הפלה ממוקדת של גנים במקלעת הכורואיד
Summary
במאמר זה אנו מתארים שיטה לשינוי סלקטיבי של ביטויי גנים במקלעת הכורואידים, תוך הימנעות מכל השפעה באזורים אחרים במוח.
Abstract
מקלעת הכורואיד (ChP) משמשת שער קריטי לחדירת תאי מערכת החיסון למערכת העצבים המרכזית (CNS) בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד. מחקרים אחרונים הראו כי ויסות פעילות ChP עשוי להציע הגנה מפני הפרעות במערכת העצבים המרכזית. עם זאת, חקר התפקוד הביולוגי של ChP מבלי להשפיע על אזורי מוח אחרים הוא מאתגר בשל המבנה העדין שלו. מחקר זה מציג שיטה חדשנית להפלה גנטית ברקמת ChP באמצעות וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) או חלבון רקומבינאז רקומבינאז (Cyclization recombination enzyme (Cre) המורכב מרצף TAT (CRE-TAT). התוצאות מראות כי לאחר הזרקת AAV או CRE-TAT לחדר הצידי, הפלואורסצנטיות התרכזה באופן בלעדי ב- ChP. באמצעות גישה זו, המחקר הפיל בהצלחה את קולטן אדנוזין A 2A (A2A R) ב- ChP באמצעות הפרעותRNA (RNAi) או Cre/locus של מערכות X-overP1 (Cre/LoxP), והראה כי הפלה זו יכולה להקל על הפתולוגיה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE). טכניקה זו עשויה להיות השלכות חשובות על מחקר עתידי על תפקיד ChP בהפרעות CNS.
Introduction
מקלעת הכורואיד (ChP) נחשבה לעתים קרובות כמסייעת בשמירה על הומאוסטזיס תפקודי במוח על ידי הפרשת נוזל מוחי שדרתי (CSF) וגורם נוירוטרופי מוחי (BDNF)1,2. מחקר הולך וגובר בשלושת העשורים האחרונים גילה כי ChP מייצג מסלול ברור לחדירת תאי מערכת החיסון למערכת העצבים המרכזית (CNS).
הצמתים הצפופים (TJs) של ChP, המורכבים מאפיתל ChP חד-שכבתי, שומרים על הומאוסטזיס חיסוני על ידי מניעת כניסת מקרומולקולות ותאי חיסון למוח3. עם זאת, בתנאים פתולוגיים מסוימים, רקמת ChP מזהה ומגיבה לדפוסים מולקולריים הקשורים לסכנה (DAMPs) ב- CSF ובדם, מה שמוביל לחדירה חיסונית חריגה ולתפקוד לקוי של המוח 4,5. למרות תפקידו הקריטי, גודלו הקטן של ה-ChP ומיקומו הייחודי במוח מקשים על חקר תפקודו מבלי להשפיע על אזורי מוח אחרים. לכן, מניפולציה של ביטוי גנים במיוחד ב- ChP היא גישה אידיאלית להבנת תפקידו.
בתחילה, קווים טרנסגניים של אנזים רקומבינציה מחזורית (Cre), המבטאים Cre תחת שליטתם של מקדמים ספציפיים לגנים המבוטאים ב- ChP, שימשו בדרך כלל למחיקת גני מטרה על ידי רבייה עם גנים מועמדים floxed 6,7,8. לדוגמה, גורם השעתוק תיבת Forkhead J1 (FoxJ1) מתבטא באופן בלעדי באפיתל ChP של מוח העכבר לפני הלידה7. לפיכך, קו FoxJ1-Cre שימש לעתים קרובות למחיקת גנים הממוקמים ChP 6,9. עם זאת, ההצלחה של אסטרטגיה זו מסתמכת במידה רבה על הספציפיות של המקדם. בהדרגה התגלה כי דפוס הביטוי של FoxJ1 אינו ייחודי מספיק, שכן FoxJ1 היה נוכח גם בתאי אפיתל ריסניים בחלקים אחרים של המוח והמערכת ההיקפית7. כדי להתגבר על מגבלה זו, בוצעה הזרקה תוך-מוחית (ICV) של Cre recombinase כדי להעביר רקומבינאז לחדרים של קווים טרנסגניים פלוקסים. אסטרטגיה זו הראתה ספציפיות גבוהה, כפי שמעידה נוכחות של פלואורסצנטיות tdTomato אך ורק ברקמת ChP10,11. עם זאת, שיטה זו עדיין מוגבלת על ידי הזמינות של קווי עכבר טרנסגניים floxed. כדי לטפל בבעיה זו, חוקרים השתמשו בהזרקת ICV של וירוס הקשור לאדנו (AAV) כדי להשיג הפלה ספציפית ל- ChP או ביטוי יתר של גני מטרה12,13. הערכה מקיפה של סרוטיפים שונים של AAV עבור זיהום ChP גילתה כי AAV2/5 ו- AAV2/8 מפגינים יכולות זיהום חזקות ב- ChP, בעוד שאינם מדביקים אזורי מוח אחרים. עם זאת, AAV2/8 נמצא כמדביק את האפנדימה סביב החדרים, בעוד שקבוצת AAV2/5 לא הראתה זיהום14. שיטה זו יש את היתרון של התגברות על המגבלות של רכישת בעלי חיים טרנסגניים floxed.
מאמר זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב להפלה גנטית ב- ChP באמצעות שתי שיטות: ICV של AAV2/5 הנושא shRNA של קולטן אדנוזין A 2A (A 2A R) וחלבון Cre recombinase המורכב מרקומבינאז רצף TAT (CRE-TAT) כדי להשיג הפלה ספציפית ל- ChP של A2A R. ממצאי המחקר מצביעים על כך שהפלת A2AR ב- ChP יכולה להקל על אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE). פרוטוקול מפורט זה מספק הדרכה שימושית למחקרי תפקוד ChP ולפירוק הספציפי של גנים ב- ChP.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר הציג שתי גישות שונות להפלה ממוקדת של גנים ChP. הגישה הראשונה כללה הזרקת ICV של CRE-TAT, המכיל Cre recombinase, לעכברי A2AR flox/flox. הגישה השנייה כללה הזרקת ICV של AAV2/5 הנושא shRNA של A2AR. על ידי שימוש בשתי אסטרטגיות אלה, העבודה השיגה את ההפלה הסלקטיבית של A 2A R בתוך ChP והצליחה להדגים את ההשפעות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים בהכרת תודה על תמיכתן של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס ‘31800903, שהוענק ל- W. Zheng) ופרויקט המדע והטכנולוגיה של וונג’ואו (מס ‘Y2020426, הוענק ל- Y. Y. Weng) על עבודה זו.
Materials
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
References
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35 (2020).
- Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
- Myung, J., et al. The choroid plexus is an important circadian clock component. Nature Communications. 9 (1), 1062 (2018).
- Zhang, Y., et al. A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).
- Johansson, P. A., et al. The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function. Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).
- Xu, H., et al. Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development. Nature Communications. 12 (1), 447 (2021).
- Spatazza, J., et al. Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity. Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).
- Zheng, W., et al. Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52 (2022).
- Steffensen, A. B., et al. Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation. Nature Communications. 9 (1), 2167 (2018).
- Zhu, L., et al. Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).
- Chen, X., et al. Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery. Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).
- Konsman, J. P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 6 (28), 827-828 (2003).
- Weaver, A., et al. An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization. FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5 (5), 4111 (2019).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Reboldi, A., et al. C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE. Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., et al. Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE. Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target. International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).
- Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 9, 193 (2012).
