マウス腰椎一軸圧縮試験(荷重面の埋め込み)

すべての実験とプロトコルは、米国国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠して実施され、コロラド州立大学プエブロ機関動物管理および使用委員会(プロトコル番号:000-000A-021)から承認を受けました。動物の飼育に関する詳細な手順については、すでに説明しました5,6。このマウスは、成長期の若い雌のC57BL/6マウスに対するヘンプシード補給食の効果を調査することを目的とした広範な研究の一環として、生後3週間で得られた(資料表参照)。5週齢から29週齢まで、マウスは3つの食事のいずれかで飼育されました:コントロール(0%ヘンプシード)、50 g / kg(5%)ヘンプシード、または150 g / kg(15%)ヘンプシード、グループあたり8匹のマウス5,6。研究全体を通して、マウスはそれぞれの餌と水に自由にアクセスでき、ポリカーボネートケージにペアで収容され、12時間の明:12時間の暗サイクル(06:00から18:00までライトが点灯)に維持されました。マウスの体重と健康状態は毎週評価され、すべてのマウスは有害な健康状態を発症することなく研究を無事に完了しました。29週齢で、マウスはイソフルランガスを使用して深く麻酔され、子宮頸部脱臼によって安楽死させられました5,6。胸骨から尾部までの腹面を正中線切開し、胸腔内臓器、腹膜臓器、後腹膜臓器をすべて死骸から取り除いた。内臓を摘出された死骸は、約1年後に行われた椎骨検査のための骨解剖時まで、-70°Cの0.9%塩化ナトリウム溶液中に保存されました。 1. 三点曲げ機から圧縮試験機への転換 3点曲げ機7 の荷重センサーに取り付けられているクロスヘッドビームを緩めます( 材料表を参照)(図1A、B)。 クロスヘッドビームと同じねじ切りで、自動調心トッププラテンを荷重センサー( 材料表を参照)にねじ込みます(図1C)。 下部の支持体のそれぞれに2つの水平穴を開け、下部のプラテンを後で取り付けます(図1D)。 ステンレス鋼の底板の両側にねじ山をタップして、下部サポートにドリルで開けた穴に合わせます(図1E)。 ネジ付きの六角ネジを使用して下部プラテンを2つの下部サポートに固定し、固定されるまで締めます(図1F)。注意: 六角ネジには、下部サポートおよび上部/下部プラテンのタップ穴と一致するねじ山が必要です。自動調心トッププラテンの使用は、トッププラテンと荷重面との間の均一な接触を達成するのに役立つかもしれないが、椎体の頭蓋端の凹みを考えると十分ではない。さらに、ローディング表面処理法を用いた調製が必要です。多くの工業材料やエンジニアリング材料よりも小さくて弱い小動物の骨の圧縮試験機を構築する場合、荷重センサの耐荷重と荷重フレームのサイズを考慮することが不可欠です。さらに、正確な結果と円滑な操作を確保するために、機械を定期的に洗浄および注油する必要があります。 2. 圧縮試験機の変位補正 トッププラテンとボトムプラテンの間に試験材料がない状態で、軽い接触(~0.3-0.5 Nの予圧)が行われるまで、トッププラテンをボトムプラテンに下げます。 一定の下降速度(~1 mm/分)で機械の電源を入れ、圧縮試験を開始します。機械的試験のデータ収集のために、デジタルデータ収集ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して荷重(N)と変位(mm)の測定値を収集します。注:上部と下部のプラテンの間に材料がないため、観察されるすべての変位は、機械のみ(Δxマシン)(フレーム、ロードセル、プラテン、カップリングなど)の変位によるものです。 すべての骨サンプルから得られる力よりも高い力に達するまで、一定の(つまり、単調な)速度で上部プラテンを下部プラテンに下げ続けます。 手順 2.1 から 2.3 を合計 3 回繰り返します。 システム変位(Δxマシン、mm) 対のデータをプロットします。適用荷重(力、N)。 データに最も適合する回帰直線を当てはめます(図2A-D)。 骨圧迫試験のデータを含むスプレッドシートで、回帰分析によって提供される式を使用して、マウス腰椎圧迫試験のデータポイントの記録された変位(記録された合計Δx)に影響を与える機械変位の量(Δxマシン)を決定します。注: たとえば、18 N の力が加えられ、2.730 mm の変位が記録されたデータ点(合計 Δxが記録された)があるとします。例の3次多項式回帰式(図2D)[Δxマシン=(4 × 10-7 x 適用荷重3)-(8 × 10-5 x適用荷重2)+(0.0044 x適用荷重)]によると、記録された変位の0.056 mmは機械の変位(Δxマシン)によるものです。記録されたΔx合計=Δxマシン+Δx試験片 データ点の記録された変位を修正します。注: たとえば、上記の例について考えてみます。2.730 mmの変位が記録され(Δx合計記録)、機械変位 (Δxマシン)が合計の0.056 mmを占める場合、対象の試験片(つまり、骨)が受けた変位(Δx試験片)は2.664 mmです。 したがって、2.664 mmは椎骨が受けた実際の変位(Δx試験片)であり、荷重-変位曲線解析に使用される値です。Δx試料 = 記録されたΔx合計 – Δxマシン すべての標本(骨)について収集されたすべてのデータポイントについて、手順2.7〜2.8を繰り返します。注:圧縮試験中に観察される変位は試験片の変位だけでなく、観察された変位は機械の変位(Δxマシン)(フレーム、ロードセル、プラテン、カップリングなどの圧縮/変位など)と試験片(Δx試験片)の組み合わせであるため、このステップは重要です).したがって、小動物(マウスなど)の変位が比較的小さい標本では、システム変位(Δxマシン)が大きな誤差を引き起こす可能性があります。ここで説明したシステムの変位を補正する手順は、Kalidindi と Abusafieh28 によって以前に報告されており、ここで説明した方法に加えて、他の 2 つの方法も詳しく説明しています。何人かの研究者は、システムの変位を決定するために複数の方法を使用することが指摘されています17。各機械は、荷重が加えられたときに、システム変位の独自のパターンと程度を示す場合があります。このため、システム変位補正係数は機械ごとに決定する必要があり、2台の機械間で同じになることはありません。椎骨の圧縮試験とは対照的に、上盤と下盤の間に材料がないため、システム変位を測定する場合、大きな力の減少は観察されません。 3. マウス死骸からの第5腰椎 (L5)の解剖 冷凍マウスの死骸を室温で解凍し、0.9%NaClの等張溶液を定期的に塗布して軟部組織と骨の水分補給に注意します。 尾の付け根近くの背側正中線の皮膚に小さな(<0.5 cm)の切開を行い、切り口を各後肢に広げ、ゆっくりと引っ張って尾の付け根から動物の頭まで毛皮を取り除きます。 脊柱が見やすいまで腹壁の筋肉組織を切り取ります。 解剖顕微鏡で、2つの仙腸関節と仙骨の頭蓋端を視覚化します。 カミソリの刃またはメスを使用して、最後の腰椎(L6)を仙骨の頭蓋端から分離するために細かい切り込みを入れます。 再び、椎間腔の間を切断し、L6とL5を脊柱から取り出し、L5を分析用に取っておきます(図3)。 解剖顕微鏡で椎骨を検査し、椎間板を含むすべての軟部組織を骨から除去し、主にガーゼパッドを使用し、必要に応じて鉗子で優しく使用します。注:本研究では、L5が関心のある椎骨として選択されましたが、他の腰椎を圧迫試験用に選択することができます。 4. PMMA骨セメント包埋法を用いた一軸圧縮試験のためのL5椎骨荷重面の準備 回転工具に取り付けられたダイヤモンドカットオフホイール( 材料表を参照)を使用して、各椎弓根に切り込みを入れ、横方向および棘状の突起を取り除きます(図4)。椎体に取り付けたままにしておくと、椎体突起は、中心全体に荷重が分散されるのではなく、突起自体の上部/下部プラテンとの局所的な接触を引き起こす可能性があります。 120グリットの細かいサンドペーパー( 資料表を参照)を使用して椎骨の尾端をやさしく研磨し、椎間板、軟部組織、および凹凸をすべて取り除きます。 サンディングされた尾端に油性ペンで印を付けて、後で簡単に識別できるようにします。 製造元の指示に従ってPMMA骨セメントを混合します( 材料表を参照)。 PMMA骨セメントがまだ半軟らかい状態で、椎骨の頭蓋(マークのない)端に最小限の量を上に向けて置き、椎骨が生理食塩水浴に座っている間、表面全体が覆われるようにして、骨サンプルを水分補給して冷却します。 PMMAがまだ半軟らかい状態で、尾側(マーク付き)を下に向けて椎骨を底板に配置します(図5)。 機械の電源を入れてドライブギアを噛み合わせ、骨セメントと接触し、最小限の力(<0.5 N)が加えられてPMMAが骨表面に均等に分布するまで、トッププラテンを椎骨+ PMMA骨セメント複合体にゆっくりと下げます。中立位置にあるトッププラテンは水平と推定でき、セミソフトPMMAを押すと、PMMAが椎骨の頭蓋端のくぼみを埋め、トッププラテンの下に平らな水平面を形成します。 上部プラテンがPMMA骨セメントを静かに押し下げた状態で、PMMA骨セメントが完全に硬化するまでサンプルをそのままにします(本研究で使用したPMMA骨セメントの製造元の指示に従って~10分)。この期間中は、サンプルを生理食塩水浴に浸すか、生理食塩水で頻繁にミストして、サンプルを水分補給して冷却します。 PMMA骨セメントが完全に硬化したら、圧縮試験を開始できます。機械的試験のデータ収集用に設計されたデジタルソフトウェアを使用して、センサーからの荷重(力)(N)と変位(たわみ)(mm)のデータをリアルタイムでスプレッドシートに収集します( 材料表を参照)。 <0.5 Nの最小予圧で5秒間ベースラインデータを収集した後、圧縮試験を開始するために、圧縮試験を開始するために、事前に決定された下降速度(~1 mm/min)で、トッププラテンをサンプルに下降させます。 荷重(N)の大幅な減少が観察され、材料の破損が示されたら、データの収集を停止します。注意: メーカーの指示には、PMMA骨セメントのおおよその硬化時間が指定されています。PMMA骨セメントの硬化時間は、使用するPMMA骨セメントの種類によって異なる場合があります。製造元の指示に従って、PMMA硬化の待機時間を決定します。ただし、PMMA骨セメントが完全に硬化したことを示す指標として、PMMA骨セメントの追加サンプルを、椎骨に置きますが、脇に置いておき、まだ柔らかいか完全に硬化しているかを確認するサンプルと同時に混合することができます。完全に硬化している場合、これは、骨+ PMMA複合体を妨げることなく、骨上のPMMAも完全に硬化していることを示している可能性があります。骨サンプルは、PMMAの硬化および試験期間中、十分に水分を補給し、冷却する必要があります。乾燥した空気に数分さらされるだけで、生体力学的特性が変化する可能性があります。一部の研究者は、生理食塩水浴19を備えた圧縮試験機を使用しています。圧縮試験機は、本研究では生理食塩水浴を備えていなかった。代わりに、生理食塩水の細かい霧がPMMA硬化期間とテスト期間を通じて定期的に適用されました。 5. L5椎骨一軸圧縮試験における荷重-変位曲線の解析 荷重(N)と補正変位(mm)のデータをスプレッドシートからコピーして、技術的なグラフ作成およびデータ解析ソフトウェアに貼り付けます( 材料表を参照)。 荷重(N)をy軸、補正試験片変位(Δx試験片、mm)をx軸にグラフを生成します(図6)。ソフトウェアでこれを行うには、最初に Windows、 新しいテーブル、次に [実行 ]をクリックしてテーブルを作成します。補正された変位(mm)と荷重(N)のデータを生データスプレッドシートから新しいテーブルにコピーします。 次に、 データをクリックして生データを表す波形を生成し、 次にXY波形ペア をクリックして、X-Waveの補正変位データとY-Waveのロードデータを選択します。「Number of Points」ボックスに正しいデータポイント数があることを確認し、波形に名前を付けて、「 Make Waveform」をクリックします。波形を作成したら、 Windows→ New Graphをクリックしてグラフを生成し、Y軸に波形を配置し、X軸に「計算」を配置します。 カーソルツールを使用して、分析するグラフ上のポイント/関心領域をマークします。ステップ5.4-5.8(図6)では、一般的な全骨の機械的特性を計算するためのいくつかのポイント/領域について述べており、 破壊までの作業 (N x mm)、 最大荷重 (N)、 剛性 (N/mm)、 降伏荷重 (N)、降伏 後変位 (mm)が含まれます。 故障までの作業量(N x mm)を計算するには、カーソル(A)を試験の開始点に置き、カーソル(B)を材料が破損する直前のポイント(つまり、荷重の大幅な減少が観察される前に試験中に到達した最大荷重)に置きます。注:したがって、カーソルA-Bは、材料が力に耐え始め、変位を起こしてから材料が破損するポイントまでのテスト全体を括弧で囲みます。 故障までの作業 量(N x mm)は、曲線の下の総面積(つまり、カーソルAとBの間の曲線の下の面積)として測定できます。 最大荷重(N)は、テスト中に観察された荷重(つまり、カーソルBでの荷重)の最高値として計算します。 材料の 剛性( N/mm)を線形弾性領域の傾き(つまり、カーソルCとDの間の傾き)として計算します。 降伏荷重(N)は、荷重-変位曲線が線形性から逸脱して塑性領域に入り、永久変形(点Dでの荷重)を維持する荷重です。これは、カーソル D での負荷を測定することによって計算します。 降伏後の変位(mm)は、材料の延性の指標です。これを降伏点と材料破壊点の間の変位(つまり、カーソルDとBの間の変位)として測定します。注:上記のパラメータは、報告されている一般的な全骨の機械的特性の一部にすぎません。これは、荷重-変位曲線から取得できるすべての骨全体の機械的特性の完全なリストではありません。その他の骨全体の機械的特性パラメータには、総変位(mm)、吸収弾性エネルギー(N x mm)、弾性変位(mm)、吸収される塑性エネルギー(N x mm)、および塑性変位(mm)が含まれます。さらに、組織レベルの骨の機械的特性は記載されていません。これらには、骨の直径などの特定の解剖学的測定値を使用したデータ変換が必要です。ソフトウェアで荷重-変位曲線から測定を行うコード例は、 補足ファイル1にリストされています。