ضربة قاضية مستهدفة للجينات في الضفيرة المشيمية
Summary
هنا ، نصف طريقة لتغيير التعبيرات الجينية بشكل انتقائي في الضفيرة المشيمية مع تجنب أي تأثير في مناطق الدماغ الأخرى.
Abstract
تعمل الضفيرة المشيمية (ChP) كبوابة حرجة لتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. أظهرت الأبحاث الحديثة أن تنظيم نشاط ChP قد يوفر الحماية ضد اضطرابات الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن دراسة الوظيفة البيولوجية ل ChP دون التأثير على مناطق الدماغ الأخرى أمر صعب بسبب هيكله الدقيق. تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة لضربة قاضية للجينات في أنسجة ChP باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAVs) أو بروتين إعادة التركيب الدائري (Cre) الذي يتكون من تسلسل TAT (CRE-TAT). تظهر النتائج أنه بعد حقن AAV أو CRE-TAT في البطين الجانبي ، كان التألق يتركز حصريا في ChP. باستخدام هذا النهج ، نجحت الدراسة في إسقاط مستقبل الأدينوزين A 2A (A2A R) في ChP باستخدام تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) أو Cre / locus لأنظمة X-overP1 (Cre / LoxP) ، وأظهرت أن هذه الضربة القاضية يمكن أن تخفف من أمراض التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE). قد يكون لهذه التقنية آثار مهمة على الأبحاث المستقبلية حول دور ChP في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي.
Introduction
غالبا ما كان يعتقد أن الضفيرة المشيمية (ChP) تساعد في الحفاظ على التوازن الوظيفي للدماغ عن طريق إفراز السائل النخاعي (CSF) وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) 1,2. كشفت الأبحاث المتزايدة على مدى العقود الثلاثة الماضية أن ChP يمثل مسارا متميزا لتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS).
تحافظ الوصلات الضيقة (TJs) ل ChP ، المكونة من ظهارة ChP أحادية الطبقة ، على التوازن المناعي عن طريق منع الجزيئات الكبيرة والخلايا المناعية من دخول الدماغ3. ومع ذلك ، في ظل ظروف مرضية معينة ، يكتشف نسيج ChP ويستجيب للأنماط الجزيئية المرتبطة بالخطر (DAMPs) في السائل الدماغي النخاعي والدم ، مما يؤدي إلى تسلل مناعي غير طبيعي وخلل وظيفي في الدماغ 4,5. على الرغم من دوره الحاسم ، فإن صغر حجم ChP وموقعه الفريد في الدماغ يجعل من الصعب دراسة وظيفته دون التأثير على مناطق الدماغ الأخرى. لذلك ، فإن معالجة التعبير الجيني على وجه التحديد في ChP هو نهج مثالي لفهم وظيفته.
في البداية ، كانت الخطوط المعدلة وراثيا لإنزيم إعادة التركيب الدائري (Cre) ، والتي تعبر عن Cre تحت سيطرة المروجين الخاصين بالجينات المعبر عنها في ChP ، تستخدم بشكل شائع لحذف الجينات المستهدفة عن طريق التكاثر بجينات مرشحة متخبطة6،7،8. على سبيل المثال ، يتم التعبير عن عامل النسخ Forkhead box J1 (FoxJ1) حصريا في ظهارة ChP لدماغ الفأرقبل الولادة 7. وهكذا ، غالبا ما تم استخدام خط FoxJ1-Cre لحذف الجينات الموجودة في ChP 6,9. ومع ذلك ، فإن نجاح هذه الاستراتيجية يعتمد بشكل كبير على خصوصية المروج. تم اكتشاف تدريجيا أن نمط تعبير FoxJ1 لم يكن مميزا بما فيه الكفاية ، حيث كان FoxJ1 موجودا أيضا في الخلايا الظهارية الهدبية في أجزاء أخرى من الدماغ والجهاز المحيطي7. للتغلب على هذا القيد ، تم إجراء حقن داخل الدماغ البطيني (ICV) من Cre recombinase لتوصيل recombinase إلى البطينين من الخطوط المعدلة وراثيا floxed. أظهرت هذه الاستراتيجية خصوصية عالية ، كما يتضح من وجود مضان tdTomato فقط في أنسجة ChP10,11. ومع ذلك ، لا تزال هذه الطريقة محدودة بسبب توفر خطوط الماوس المعدلة وراثيا. لمعالجة هذه المشكلة ، استخدم الباحثون حقن ICV للفيروس المرتبط بالغدي (AAV) لتحقيق ضربة قاضية خاصة ب ChP أو الإفراط في التعبير عن الجينات المستهدفة12,13. كشف تقييم شامل للأنماط المصلية المختلفة لعدوى AAV لعدوى ChP أن AAV2 / 5 و AAV2 / 8 يظهران قدرات عدوى قوية في ChP ، بينما لا يصيبان مناطق الدماغ الأخرى. ومع ذلك ، وجد أن AAV2 / 8 يصيب البطانة العصبية المحيطة بالبطينين ، في حين أن مجموعة AAV2 / 5 لم تظهر أي عدوى14. هذه الطريقة لها ميزة التغلب على قيود الحصول على الحيوانات المعدلة وراثيا.
توضح هذه المقالة بروتوكولا خطوة بخطوة لضربة قاضية للجين في ChP باستخدام طريقتين: ICV ل AAV2 / 5 الذي يحمل shRNA لمستقبل الأدينوزين A 2A (A 2A R) وبروتين Cre recombinase الذي يتكون من تسلسل TAT (CRE-TAT) RECOMBINASE لتحقيق ضربة قاضية خاصة ب ChP لA 2A R. تشير نتائج الدراسة إلى أن هدمA 2AR في ChP يمكن أن يخفف من التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE). يوفر هذا البروتوكول التفصيلي إرشادات مفيدة لدراسات وظائف ChP والضربة القاضية المحددة للجينات في ChP.
Protocol
Representative Results
Discussion
قدم البحث نهجين متميزين للضربة القاضية المستهدفة لجينات ChP. تضمن النهج الأول حقن ICV ل CRE-TAT ، الذي يحتوي على Cre recombinase ، في الفئرانA 2AR flox/ flox. أما النهج الثاني فينطوي على حقن القيمة المحلية ل AAV2/5 الذي يحمل الحمض النووي الريبوزي الريبي منA 2AR. من خلال استخدام هاتين الاستراتيجيتي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونعرب عن امتناننا للدعم المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31800903، الممنوحة ل W. Zheng) ومشروع ونتشو للعلوم والتكنولوجيا (رقم Y2020426، الذي منح إلى Y. Y. Weng) لهذا العمل.
Materials
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
References
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35 (2020).
- Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
- Myung, J., et al. The choroid plexus is an important circadian clock component. Nature Communications. 9 (1), 1062 (2018).
- Zhang, Y., et al. A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).
- Johansson, P. A., et al. The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function. Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).
- Xu, H., et al. Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development. Nature Communications. 12 (1), 447 (2021).
- Spatazza, J., et al. Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity. Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).
- Zheng, W., et al. Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52 (2022).
- Steffensen, A. B., et al. Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation. Nature Communications. 9 (1), 2167 (2018).
- Zhu, L., et al. Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).
- Chen, X., et al. Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery. Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).
- Konsman, J. P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 6 (28), 827-828 (2003).
- Weaver, A., et al. An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization. FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5 (5), 4111 (2019).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Reboldi, A., et al. C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE. Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., et al. Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE. Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target. International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).
- Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 9, 193 (2012).
