מבוא לעיבוד, התאמה ופירוש של נתוני קליטה ארעיים
Summary
פרוטוקול זה הוא הכניסה למתחילים לעיבוד, התאמה ופירוש ספקטרום בליעה חולף. המוקד של פרוטוקול זה הוא הכנת מערכי נתונים, והתאמה באמצעות קינטיקה של אורך גל יחיד וניתוח חיים גלובלי. נדונים אתגרים הקשורים לנתוני קליטה חולפים והתאמתם.
Abstract
ספקטרוסקופיית בליעה חולפת (TA) היא שיטה ספקטרוסקופית רבת עוצמה הניתנת לפתרון בזמן המשמשת למעקב אחר התפתחות תהליכי מצב מעורר באמצעות שינויים בספקטרום הבליעה של המערכת. יישומים מוקדמים של ת”א היו מוגבלים למעבדות מיוחדות, אך האבולוציה של מערכות מפתח מסחריות הפכה את הטכניקה לזמינה יותר ויותר לקבוצות מחקר ברחבי העולם. מערכות ת”א מודרניות מסוגלות לייצר מערכי נתונים גדולים ברזולוציה אנרגטית וזמנית גבוהה העשירים במידע פוטופיזי. עם זאת, עיבוד, התאמה ופירוש של ספקטרום TA יכולים להיות מאתגרים בשל המספר הגדול של תכונות מצב נרגש וממצאים אינסטרומנטליים. יש לשקול היטב גורמים רבים בעת איסוף, עיבוד והתאמה של נתוני ת”א על מנת להפחית את אי הוודאות לגבי איזה מודל או קבוצת פרמטרים מתאימים מתאר את הנתונים בצורה הטובה ביותר. מטרת הכנת הנתונים והתאמתם היא לצמצם כמה שיותר גורמים חיצוניים אלה תוך שמירה על הנתונים לניתוח. בשיטה זו, למתחילים מסופק פרוטוקול לעיבוד והכנת נתוני TA וכן מבוא קצר לתהליכי התאמה ומודלים נבחרים, במיוחד התאמת אורך גל יחיד וניתוח אורך חיים גלובלי. ניתנת פרשנות על מספר אתגרי הכנת נתונים נפוצים ושיטות להתמודד איתם, ולאחריה דיון באתגרים ובמגבלות של שיטות התאמה פשוטות אלה.
Introduction
ספקטרוסקופיית בליעה חולפת (TA) היא טכניקה ספקטרוסקופית פתורה בזמן המנטרת את האבולוציה של מינים מעוררי אור באמצעות שינויים תלויי זמן בספקטרום הבליעה שלהם בעקבות עירור עם פולס של אור. מכיוון ש-TA היא טכניקת ספיגה, ניתן לזהות אותות ספקטרוסקופיים הנובעים ממצבים שעוברים גם מעברים קרינתיים (כלומר, מצבים שבדרך כלל פולטים פוטון) וגם מעברים לא קרינתיים (מצבים שהם בדרך כלל לא פלואורסצנטיים ועוברים המרה פנימית, חצייה בין-מערכתית או השתתפות בתגובות פוטו-ריאקציה) והתפתחותם באה בעקבות 1,2. בהתאם לפרטים של מקור העירור ושיטת האיתור, TA מאפשר גישה לקינטיקה מפמטו-שניות עד מעבר למיקרו-שניות ומה-UV לאינפרא-אדום הרחוק, מה שהופך אותו לכלי ספקטרוסקופי רב-תכליתי. המסחור של ספקטרומטרים של ת”א התקדם משמעותית בעשורים האחרונים, מה שהוביל לכך שלמעבדות ומתקנים נוספים יש גישה לטכניקה רבת עוצמה זו2.
מערכות ת”א מודרניות מסוגלות לייצר מערכי נתונים גדולים ברזולוציה אנרגטית וזמנית גבוהה. מערכי הנתונים בדרך כלל לובשים צורה של מטריצה דו-ממדית של ערכי הפרשי העברה או בליעה כפונקציה של אורך גל ועיכוב זמן ביחס לפולס העירור. ניתן לראות במערך נתונים זה מפת חום דו-ממדית או מפה טופוגרפית תלת-ממדית. פרשנות נתונים אלה נעשתה מורכבת יותר ככל שהחוקרים שואפים לכלול את מערך הנתונים כולו בעת יצירת התאמות המתארות בצורה הטובה ביותר את מערכת האינטרסים שלהם3.
למרות שת”א יכול לכסות טווח רחב של אורכי גל וטווחי זמן, פרוטוקול זה מתמקד באחת מצורות4 הנגישות ביותר שלו: ספקטרוסקופיית פס רחב באזור הנראה UV המונעת על ידי לייזר פועם פמטו-שניות. סכמה 5,6 של מכשיר כזה מוצגת באיור 1. הניסוי מתחיל בלקיחת פולס מהלייזר ופיצול לשני עותקים. עותק אחד של הדופק, שנקרא ‘משאבה’, משמש כדי לעורר את הדגימה. מכשיר כגון מגבר פרמטרי אופטי (OPA) משמש בדרך כלל כדי להפוך את פולס המשאבה לאורך גל העירור הרצוי 5,7. העותק השני של הדופק, הנקרא ‘גשוש’, נכנס לשלב השהיה מכני, אשר יכול לשנות את זמן ההשהיה בין המשאבה לפעימות הבדיקה על ידי שינוי המרחק שהפולס עובר. לאחר מכן פולס הגשושית באורך גל יחיד הופך לרצף אור לבן באמצעות גביש ספיר או סידן פלואוריד (CaF2)8. פולס האור הלבן מועבר דרך הדגימה, והספקטרום שלו נמדד באמצעות גלאי פס רחב כגון מצלמת CCD (Charge-coupled device). על ידי מדידת שינויים בספקטרום של פולס האור הלבן עם ובלי המשאבה, ניתן למדוד שינויים בספקטרום הבליעה של הדגימה המושרה על ידי המשאבה, ΔA(T). קוראים המעוניינים מופנים לסקירה שימושית זו9 לקבלת מידע נוסף על תהליך האיתור.
בכל הצורות של ספקטרוסקופיית TA, ספקטרום ΔA(t) מחושב על ידי לקיחת ההפרש בין בליעת מצב הקרקע,גשושית A, לבין זו של המצב המעורר,משאבה+גשושית, בעיכוב זמן נתון, t, בין שני הפולסים 2,5,9,10.
(1)
שימו לבשבדיקה שקולה לספקטרום הבליעה של מצב יציב של הדגימה והיא בלתי תלויה בזמן; רזולוציית הזמן של הניסוי נובעת מההשהיה בין המשאבה לגשושית שנלכדהב-A pump+probe(t). סימולציה של הנתונים האלה מוצגת באיור 2A.
בניגוד לספקטרום בליעה במצב יציב, ספקטרום TA יכול להיות בעל תכונות חיוביות ושליליות כאחד בשל ההבדל שנלקח במשוואה 1. תכונות חיוביות הן תוצאה של מינים סופגים חדשים שנוצרו על ידי פולס המשאבה ויכולות לייצג מצבי כרומופור מעוררים, מצבי שלישייה, סידורים גיאומטריים, אפקטים של פתירה או תוצרי צילום של מצב מעורר3. הנחיות כלליות לזיהוי תכונות אלה ושיוכם למינים כימיים יוצגו בדיון. מאפיינים שליליים יכולים לנבוע מאקונומיקה של מצב קרקע (GSB) או מפליטה מגורה (SE) (איור 2B). ה- GSB נובע מאובדן אוכלוסיית מדינת הקרקע בעקבות ספיגת דופק המשאבה. מולקולות המקודמות למצב מעורר אינן נספגות עוד באותו אזור כמו מצב הקרקע שלהן; לכן, פחות מדופק הבדיקה נספג, וההבדל במשוואה 1 יכול להיות שלילי באזור זה. ה- GSB מאופיין באותה צורה ספקטרלית כמו זו של קליטת מצב הקרקע, אך עם סימן הפוך. אותות SE נובעים מפליטה של מין במצב מעורר המגורה על ידי פולס הגשושית3. פליטה ממינים אלה גורמת לכך שיותר אור מגיע לגלאי, וזה שווה ערך לבליעה נמוכה יותר באורכי גל אלה. לאות SE תהיה צורה ספקטרלית דומה לספקטרום הפליטה הספונטנית של המין, אך עם סימן שלילי ומשקל תדר שונה10.
בנוסף למידע על מינים בעלי מצב מעורר, ספקטרום TA יכול להכיל מספר ממצאים ותכונות חיצוניות שיכולים לעוות את הדינמיקה הבסיסית ולטשטש את הקצאת פסי הבליעה11. טיפול לא נכון בממצאים אלה בהכנת הנתונים ובניתוחם עלול להוביל ליישום מודלים פוטופיזיים בלתי הולמים על הנתונים, וכתוצאה מכך למסקנות מטעות11. לכן, החלק הראשון של פרוטוקול זה מתמקד כיצד לעבד כראוי מערכי נתונים של TA לאחר איסופם. מטרת חלק זה היא לספק לחוקרים חדשים בת”א סדרה של קווים מנחים שיסייעו לפתח אינטואיציה והערכה להכנה ועיבוד קפדניים של הנתונים שלהם.
לאחר עיבוד מערך הנתונים, שפע של כלים ומודלים זמינים להתאמה ופירוש של הספקטרום ברמות שונות של מורכבות וקפדנות10. מטרת החלק השני של פרוטוקול זה היא להכין את הקורא ליישם התאמה של אורך גל יחיד וניתוח גלובלי לנתונים ולספק הדרכה מתי מודלים אלה מתאימים לתיאור הנתונים שלהם. תוכנה מסחרית זמינה כעת להכנה וטיפול בנתוני TA, כגון Surface Xplorer12,13 ממערכות Ultrafast (להורדה ולשימוש בחינם, ראה טבלת חומרים). חלופות חינמיות אחרות שוחררו על ידי חוקרים אקדמיים, כגון גלוטרן14. Glotaran היא תוכנה חופשית שפותחה לניתוח גלובלי וממוקד של ספקטרוסקופיה ונתוני מיקרוסקופיה שנפתרו בזמן. הוא משמש כממשק משתמש גרפי (GUI) עבור חבילת R TIMP14. בנוסף, משתמשים יכולים להשתמש בשפות תכנות כמו Python כדי לכתוב קודים משלהם המבצעים את הניתוח. לכל אחד מפתרונות התוכנה והתכנות המתאימים הללו יש תכונות חיוביות שהופכות אותם לתרומות חשובות. לצורך מחקר זה, אנו יכולים להציג רק תוכנה אחת עבור המרכיב החזותי של פעילות זו. דיון מעמיק בכל אחת מהתוכנות המתאימות חורג מתחום מאמר זה.
מאמר זה מספק הליך שלב אחר שלב עבור (1) עיבוד נתוני TA, (2) התאמת נתוני TA באמצעות קינטיקה באורך גל יחיד וניתוח גלובלי, ו-(3) חילוץ נתונים והתאמתם למודלים אחרים. נכללת קבוצה של נתוני ת”א מייצגים לשימוש הקורא כפרקטיקה (קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2). הנתונים הם מדידה של דגימה של 165 מיקרומטר של 1, 4-bis(5-phenyloxazole-2-yl)benzene (POPOP) באתנול הנרגש ב 330 ננומטר ונאסף בטווח של -5 ps עד 5.5 ns. בנוסף, דגימה “ריקה” המכילה אתנול בלבד ולא נאספה דגימה באותם תנאי ניסוי בטווח של -5 ps עד 5 ps, המשמשת להכנת הנתונים להתאמה (שלב 1). הספקטרום נאסף באמצעות ספקטרומטר בליעה חולפת מהיר במיוחד. הדגימה נכללה בקובט באורך מסלול של 2 מ”מ והייתה נתונה לערבוב מתמיד. הליך העיבוד וההתאמה המתואר מבוסס על תוכנת Surface Xplorer המתאימה לנתונים בתבנית *.ufs, ואשר תיקרא להלן “תוכנית ההתאמה”. תוכניות להמרת ערכות נתונים בפורמטים אחרים לקבצי *.ufs זמינות15. למרות שהפרטים של פרוטוקול זה ספציפיים ל- Surface Xplorer, השלבים הבאים ניתנים להכללה לכל חבילת תוכנה, מסחרית או ביתית. בנוסף, ניתן לחלץ את תוצאות עיבוד הנתונים ולהתאים אותן באמצעות חבילות תוכנה אחרות אלה. קובץ מידע תומך (קובץ משלים 3) מספק עצות נוספות לגבי התאמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיקולים כלליים להכנת נתונים
התאמת נתוני ת”א עשויה להיראות במבט ראשון כפשוטה יחסית, וניתן לצפות כי “תשובה” נכונה אחת ברורה תתקבל עבור מערך נתונים נתון. עם זאת, כפי שמודגש בפרוטוקול, ישנם גורמים רבים ברכישת הנתונים, הכנת הנתונים וניתוח הנתונים שיש לשקול בקפידה שיכולים להוביל לאי ודאות לגבי איזה מודל או קבוצה של פרמטרים מתאימים מתאר את הנתונים בצורה הטובה ביותר. מטרת הכנת הנתונים והתאמתם היא לצמצם כמה שיותר גורמים חיצוניים אלה, תוך שמירה על הנתונים לניתוח. המשימה העומדת על הפרק עשויה להיראות מרתיעה למתחילים, מכיוון שיש הרבה מה לשקול. כדי לבנות אינטואיציה לגבי תהליך ההתאמה, מומלץ למתחילים לנסות להכין את אותם נתונים מספר פעמים מאפס בדרכים מעט שונות כדי לבדוק עד כמה דרמטיים שלבי הכנת הנתונים משפיעים על ההתאמה הטובה ביותר. בנוסף, שני חוקרים שונים יכולים להכין ולהתאים את אותם נתונים ולהשוות תוצאות. תהליך זה עשוי לקחת זמן רב בפעמים הראשונות, עם זאת, פעולה זו תאפשר למתחילים לפתח אינטואיציה כיצד להכין נתונים באופן עקבי עבור דגימות עתידיות. כמו כל מיומנות, הכנת נתונים זו והתאמתם ייקח זמן לפתח, ומומלץ למתחילים להיות סבלניים וממושמעים בעת ההתנסות והלמידה של התהליך. מערך הנתונים המשמש במחקר זה מסופק כדי לתת למתחילים את ההזדמנות להשתלב ישירות לצד המדריך, ולהשוות ישירות את התוצאות עם אלה שהופקו במדריך.
הנתונים עשויים להכיל תכונות רקע הקיימות בכל עת עיכובים (איור משלים 2 ואיור משלים 3) כגון פיזור קרן המשאבה ופליטה ספונטנית של הדגימה. תכונות לא רצויות אלה חייבות להיות מוסרות על מנת לבודד את אות הבליעה הארעי מהמינים המעניינים11. הסרת תכונות כאלה נעשית על ידי בחירה, ממוצע והסרת התרומה של מספר ספקטרום הפרשי זמן שליליים. בעת בחירת ספקטרום רקע, חשוב לוודא שלא נכללות תכונות שעשויות להיות חלק מתהליך העניין להסרה. תכונות רקע הנובעות מהממס, כגון ספיגה מזיהומים או מהממס עצמו, ניתן לראות גם בנתוני TA. כאשר הממס מייצר אות, יהיה צורך להחסיר מערך נתונים “ריק” המכיל רק את הממס הפועל באותם תנאי ניסוי בדיוק כמו הדגימה ממערך הנתונים של הדגימה. פרטים על הליך זה כלולים בקובץ משלים 3.
תיקון הציוץ הוא גורם נוסף שיש לשקול בזהירות. ציוץ מתרחש כאשר פולס הגשושית עובר לדגימה ומתרחב עקב פגמים במראות ההיגוי או על ידי מעבר דרך אופטיקה מפוזרת כגון עדשות או פילטרים. התוצאה הסופית היא שפוטונים בעלי אנרגיה נמוכה יותר בפולס הגשושית (כלומר, הצד האדום של ספקטרום הגשושית) מגיעים לדגימה לפני פוטונים בעלי אנרגיה גבוהה יותר (כלומר, הצד הכחול של ספקטרום הגשושית). התוצאה היא ש”זמן אפס” של ספקטרום TA נמרח על פני מספר פמטו-שניות או פיקושניות18, המתבטאות בעקומה ברורה במערך הנתונים הגולמי המתחיל באורכי הגל הכחולים ואז משתטח כשהוא מתקרב לאדום (איור משלים 7). הציוץ בולט בעיקר בסקאלות זמן קצרות יותר, כמו אלה שאליהן ניגשים ת”א אולטרה-מהירה. ניתן לתקן אפס זמן תלוי אורך גל זה כמתואר בפרוטוקול, אך היישום של תהליך זה יכול להיות מסובך וסובייקטיבי. דגימה “ריקה” או מדידה של תגובת קר הממס יכולה למזער את האופי הסובייקטיבי של נקודות בחירה ידניות לתיקון הציוץ הדרוש ליצירת ההתאמה הפולינומית המשמשת להתאמה ולתיקון הציוץ. מטרת תיקון הציוץ היא להסיר את ה”עקומה” המובהקת של זמן האפס. ייתכן שיידרשו ניסיונות מרובים להתאים את הציוץ כדי לקבל את הנתונים המתוקנים הטובים ביותר. ניתן להתאים את הנתונים מספר פעמים עם תיקוני ציוץ שונים המיושמים על מנת לקבל הבנה של ההשפעה שיש לתיקון הציוץ על ערכי אורך החיים הקצרים של TA.
חפצים המופיעים ב”זמן אפס”
ניתן לראות מספר ממצאים קרוב ל”זמן אפס” בנתוני TA, כולל פיזור ריילי, פיזור ראמאן מגורה ואפנון חוצה פאזות. פיזור ריילי של קרן המשאבה הוא פיזור אלסטי הנובע ללא שינוי באנרגיה. תכונה זו תופיע באותו אורך גל כמו פולס המשאבה. פיזור ראמאן מגורה עשוי ללוות את אות פיזור המשאבה19. פיזור ראמאן, הנובע מפיזור לא אלסטי של פוטון משאבה, מייצר פסגות הן באנרגיה גבוהה יותר (אנטי-סטוקי) והן באנרגיה נמוכה יותר (סטוקס) מאשר אנרגיית משאבת האירוע. בנתוני ת”א נצפתה פיזור ראמאן מגורה עקב הקרנה בו זמנית של הדגימה עם המשאבה וקורות הבדיקה. כאשר קרן הבדיקה מתקשרת עם הדגימה במקביל לקרן המשאבה, היא מעוררת את תהליך הרמאן. לכן, פיזור הרמאן המגורה מתרחש סביב זמן האפס וגורם לשיאים נוספים בספקטרום בתוך כמה מאות הפמטושניות הראשונות (איור 6, שנצפה בספקטרום הכחול הכהה יותר באזור המסומן ובאיור משלים 17). אפנון חוצה פאזות מקורו באפנון של מקדם השבירה של הממס מאינטראקציה עם השדה החשמלי האינטנסיבי של פולס.
ניתן להבדיל בין פיזור ראמאן מגורה לבין אפנון חוצה פאזות מכיוון ששיאי הרמאן מופיעים בתדרים ספציפיים המתאימים למצבי הרטט של הממס. מכיוון שמדובר בתהליך ראמאן, ניתן להבחין גם בקווי סטוקס וגם בקווי אנטי-סטוקס משני צדי העירור. ממיסים כלוריים כמו מתילן כלוריד מראים להקות ראמאן בולטות מאוד בגלל הקיטוב הגדול של כלור. החתימות הספקטרליות של אפנון חוצה פאזות הן ייחודיות לממס, אך אינן ניתנות לחיזוי בקלות כמו תכונות פיזור ראמאן.
בהתאם לקינטיקה של המדגם הנמדד, פיזור ריילי, פיזור ראמאן ואפנון חוצה פאזות עשויים לחפוף עם תכונות מוקדמות של נתוני TA ויכולים להיות מאתגרים להסרה מהנתונים. באופן עקרוני, תכונות אלה ניתן לראות מדידה ממס מסודר מופחת מן הנתונים, תוכניות ניתוח נתונים עשוי להיות פונקציות מתאימות כדי להסביר תכונות אלה, אבל בפועל, זה יכול להיות קשה. כאשר קשה מדי להחסיר את הממצאים הללו מבלי לפגוע בנתוני המדגם, ייתכן שעדיף לחתוך החוצה את הספקטרום שנפרץ סביב זמן האפס כדי לחסל את הממצאים. פעולה זו תהיה תופעת לוואי מצערת של הסרת כ 300 fs הראשונים של נתונים, אבל יהפוך את ההתאמה אמינה יותר מאוחר יותר. במהלך ניתוח מערכי נתונים מרובים של דגימות זהות ושונות, המתחיל יקבל אינטואיציה בהשגת איזון זה של חיסור משטח הרקע לעומת חיתוך הנתונים הראשוניים של 100-200 fs.
חיתוך כללי עשוי להיות נחוץ עבור חלקים של הספקטרום המכילים אות לרעש נמוך. חוסר יציבות באלומת הבדיקה באזורים מסוימים, עוצמה נמוכה של אור הגשושית, ריכוזי דגימה גבוהים מדי (ובכך חוסמים חלק ניכר מבדיקת האירוע), עוצמת משאבה נמוכה וחתך הספיגה של הדגימה הם גורמים אופייניים לאות לרעש נמוך שיכול להפוך את התאמת הנתונים למאתגרת. במקרים אלה, חיתוך מערך הנתונים משני צדי החלון האופטי על מנת להשיג רמה רצויה של אות לרעש יכול לסייע בתהליך ההתאמה.
ערכת נתונים מוכנה לניתוח לאחר שנחתכה מספיק כדי להסיר חלקים גרועים של ערכת הנתונים, תיקנה את הציוץ וספקטרום הרקע עבר ממוצע והחסרה. הליך זה אמור לגרום לנתונים המכילים רק את החלקים הרלוונטיים ביותר לפוטופיזיקה ולפוטוכימיה המעניינים. אכן, ברור שיש מידה מסוימת של סובייקטיביות לתהליך זה. המטרה בהכנת נתונים היא לאזן את הסרת הממצאים כך שלא יפריעו להתאמה, אך לא להסיר עד כדי כך שהיא פוגעת בשלמות מערך הנתונים, ובכך מעכבת את פרשנותו. מציאת איזון זה דורשת זמן וניסיון כדי לבנות את האינטואיציה לגבי מהו חפץ ומהו נתונים. התאמה (והתאמה מחדש) של אותה קבוצת נתונים במספר ימים שונים, או התאמת שני חוקרים לאותם נתונים, יכולה להיות דרך למזער טעויות אנוש ואת הסובייקטיביות של הכנת הנתונים וניתוחם.
שיקולים כלליים להתאמה ולפרשנות
לאחר עיבוד ספקטרום ת”א הגולמי, יש לפרש ולמדל אותם כדי לחלץ מידע על המינים ועל הדינמיקה הקיימת במערכת העניין. ניתן לתאר תהליך זה כהליך בן שלושה שלבים הכולל פרשנות ספקטרלית ראשונית, מידול/התאמה כמותית והקצאת הפרשנות הספקטרלית לדגם/התאמה.
פרשנות ספקטרלית ראשונית: בשלב הפרשנות הספקטרלית, המטרה היא להקצות תכונות הקיימות בספקטרום TA למצבים אלקטרוניים אליהם ניתן לגשת באבולוציה הפוטופיזית או הפוטוכימית של המערכת. כדי להתחיל, יש לזהות מדינות שונות. בעבודה זו, מצבים מתייחסים למצבים אלקטרוניים ייחודיים שהם חלק מהאבולוציה הפוטופיזית או הפוטוכימית של המערכת. למצב, המיוצג, למשל, על ידי עקומת אנרגיה פוטנציאלית ספציפית אחת (PEC), יש קבוצה של פסגות אופייניות המייצגות את ספקטרום הבליעה שלו. שינוי המתרחש בתוך מצב יחיד נקרא תהליך. תהליך פוטופיזי עשוי להופיע בספקטרום TA כהסטת שיא או שינוי ברוחב הספקטרום. ההיבט המרכזי של תהליך הוא שאוכלוסיית המדינה נשארת זהה (כלומר, התהליך מתרחש בתוך PEC נתון); חלוקת האנרגיה בתוך המדינה היא שמשתנה. שינוי באוכלוסיית המדינה ייקרא מעבר. במהלך מעבר, המערכת מתפתחת ל-PEC אחר (כלומר, מצב אלקטרוני). מעברים עשויים לכלול המרה פנימית (IC), מעבר בין-מערכתי (ISC), העברת מטען, העברת אנרגיה, היווצרות מוצרים חדשים או חזרה למצב הקרקע. הנחיות להקצאת מצבים, תהליכים ומעברים יידונו בפסקאות הבאות.
הקצאת מדינות
הצעד הראשון בתהליך זה כרוך בהקצאת תכונות ספקטרליות למינים או מצבים כימיים ספציפיים. מצב S1 בת”א אמור להראות אורך חיים התואם את אורך החיים הפלואורסצנטי שנלקח באמצעות ספקטרוסקופיית פליטה שנפתרה בזמן. מצב שלישייה יכול להיות מאומת אם החיים שלה הוא מרווה, על ידי חמצן. אם יש חשד לאניון רדיקלי או קטיון באבולוציה הפוטופיזיקלית, ניתן לבצע ספקטרואלקטרוכימיה או חמצון/חיזור כימי כדי ליצור את המין הרדיקלי, וניתן לקבל ספקטרום בליעה של אותו מין ולהשוות אותו לצורת הפס TA. ניתן לבצע ספקטרוסקופיית תהודה של ספין אלקטרונים (ESR) כדי לאמת את נוכחותם של רדיקלים חופשיים. הרצאת הדרכה מצוינת בהנחיית חטיבת ACS לכימיה אי-אורגנית נותנת סקירה כללית של ת”א ושיקולים כאלה בהקצאת תכונות20. לאחר שהוקצו להקות למינים, השלב הבא בפענוח ספקטרום TA הוא לתאר באופן איכותי את התהליכים הדינמיים המתרחשים במערכת. שלב זה חיוני מכיוון שהוא נותן לחוקר מושג אילו מודלים יתאימו לתיאור המערכת שלהם וייתן להם בסיס להשוות אליו את פרמטרי ההתאמה.
שינויים בתוך מדינה
קירור רטט, סידור מחדש גיאומטרי או פתירה הם תהליכים מהירים ביותר (sub-ps עד 10’s ps) שניתן לצפות בהם עם TA. קירור רטט נצפה כהסטה כחולה מהירה של ספקטרום TA בסקאלת זמן של מספר פיקו-שניות 21,22,23. סידור מחדש גיאומטרי יכול להתרחש על ציר הזמן של 10 ps. דינמיקת המסה נצפית כהסחה לאדום והיצרות של הספקטרום על פני מספר פיקושניות בנוזלים דיפולריים קונבנציונליים, אך ממסים בעלי צמיגות גבוהה כגון גליצרול, פוליאתילן גליקול (PEG), נוזלים יוניים וממיסים אאוטקטיים עמוקים יכולים להציג דינמיקת המסה המתרחשת במהלך ננו-שניות מרובות 24,25,26.
שינויים באוכלוסיית המדינה
תגובות מאופיינות בשינוי בעוצמת הלהקה, כאשר ירידה בעוצמה קשורה לירידה בריכוז המינים הכימיים שלה ולהיפך לעלייה. במקרים מסוימים, הן המגיב והן מין המוצר נראים בספקטרה, בעוד שבאחרים, מצבי המכפלה קצרים מדי או רחוקים מדי מכדי שניתן יהיה להבחין בהם. לעתים קרובות ניתן לראות מעברים ממצב למצב על ידי נוכחות של נקודה איזוסבסטית בספקטרה.
מידול/התאמה כמותית: לאחר מכן יש להתאים מודל לנתונים על מנת לחלץ מידע כמותי על הדינמיקה של המערכת. כפי שתואר קודם לכן במבוא, יש מגוון רחב של מודלים לשימוש. פרוטוקול זה מתמקד בשתיים מהשיטות הנפוצות ביותר: התאמת אורך גל יחיד וניתוח גלובלי. שיטת אורך הגל היחיד כוללת התאמת עקבות אורך גל בודדים מהספקטרום לצורה פונקציונלית כלשהי, בדרך כלל סכום של מעריכים:
(2)
כאשר ΔA(t) הוא אות TA באורך גל נבחר, n הוא מספר הרכיבים המעריכיים, ו –iהוא המשרעת של רכיב מעריכי, i, עם קבוע הזמן τi. ניתן להוסיף מספר רכיבים עד שההתאמה תשחזר את נתוני הניסוי. המטרה של כל תהליך התאמה היא למדל את הנתונים באמצעות מספיק מחזורי חיים כדי לשחזר את הנתונים היטב, אך לא להתאים יתר על המידה לנתונים על ידי הכללת רכיבים רבים מדי. לפיכך, פרמטרים משוקללים של התאמה טובה כגון 
, משמשים כדי לקבוע מתי הנתונים מתאימים בתוך אי ודאות ניסויית5.
לאחר הדעיכה מותאמת באופן משביע רצון, ניתן להשתמש בפרמטרים של המודל כדי לאפיין את הדינמיקה של המערכת. לאחר מכן ניתן לחלץ ולפרש את קבועי הזמן המתקבלים. לרוע המזל, המספר הגדול של תכונות חופפות בספקטרום TA פירושו שאורך גל יחיד בספקטרום עשוי להכיל דינמיקה המתאימה למינים שונים שהחתימות הספקטרליות שלהם חופפות, כלומר קבועי הזמן המופקים מהתאמה של אורך גל יחיד עשויים לייצג שילוב של תהליכים חופפים מרובים. בנוסף, כל שינוי בצורת הפס ובמיקום ישפיע גם על המשרעת וקבועי הזמן המופקים מהתאמת אורך גל יחיד. במקרים מסוימים ניתן לעקוף בעיות אלה על ידי שיטת התאמה הנקראת ‘ניתוח צורת פסים’, שבה קובעים או מניחים צורה פונקציונלית עבור רצועות TA של כל מין סופג במערכת. צורות אלה משוקללות על ידי אמפליטודות תלויות זמן ומסוכמות יחד על מנת לשחזר את הספקטרום הנצפה. הליך זה משמש בדרך כלל בניתוח ספקטרום פלואורסצנטי שנפתר בזמן, אך הצורות המסובכות יותר והרכיבים החופפים של רצועות TA הופכים שיטה זו לאפשרית במקרים פשוטים בלבד, כמפורט במקום אחר10.
חסרון נוסף של התאמת אורך גל יחיד הוא שהיא אינה מנצלת באופן מהותי את הטווח הספקטרלי הרחב שמעניקים ניסויי TA מודרניים. אפשר, באופן עקרוני, להתאים באופן שיטתי לכל אורך גל בודד של הספקטרה, אך ניתוח כזה הוא מסורבל, גוזל זמן ויקר מבחינה חישובית. כדי להתמודד עם אתגר זה, ניתן להשתמש בשיטה הנקראת “אנליזה גלובלית” כדי להתאים בו זמנית קבוצה שלמה של ספקטרום TA לקבוצה של פרמטרים דינמיים משותפים4. ניתוח גלובלי, ושיטה קרובה הנקראת ניתוח יעד, הן שיטות מוצלחות ובשימוש נרחב, אך הן מגיעות גם עם מערך ייחודי משלהן של חסרונות ומגבלות. כמו בכל מודל, חובה להבין את ההנחות המשמשות ליצירתו, כמו גם את המגבלות שהן מציגות.
באנליזה גלובלית, ספקטרום TA מיוצג על ידי מטריצה m על ידי n, כאשר m מייצג את מספר אורכי הגל הנמדדים בכל ספקטרום ו-n מייצג את מספר נקודות הזמן שנאספו. לאחר מכן מניחים שמטריצה זו ניתנת לפירוק למכפלה של שתי מטריצות אחרות:
(3)
כאשר C(t) היא מטריצה n על k ו-S(λ) היא מטריצה m על k. הערך k מייצג את מספר הרכיבים הספקטרליים השונים המשמשים לשחזור הספקטרה. כל אחד ממרכיבים אלה מייצג מין סופג בעל חתימה ספקטרלית ייחודית ודינמיקה. מטריצת S(λ) מייצגת את ספקטרום TA של k רכיבים ו-C(t) את ריכוזיהם תלויי הזמן. ביישום הפשוט והנפוץ ביותר של אנליזה גלובלית, מניחים שלכל רכיב יש קינטיקה מעריכית יחידה (i = 1 במשוואה 2, כאשר לכל רכיב מוקצה קבוע זמן משלו). לסיכום, ספקטרום TA המלא יכול להיות מיוצג על ידי סכום של k רכיבי ספקטרה, כל אחד עם ספקטרום בליעה אופייני משלו ודעיכה מעריכית יחידה.
כאשר ספקטרום TA מתאים, המשתמש מנחש כמה רכיבים (כלומר, ערך עבור k) דרושים ומבצע ניחוש קבוע באותו זמן הקשור לדעיכה מעריכית יחידה של אותם מינים. לאחר מכן, המתקן יוצרC guess(t) ופותר את משוואה 3 עבור Sfit(t). לאחר מכן, Sfit(λ) ו- Cguess(t) מוכפלים כמו במשוואה 3 כדי ליצור את הספקטרום המותאם, ΔA(λ,t)fit. לבסוף, השאריות, ΔA(λ,t)exp − A(λ,t)fit, ממוזערות וחוזרותהתאמות S אופטימליות (λ) וקבועי זמן. הפשטות היחסית של אנליזה גלובלית, המייצגת מערך שלם של ספקטרום תוך שימוש בקומץ קבועי זמן ורכיבים ספקטרליים קבועים, הופכת אותו לשיטה אטרקטיבית (ומוצלחת) להתרת צורות הפסים והדינמיקות המסובכות בהן נתקלים בספקטרוסקופיית TA. עם זאת, יש להקפיד על כך שניתוח גלובלי הוא מודל מתאים למערכת העומדת על הפרק.
הנחת מפתח באנליזה גלובלית, המודגמת במשוואה 3, היא ההפרדה המלאה של חלקי אורך הגל והזמן של הדינמיקה, תכונה הנקראת “דו-ליניאריות”. הנחה זו דורשת שצורות הפסים המרכיבות אותן יהיו תלויות בזמן (כלומר, יש להן צורה ספקטרלית קבועה שאינה משתנה או משתנה עם הזמן). הדבר היחיד שמשתנה במהלך הניסוי הוא האוכלוסיות היחסיות של כל רכיב, המיוצגות על ידי C(t). בסקאלות זמן ארוכות, ~ 1 ns בערך, הנחה זו בדרך כלל מחזיקה וניתן להשתמש בניתוח גלובלי ללא חשש רב. מצד שני, תהליכים של מצב מעורר כגון קירור רטט ודינמיקת המסה, הבולטים בסקאלות הזמן האולטרה-מהירות הנגישים על ידי פמטו-שנייה TA, גורמים לשינויים תלויי זמן בחתימה הספקטרלית של מין ולפירוק של דו-ליניאריות. זה לא אומר כי ניתוח גלובלי לא יכול לשחזר מערך נתונים, למעשה, זה תמיד יכול לייצר התאמה משביעת רצון בתנאי מספר מספיק של רכיבים משמשים. הבעיה נעוצה אם כן בפענוח ספקטרום הרכיבים ובהקצאת קבועי הזמן לתהליכים מסוימים של מצב מעורר, מכיוון שהרכיבים עשויים שלא להתאים עוד למינים סופגים נפרדים. לכן, תמיד יש לנקוט בזהירות בעת יישום ניתוח גלובלי למצבים שבהם לא ניתן להניח דו-ליניאריות.
הקצאת הפרשנות הספקטרלית לדגם/התאמה: לאחר קבלת התאמה, יש למפות את הפרשנות הספקטרלית לתקופות החיים המתקבלות בהתאמה. משך החיים מההתאמה מוקצה הן לתהליכים והן לתגובות שזוהו בפרשנות הראשונית של הספקטרה. עם זאת, ההערכה הראשונית מהספקטרום ומספר זמני החיים המותאמים המתקבלים על ידי המודל עשויים שלא למפות זה את זה באופן מיידי. במצב זה (הנפוץ!), המתאימת צריכה לחזור ולהעריך את הפרשנות הראשונית. אולי היה קירור רטט או תהליך אחר שהוחמץ בהערכה הראשונית, אך זוהה בתהליך המידול וההתאמה. לחלופין, אולי שתי קבוצות שונות של פרמטרי התאמה יכולות לשחזר את הנתונים היטב והפרשנות הראשונית יכולה להנחות איזו קבוצה של פרמטרים מתאימים נבחרים. בשלב אחרון זה, על המתקן לעבור הלוך ושוב בין הפרשנות לבין ההתאמה כדי למצוא תיאור שיוביל להקצאה פוטופיזית מתקבלת על הדעת של המינים והדינמיקה של המערכת. תוכניות התאמה אחרות הכוללות מודלים של התאמה רציפה, כגון ניתוח מטרות, יכולות גם הן להיבחן כדי להשלים את ההתאמות המתקבלות על ידי ניתוח גלובלי ותוכנת ההתאמה המוצגת במאמרזה 4.
לסיכום, פרוטוקול זה דן בהכנה והתאמה של נתוני קליטה ארעיים. מטרתו היא להדגיש אתגרים הקשורים לתהליך ולהגיב על דרכים להימנע או למתן אתגרים אלה באופן מעשי. התאמת נתוני ת”א, כמו התאמת רוב הנתונים בתחומים טכניים, יכולה להיות מסובכת ולעיתים סובייקטיבית. לכן, מודעות לתהליך ולמגבלות של הנתונים, הכנת הנתונים והכלים המתמטיים המשמשים למידול והקצאת משמעות לנתונים הם קריטיים. מדענים חייבים לגשת לנתונים ולמודלים בעין ביקורתית.
אפשר לנסות למתן את הסובייקטיביות של ההתאמות שלהם. לדוגמה, ניתן להכין ולהתאים את הנתונים מנקודות התחלה שונות ובימים שונים כדי להבטיח שאותה התאמה מופקת. ניתן להשוות נתונים שנלקחו בימים שונים עם הכנת מדגם שונה. חוקרים מרובים יכולים להתאים את אותם נתונים ולהשוות את התוצאות שלהם. עם הזמן, חוקרים יכולים לבנות אינטואיציה לגבי הנתונים שהם מקבלים (בהתבסס על הפרטים של מערך הניסוי שלהם ופרמטרים ניסיוניים) שתאפשר להם להיות בטוחים יותר בהתאמה שלהם.
יש הרבה מה ללמוד על התאמת הנתונים של ת”א ועל פרטי המודלים שנדונו במאמר זה. כמה מאמרי ביקורת מצוינים מומלצים בהתלהבות להתעמק בנושאזה 4,10,27. פרוטוקול זה אמור להיות כניסה למתחילים בתהליך הניתוח וההתאמה שמעורר עניין בהבנה מעמיקה יותר של התהליך.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו התאפשרה הודות לתוכנית מכשור המחקר העיקרי של NSF שהקימה את מתקן הלייזר מרובה המשתמשים לקליטה חולפת (CHE-1428633). חומר זה מבוסס על עבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת מענק מס ‘. CHE-2313290.
Materials
| EtOH 200% Proof | Decon Laboratories Inc | CAS 64-17-5 | Solvent used to prepare Sample |
| Helios transient absorption spectrometer | Ultrafast systems | https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/helios/ | Transient absorption spectrometer |
| POPOP 1,4-Bis[2-(5-phenyloxazolyl)]benzene | Tokyo Chemical Industry | CAS 1806-34-4 | Sample used for Examples |
| Surface Xplorer | Ultrafast systems | https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/surface-xplorer/ | Fitting program |
References
- Turro, N. J. . Modern Molecular Photochemistry. , (1991).
- Berera, R., van Grondelle, R., Kennis, J. T. M. Ultrafast transient absorption spectroscopy: Principles and application to photosynthetic systems. Photosynth Res. 101, 105-118 (2009).
- Ruckebusch, C., Sliwa, M., Pernot, P., de Juan, A., Tauler, R. Comprehensive data analysis of femtosecond transient absorption spectra: A review. J Photochem Photobiol C Photochem Rev. 13 (1), 1-27 (2012).
- Van Stokkum, I. H. M., Larsen, D. S., Van Grondelle, R. Global and target analysis of time-resolved spectra. Biochim Biophys Acta – Bioenerg. 1657 (2-3), 82-104 (2004).
- Megerle, U., Pugliesi, I., Schriever, C., Sailer, C. F., Riedle, E. Sub-50 fs broadband absorption spectroscopy with tunable excitation: putting the analysis of ultrafast molecular dynamics on solid ground. Appl Phys B Lasers Opt. 96 (2-3), 215-231 (2009).
- Kovalenko, S. A., Dobryakov, A. L., Ruthmann, J., Ernsting, N. P. Femtosecond spectroscopy of condensed phases with chirped supercontinuum probing. Phys Rev A – At Mol Opt Phys. 59 (3), 2369-2384 (1999).
- Villa, A., et al. Broadly tunable mid-infrared femtosecond pulses directly generated by an optical parametric amplifier. OSA Contin. 4 (11), 2837-2844 (2021).
- Brodeur, A., Chin, S. L. Ultrafast white-light continuum generation and self-focusing in transparent condensed media. J Opt Soc Am B. 16 (4), 637650 (1999).
- Lang, B. Photometrics of ultrafast and fast broadband electronic transient absorption spectroscopy: State of the art. Rev Sci Instrum. 89 (9), 093112 (2018).
- Beckwith, J. S., Rumble, C. A., Vauthey, E. Data analysis in transient electronic spectroscopy – an experimentalist’s. Int Rev Phys Chem. 39 (2), 135-216 (2020).
- Devos, O., Mouton, N., Sliwa, M., Ruckebusch, C. Baseline correction methods to deal with artifacts in femtosecond transient absorption spectroscopy. Anal Chim Acta. 705 (1-2), 64-71 (2011).
- . Surface Xplorer from Ultrafastsystems Available from: https://ultrafast.systems/products/spectrometers-a (2023)
- Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberbuhler, A. D. Calculation of equilibrium constants from multiwavelngth spectroscopic data-i mathematical considerations. Talanta. 32 (2), 95-101 (1985).
- Snellenburg, J. J., Laptenok, S., Seger, R., Mullen, K. M., van Stokkum, I. H. M. Glotaran: A Java-based graphical user interface for the R package TIMP. J Stat Softw. 49 (3), 1-22 (2012).
- . Python scripts to convert to and from comma separated values (.csv) and Ultrafast Systems binary data (.ufs) file formats Available from: https://bitbucket.org/ptapping/csv2ufs/src/master/ (2023)
- . Surface Xplorer manual Available from: https://ultrafastsystems.com/download/surface-xplorer/SurfaceXplorerManual.pdf (2023)
- Lakowicz, J. R. . Principles of fluorescence spectroscopy, 3rd Ed. , 883-886 (2006).
- Maciejewski, A., et al. Transient absorption experimental set-up with femtosecond time resolution. Femto- and picosecond study of DCM molecule in cyclohexane and methanol solution. J Mol Struct. 555 (1-3), 1-13 (2000).
- Lorenc, M., et al. Artifacts in femtosecond transient absorption spectroscopy. Appl. Phys. B Lasers Opt. 74, 19-27 (2002).
- . Transient absorption spectroscopy Available from: https://mediaspace.unm.edu/media/Physical+Inorganic+Tutorials+Transient+Absorption+Specctrscopy/1_t5pdqzgx (2023)
- Maçôas, E. M. S., Mustalahti, S., Myllyperkiö, P., Kunttu, H., Pettersson, M. Role of vibrational dynamics in electronic relaxation of Cr(acac)3. J Phys Chem A. 119 (11), 2727-2734 (2015).
- Brown, A. M., et al. Vibrational relaxation and redistribution dynamics in Ruthenium(II) polypyridyl-based charge-transfer excited states: a combined ultrafast electronic and infrared absorption study. J Phys Chem A. 122 (40), 7941-7953 (2018).
- Vlček, A., Kvapilová, H., Towrie, M., Záliš, S. Electron-transfer acceleration investigated by time resolved infrared spectroscopy. Acc Chem Res. 48 (3), 868-876 (2015).
- Horng, M. L., Gardecki, J. A., Papazyan, A., Maroncelli, M. Subpicosecond measurements of polar solvation dynamics: Coumarin 153 revisited. J. Phys. Chem. 99 (48), 17311-17337 (1995).
- LaRocca, M. M., Baker, G. A., Heitz, M. P. Assessing rotation and solvation dynamics in ethaline deep eutectic solvent and its solutions with methanol. J Chem Phys. 155 (3), 034505 (2021).
- Zhang, X. X., Liang, M., Ernsting, N. P., Maroncelli, M. Complete solvation response of coumarin 153 in ionic liquids. J Phys Chem B. 117 (16), 4291-4304 (2013).
- Jollife, I. T., Cadima, J. Principal component analysis: A review and recent developments. Philos Trans R Soc. A. 374 (2065), 20150202 (2016).
