(CSF)と脳由来神経栄養因子(BDNF)を分泌することにより、脳の機能的恒常性の維持に役立つと考えられていました^1,2。過去30年間にわたる研究の増加により、ChPが中枢神経系(CNS)への免疫細胞浸潤の明確な経路であることが明らかになりました。

単層ChP上皮からなるChPのタイトジャンクション(TJ)は、高分子や免疫細胞が脳に侵入するのを防ぐことで免疫ホメオスタシスを維持しています³。しかし、特定の病理学的条件下では、ChP組織はCSFおよび血液中の危険関連分子パターン(DAMP)を検出して応答し、異常な免疫浸潤および脳機能障害を引き起こします^4,5。ChPは重要な役割を担っているにもかかわらず、サイズが小さく、脳内のユニークな位置にあるため、他の脳領域に影響を与えずにその機能を研究することは困難です。したがって、ChPにおける遺伝子発現を特異的に操作することは、ChPの機能を理解するための理想的なアプローチです。

当初は、ChPに発現する遺伝子に特異的なプロモーターの制御下でCreを発現する環化組換え酵素(Cre)トランスジェニック株が、フロッサーした候補遺伝子と交配して標的遺伝子を欠失させるのが一般的であった^6,7,8。例えば、転写因子Forkhead box J1(FoxJ1)は、マウスの出生前脳^のChP上皮に排他的に発現している7。したがって、FoxJ1-Cre系統は、^ChP6,9に位置する遺伝子を欠失させるためにしばしば使用された。しかし、この戦略の成功は、プロモーターの特異性に大きく依存しています。FoxJ1は脳や末^{梢系の他の}部分の繊毛上皮細胞にも存在していたため、FoxJ1の発現パターンは十分に特徴的ではないことが徐々に発見されました7。この制限を克服するために、Creリコンビナーゼの脳室内(ICV)注射を実施して、フロッセ化されたトランスジェニック系統の心室にリコンビナーゼを送達しました。この戦略は、ChP組織のみにtdTomato蛍光が存在することからも明らかなように、高い特異性を示しました^10,11。しかし、この方法は、フロックス処理されたトランスジェニックマウス株の利用可能性によってまだ制限されています。この問題に対処するために、研究者はアデノ随伴ウイルス(AAV)のICV注射を使用して、ChP特異的ノックダウンまたは標的遺伝子の過剰発現を達成しました^12,13。ChP感染のさまざまなAAV血清型を包括的に評価したところ、AAV2/5およびAAV2/8はChPで強力な感染能力を示しますが、他の脳領域には感染しないことが明らかになりました。しかし、AAV2/8は脳室周囲の上衣に感染することがわかったのに対し、AAV2/5群は感染を示さなかった¹⁴。この方法は、フロッコスしたトランスジェニック動物を取得する際の限界を克服するという利点を有する。

本稿では、アデノシンA 2A受容体(A 2A R)のshRNAを運ぶAAV2/5のICVと、A_2A RのChP特異的ノックダウンを達成するためのTAT配列(CRE-TAT)リコンビナーゼからなるCreリコンビナーゼタンパク質の2つの方法を用いて、ChPにおける遺伝子ノックダウンの段階的なプロトコルについて説明します。この研究結果は、ChP中のA_2ARをノックダウンすることで、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を緩和できることを示唆しています。この詳しいプロトコルはChPの機能調査およびChPの遺伝子の特定の打撃に有用な指導を提供する。