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Biology

Tamizado de la pulpa de la fruta para detectar moscas de la fruta Tephritid inmaduras en el campo

Published: July 28, 2023
doi:
10.3791/65501
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1Animal Plant Health Inspection Service (APHIS), Plant Protection and Quarantine (PPQ), Science and Technology (S&T) Miami,United States Department of Agriculture (USDA), 2Division of Plant Industry,Florida Department of Agriculture and Consumer Services, 3APHIS, PPQ, S&T,USDA, 4IFAS, Tropical Research and Education Center,University of Florida, 5Agricultural Research Service (ARS), Pacific Basin Agricultural Research Center,USDA, 6APHIS, PPQ, Field Operations,USDA, 7ARS, Subtropical Horticulture Research Station,USDA

Summary

El aumento de la detección de moscas de la fruta tephritid inmaduras en el campo puede desencadenar esfuerzos oportunos para eliminar las poblaciones de estas plagas destructivas. La detección de larvas de estadio tardío es más rápida y precisa cuando se tritura la fruta huésped en una bolsa y se pasa la pulpa a través de una serie de tamices que el corte manual y la inspección visual.

Abstract

Las moscas de la fruta de la familia Tephritidae se encuentran entre las plagas agrícolas más destructivas e invasivas del mundo. Muchos países emprenden costosos programas de erradicación para eliminar poblaciones incipientes. Durante los programas de erradicación, se realiza un esfuerzo concertado para detectar larvas, ya que esto indica fuertemente una población reproductora y ayuda a establecer la extensión espacial de la infestación. La detección de etapas de vida inmaduras desencadena acciones adicionales de control y regulación para contener y prevenir cualquier propagación adicional de la plaga. Tradicionalmente, la detección larvaria se logra cortando frutas huésped individuales y examinándolas visualmente. Este método requiere mucha mano de obra, ya que solo se puede procesar un número limitado de frutas, y la probabilidad de perder una larva es alta. Se probó una técnica de extracción que combina i) triturar la fruta huésped en una bolsa de plástico, ii) colar la pulpa a través de una serie de tamices, iii) colocar la pulpa retenida en una solución de agua morena y iv) recolectar larvas que flotan a la superficie. El método se evaluó en Florida con guayaba recolectada en el campo naturalmente infestada por Anastrepha suspensa. Para imitar las poblaciones bajas más representativas de un programa de erradicación de moscas de la fruta, los mangos y la papaya en Hawai fueron infestados con un número bajo y conocido de larvas de Bactrocera dorsalis. La aplicabilidad del método se probó en el campo en guayaba naturalmente infestada por B. dorsalis para evaluar el método en condiciones experimentadas por los trabajadores durante un programa de emergencia contra la mosca de la fruta. Tanto en ensayos de campo como de laboratorio, el mushing y tamizado de la pulpa fue más eficiente (requirió menos tiempo) y más sensible (se encontraron más larvas) que cortar fruta. Flotar la pulpa en una solución de agua con azúcar morena ayudó a detectar larvas de estadio anteriores. Mushing y tamizado de la pulpa de la fruta de importantes huéspedes tephritid puede aumentar la probabilidad de detectar larvas durante los programas de emergencia.

Introduction

Las moscas de la fruta Tephritid se encuentran entre las plagas agrícolas más destructivas, con los géneros Anastrepha, Bactrocera y Ceratitis que representan el mayor riesgo1. Muchas áreas están en alto riesgo de establecimiento de moscas exóticas de la fruta, basadas en 1) incursiones históricas y programas asociados de delimitación y erradicación, 2) la alta tasa de llegada de material huésped de la mosca de la fruta en los puertos de entrada, y 3) condiciones climáticas favorables para el establecimiento de poblaciones reproductoras. El estado de California experimenta múltiples incursiones y detecciones de tefrítides anualmente2. Ha habido más de 200 incursiones y programas de erradicación contra tefrítidos a nivel mundial durante el último siglo, y esto se ha acelerado significativamente en las últimas décadas3. Aunque la gran mayoría de estos programas tienen éxito en la erradicación de la mosca invasora de la fruta3,4, la carga económica y ambiental de estas invasiones sigue siendo alta, y la posibilidad de establecimiento siempre está presente; un ejemplo catastrófico reciente es la infección de Bactrocera dorsalis en el continente africano5.

Durante los programas de emergencia contra la mosca de la fruta, se realiza un esfuerzo concertado para detectar y controlar las poblaciones reproductoras de las especies invasoras. Por ejemplo, el estado de Florida responde a las incursiones de tefritidas aplicando empapados en el suelo (bajo la línea de goteo de las plantas huésped frutales) y eliminando la fruta huésped en un radio de 200 m alrededor de los sitios donde se encuentran hembras y / o larvas apareadas6. Estas acciones y tácticas sirven para matar larvas y pupas en el suelo y eliminar los huevos y larvas de la fruta dentro del área. En algunos programas de erradicación, se elimina una cantidad significativa de fruta huésped. En 2015, más de 100,000 kg de fruta fueron destruidos durante el programa de erradicación de B. dorsalis en Florida6. Las pérdidas económicas para los productores y las industrias asociadas solo en el área bajo cuarentena se estimaron en más de $ 10.7 millones7.

Para encontrar larvas de tefritidas en las áreas bajo cuarentena, un pequeño equipo de entomólogos recolecta frutas huésped en un radio de 200 m alrededor de un área de detección de moscas hembras y corta e inspecciona visualmente cada fruta en busca de larvas6. Con recursos de personal limitados y cientos de posibles anfitriones, la tarea se vuelve difícil, particularmente en las áreas donde la diversidad de plantas tanto en áreas de producción comercial como en patios residenciales es alta. Además, las larvas pueden pasarse por alto al cortar frutas huésped. En un estudio que evaluó el corte de fruta en los puertos de entrada, se encontró que el corte de fruta no era tan efectivo para detectar A. suspensa en comparación con mantener las frutas infestadas durante varias semanas y contar las larvas y pupas encontradas en el sustrato de pupación8.

Existen alternativas al corte de fruta para detectar una infestación 9,10,11,12,13. Por ejemplo, una flotación de azúcar morena y un método de agua caliente son procedimientos aceptados utilizados para detectar moscas occidentales de la cereza en cerezas cosechadas 9,10. El método de azúcar moreno consiste en colocar la fruta triturada en una solución de agua azucarada y recolectar larvas que flotan hacia la parte superior. El método de flotación del azúcar moreno se desarrolló específicamente para cumplir con las normas reglamentarias para las cerezas exportadas, que requieren que las empacadoras monitoreen las plagas cuarentenarias de la mosca de la fruta. También existe un programa aprobado de certificación de arándanos de Estados Unidos y Canadá que incluye flotación con agua morena, flotación con agua salada o ebullición para apoyar el fitosaneamiento14. Al probar la precisión de la flotación de azúcar y agua caliente, los investigadores utilizaron el método de tamizado para determinar cuántas larvas se pierden 9,10,11,12,13. Un estudio mostró que mezclar arándanos triturados en una solución salina y filtrar la solución a través de un filtro de café reutilizable fue cuatro veces mejor para detectar larvas de Drosophila suzukii que inspeccionar visualmente la superficie de soluciones de sal y azúcar14. Además, se utilizó cromatografía de gases para la detección de larvas de A. suspensa en cítricos15. Estos enfoques no han sido probados para su aplicabilidad en estudios de campo.

Nuestro objetivo era desarrollar y probar un método para encontrar larvas de tefritidas en el campo utilizando tamizado y flotación de agua azucarada. Este método permite la detección más eficiente de moscas de la fruta inmaduras que el método tradicional de corte de frutas, apoyando el control oportuno de las poblaciones reproductoras durante los programas de erradicación de la mosca de la fruta.

Protocol

1. Selección de frutas Determine qué fruta está disponible en el área a inspeccionar. Seleccione la fruta huésped según la lista de huéspedes conocidos para la especie de tefrítido objetivo. Elija frutas maduras de pulpa suave, como mangos, papaya y guayaba. Las frutas inmaduras o de pulpa dura, como las almendras tropicales, deben inspeccionarse con un método diferente, como el corte de frutas. Seleccione fruta caída, demasiado madura o fruta madura en árboles que tengan signos de daño, cicatrices de oviposición y puntos blandos. Procese aproximadamente 2 L de frutas a la vez (por ejemplo, 5 guayabas o 5 mangos de tamaño mediano constituyen muestras adecuadas para este método). El número de frutas que se pueden procesar a la vez depende del tamaño de las frutas (Figura 1A). 2. Mushing Corte la fruta en trozos grandes y colóquela en una bolsa de almacenamiento con cierre hermético de 4 L (Figura 1B). Agregue agua a la bolsa hasta que el agua cubra la fruta picada en 25-50 mm (Figura 1C). Exprima la fruta suavemente a mano hasta que toda la pulpa se haya desprendido de la cáscara y tenga una consistencia suave (es decir, sin trozos grandes) (Figura 1D). 3. Tamizado para la colección tardía de instar Apilar los tamices. Use tamices grandes (457 mm de diámetro) para procesar grandes cantidades de frutas (~ 5 frutas a la vez) y tamices más pequeños (305 mm de diámetro) para frutas individuales o muestras más pequeñas (< 5 frutas). Apile el tamiz con un tamiz de malla grande (No. 8; 2.36 mm) encima de un tamiz de malla pequeña (No. 20; 0.85 mm). Para la detección de estadios tempranos, coloque un tercer tamiz (No. 45; 0.35 mm) en la parte inferior de la pila (Figura 1E). Vierta la pulpa en el tamiz superior (Figura 1F). Lave bien la pulpa a través de la pila de tamices con agua de un grifo, manguera o botella hasta que la pulpa fina haya pasado a través de los tamices (Figura 1G). Escanee visualmente los tamices superiores en busca de larvas de estadio tardío que podrían haber sido retenidas con la cáscara o cualquier trozo grande de fruta (Figura 1H). Inspeccione cuidadosamente el segundo tamiz para detectar larvas de estadio tardío. Con grandes cantidades de pulpa fina, puede ser necesario un enjuague adicional. Recolecte las larvas de los tamices con fórceps larvales y colóquelas en viales con 70% de EtOH. 4. Flotación de azúcar para la recolección temprana de estadios Premezcle la solución de azúcar disolviendo 453 g (1 caja) de azúcar moreno oscuro en 2 L de agua del grifo, lo que produce una lectura de Brix de 19°10. Lave la pulpa de los tamices de malla más fina (por ejemplo, No. 20 y No. 45) hasta el borde del tamiz con agua del grifo, luego mueva el material a una bandeja de plástico (11 L). Agregue la solución de azúcar moreno hasta que cubra la pulpa en 25-50 mm y agregue 2 gotas de antiespumante. Deje que la pulpa repose en la solución de azúcar morena durante unos 5 minutos. Recolecte las larvas que flotan a la superficie de la solución con pinzas larvales en viales con 70% de EtOH. 5. Curación larvaria Etiquete un vial con el lugar de recolección, la fecha, el tipo de fruta y el recolector para su posterior examen e identificación.

Representative Results

Extracción temprana y tardía de Anastrepha suspensa de fruta recolectada en el campoEn este experimento, hemos comparado los métodos de corte de fruta y mushing, tamizado y flotación (MSF) con respecto a la proporción de larvas detectadas y el tiempo medio requerido para detectarlas. La guayaba, altamente infestada con las larvas de Anastrepha suspensa, se recolectó de una planta ubicada en la Universidad de Florida, Instituto de Ciencias Alimentarias y Agrícolas, Centro de Investigación y Educación Tropical, Homestead, FL. Los frutos se clasificaron aleatoriamente en grupos de 5 y se asignaron a 1 de 2 métodos de extracción larvaria: 1) corte manual o 2) método MSF. Se registró el tiempo para recolectar todas las larvas visibles a simple vista utilizando cada método de extracción. El método de corte manual siguió el método que se utiliza actualmente en un programa de erradicación. A cada uno de los 5 trabajadores (n = 5) se le asignaron 5 frutas para buscar todas las etapas de las larvas cortando las frutas en trozos más pequeños e inspeccionando visualmente la pulpa. Para determinar si las larvas se perdieron en la inspección visual, los trozos de fruta cortados a mano se volvieron a inspeccionar utilizando un microscopio de disección (10x). Para el método MSF, 5 frutas se cortaron en trozos grandes (50-80 cm), se colocaron en bolsas con cierre hermético y se exprimieron suavemente a mano hasta que toda la pulpa se desprendió de la cáscara y la pulpa tuvo una consistencia suave (es decir, sin trozos grandes). La fruta triturada se coló a través de una serie de tamices de latón grandes (45,7 cm). La malla más grande (No. 8) se apiló en la parte superior, seguida de un número No. 20 y un tamiz de malla No. 45. El personal asignado a este tratamiento lavó la pulpa a través de la malla utilizando agua de una manguera conectada a un grifo del fregadero. Las larvas del estadio tardío eran evidentes en los tamices. Los estadios más pequeños se mezclaron con pulpa, lo que los hacía difíciles de ver y eliminar. Por lo tanto, la mezcla de pulpa / larva de los tamices se puso en cubos con 1 L de solución de agua de azúcar morena. Las larvas flotaron inmediatamente a la superficie. La solución se agitó suavemente, y después de 5 minutos, las larvas se retiraron de los cubos y se contaron. El tiempo para procesar la fruta fue una combinación de mushing, tamizado y eliminación de las larvas de la solución de agua azucarada. Los datos para el número de larvas encontradas a través de los métodos de corte o tamizado manual y flotación fueron analizados mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis (p = 0,05)16. El método MSF produjo un mayor número de larvas (Figura 2A) y más larvas por minuto (Figura 2B) que el corte manual. Aunque la detección de los diferentes estadios no se cuantificó en este estudio, observamos que todos los estadios (primero, segundo y tercero) se encontraron utilizando tamices, mientras que solo los estadios posteriores (segundo y tercero) se vieron mediante corte manual. Cuando las muestras previamente cortadas e inspeccionadas visualmente se volvieron a inspeccionar con un microscopio de disección, se perdió el 40% de las larvas del estadio tardío que infestaban los frutos. Sin embargo, los estadios anteriores se encontraron principalmente con la reinspección. Este experimento demostró que el uso del método MSF es más efectivo y eficiente para encontrar larvas en frutas altamente infestadas. Sin embargo, es más probable que se encuentren frutas infestadas con un menor número de larvas en un programa de erradicación, donde las especies invasoras serían muy raras. Por lo tanto, realizamos un estudio de laboratorio en el que la fruta huésped estaba infestada con un número conocido y bajo de larvas. Infestación manual de mango y papaya para simular infestación baja por Bactrocera dorsalisEste experimento comparó los métodos de corte de fruta y MSF con respecto a la proporción de larvas detectadas y el tiempo requerido para detectarlas cuando la infestación era relativamente baja. La infestación manual se utilizó como una herramienta experimental para evaluar la eficacia de cada método, ya que el número de larvas presentes se conocía con certeza. Se utilizó un barrenador de corcho (1,0 cm de diámetro) para hacer 5 agujeros en frutas individuales de mango y papaya que estaban libres de larvas de mosca de la fruta. Una sola larva de B. dorsalis se colocó en cada uno de los 5 agujeros de un subconjunto de la fruta. Los agujeros se taparon con la pieza perforada de la fruta y la fruta restante se tapó sin insertar larva para simular visualmente la infestación manual. Los frutos se mantuvieron a 27 °C durante 48 h para permitir el desarrollo larvario. El experimento se llevó a cabo en el laboratorio del ARS en Hilo, Isla Hawái (n = 5 trabajadores) y en el laboratorio APHIS-PPQ en Isla Oahu, Hawái (n = 4 trabajadores). Para el corte de frutas, cada trabajador recibió 5 mangos (1 infestado con 1 larva y 4 no infestados) y 4 papayas (una infestada y 3 no infestadas). Un trabajador cortaba cada fruta individualmente en trozos cada vez más pequeños e inspeccionaba continuamente la pulpa en busca de moscas de la fruta inmaduras. La búsqueda se detuvo cuando la pulpa fue inspeccionada minuciosamente. Se registró el número total de larvas encontradas y el tiempo empleado por cada trabajador para procesar todos los frutos por esqueje (Figura 3) y (Figura 4). Cada trabajador recibió otro juego similar de frutas (5 mangos y 4 papayas) para triturar o tamizar (sin corte de fruta involucrado), con 2 piezas infestadas como se describió anteriormente. La pulpa se vertió en el tamiz superior y se lavó a través de la pila de tamices con agua de un grifo y se eliminaron las larvas, como se describe en el protocolo. El experimento se realizó dos veces, con flotación de azúcar y sin flotación de azúcar, para determinar si la eliminación del paso de flotación aumentaría la velocidad del proceso sin perder sensibilidad (es decir, se encontraron todas o la mayoría de las larvas) (Figura 3). Se registró el número de larvas encontradas y el tiempo empleado por cada trabajador para procesar la fruta a través del método de corte, MSF o MS. Tanto para los mangos como para las papayas, el método completo de MSF (flotación incluida) resultó en un mayor número de detecciones larvales y fue más rápido que el corte de frutas (Tabla 1). Los trabajadores que utilizaron el método tradicional de corte de frutas omitieron 32% y 35% de las larvas colocadas en mangos y papaya, respectivamente (Tabla 1). El procesamiento de frutas a granel utilizando la técnica de MSF requirió un 30% menos de tiempo que cortar mangos individuales y un 35% menos de tiempo que cortar papayas individuales (Figura 3). Se encontraron más larvas por minuto utilizando el método MSF para papaya (Figura 3C) y mango (Figura 3D) en comparación con el método de corte de frutas. Todas las larvas encontradas estaban vivas. La identificación morfológica larvaria solo es posible para los estadios tardíos. Repetimos el experimento anterior, pero omitimos el procedimiento de flotación para determinar si la recuperación de las larvas seguía siendo alta y la velocidad de procesamiento de la fruta aumentaba. El método MS (con flotación omitida) resultó en más detecciones larvales de papaya (Figura 4A) y mango (Figura 4B) en comparación con el corte y la inspección visual. Además, la técnica fue más rápida que cortar e inspeccionar visualmente la papaya (Figura 4C) y el mango (Figura 4D). La eliminación del paso de flotación del método MSF redujo el tiempo para encontrar larvas de estadio tardío en un 90% para la papaya y en un 48% para los mangos (Tabla 2). El porcentaje de larvas encontradas fue alto para ambos métodos y fue consistentemente mayor para la EM (se omite la flotación). Para la papaya, el 80% y el 85% de las larvas se recuperaron de los métodos MSF y MS, respectivamente (Tabla 1 y Tabla 2). Para el mango, 88% y 95% fueron recuperados de los métodos MSF y MS, respectivamente (Tabla 1 y Tabla 2). Comparación de campo de los métodos de corte de fruta y MSFEl objetivo de este experimento fue comparar los métodos de corte de fruta y MSF en condiciones de campo, imitando un programa de emergencia contra la mosca de la fruta. El procesamiento de la fruta se llevó a cabo sin la conveniencia y la infraestructura del laboratorio para probar la preparación de campo de los dos métodos de extracción de larvas. El trabajo se llevó a cabo en un huerto de guayaba ubicado en la Unidad de Germoplasma de Investigación de Recursos Genéticos y Enfermedades de Plantas Tropicales del USDA-ARS cerca de Hilo. Se recolectaron un total de 40 guayabas con signos de infestación y se dividieron en 2 grupos. Un total de 20 guayabas fueron sometidas a corte / inspección visual seguida de MSF (flotación incluida), lo que permitió evaluar la sensibilidad del método de corte en comparación con el método de MSF. La disección procedió como se describió anteriormente. Cuando se detectó, las larvas fueron removidas y contadas. Cuatro trabajadores diseccionaron 5 guayabas cada uno, y el tiempo requerido para cortar e inspeccionar se registró para cada trabajador. El corte posterior a la MSF se realizó como se mencionó anteriormente, excepto que se utilizó un tercer tamiz de malla más pequeña (No. 40, 0.420 mm) además de los tamices No. 8 y No. 20 para recolectar larvas más pequeñas. El segundo conjunto de 20 guayabas se colocó en 2 bolsas con cierre hermético (10 frutas por bolsa) y se sometieron solo a MSF (es decir, sin corte), lo que permitió comparar el tiempo necesario para el corte de fruta versus MSF. Como se mencionó anteriormente, se utilizaron tres tamices en este procedimiento. Se registró el número de larvas encontradas y el tiempo total para procesar la fruta (triturar y mantener la fruta durante 5 minutos en la bolsa / tamizar / flotar en solución de azúcar). Como se encontró en el laboratorio, el corte de fruta subestimó la infestación de fruta y fue muy variable, detectando entre un 25% y un 83% menos de larvas de las que se podían recuperar utilizando métodos de MSF (Tabla 3). Además, en la muestra con bajo número de larvas, MSF recuperó un 500% más de larvas, proporcionando una mayor sensibilidad al ensayo y una mayor posibilidad de identificar el organismo infestante. Las frutas se procesaron mucho más rápido utilizando el método MSF en comparación con el corte; cortar e inspeccionar 5 frutas requirió aproximadamente la misma cantidad de tiempo que procesar 10 frutas a través de MSF. Figura 1: Pasos del protocolo de extracción de larvas de mosca de la fruta. (A) Procesar aproximadamente 2 L por volumen de fruta a la vez (por ejemplo, 5 guayabas o 5 mangos medianos constituyen muestras adecuadas para este método). (B) Corte la fruta en trozos grandes y colóquela en una bolsa de almacenamiento con cierre hermético de 4 L. (C) Agregue agua a la bolsa hasta que el agua cubra la fruta picada en 25-50 mm. (D) Exprima la fruta suavemente a mano hasta que toda la pulpa se haya desprendido de la cáscara y tenga una consistencia suave (es decir, sin trozos grandes). (E) Apile el tamiz con el tamiz de malla grande (No. 8; 2.36 mm) encima seguido del tamiz de malla pequeña (No. 20; 0.85 mm). Para los estadios tempranos, coloque un tercer tamiz (No. 45; 0.35 mm) en la parte inferior de la pila. (F) Vierta la pulpa en el tamiz superior. (G) Lave bien la pulpa a través de la pila de tamices usando agua de un grifo, manguera o botella hasta que la pulpa fina haya pasado por el primer tamiz. (H) Escanee visualmente los tamices superiores en busca de larvas de estadio tardío que podrían haber sido retenidas con la cáscara o cualquier trozo grande de fruta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Extracción temprana y tardía de Anastrepha suspensa de fruta recolectada en el campo. El número medio (± error estándar de la media [SE]) de larvas de Anastrepha suspensa de cinco frutos de guayaba recolectados cortando e inspeccionando visualmente (corte: 70.4 ± 11.9) o lavando la pulpa a través de una serie de tres tamices seguidos de remojo de la pulpa en una solución de agua azucarada (MSF: 175.6 ± 21.91) (A). El número medio de larvas (±SE) recolectadas por minuto de 5 guayabas procesadas por esqueje (1,21 ± 0,16) y por MSF (3,71 ± 0,50) (B). Cada método se replicó 5 veces, y los asteriscos por encima de las barras indican diferencias significativas para el número de larvas (χ 2 = 6.81, p < 0.01) y el tiempo de procesamiento (χ2 = 6.80, p < 0.01) basado en una prueba de Kruskal-Wallis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Validación del método completo de mushing-tamizado-flotación utilizando infestación manual de mango y papaya para simular infestación baja por Bactrocera dorsalis. El número medio de larvas de Bactrocera dorsalis (±SE) encontradas en papaya (esqueje: 3,25 ± 0,51, MSF: 4,0 ± 0,4) (A) y mango (esqueje: 3,4 ± 0,51, MSF: 4,4 ± 0,4) (B) frutos y el número medio de larvas (±SE) recolectadas por minuto de papaya (corte: 0,21 ± 0,1, MSF: 0,4 ± 0,15) (C) y mango (corte: 0,14 ± 0,01, MSF: 0,21 ± 0,03) (D). Frutos que fueron procesados usando el esqueje o los métodos MSF (flotación incluida, n = 5) infestados manualmente con 5 larvas de tercer estadio. Los asteriscos sobre las barras indican diferencias significativas para el número de larvas encontradas en la papaya (χ 2 = 5.39, p = 0.02) y el mango (χ2 = 3.94, p = 0.05) en comparación con el corte de fruta basado en las pruebas de Kruskal-Wallis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Validación del método de mushing-tamizado (flotación eliminada) utilizando infestación manual de mango y papaya para simular infestación baja por Bactrocera dorsalis. El número medio de larvas (±SE) encontradas en papaya (corte: 1.25 ± 0.48, MS: 4.25 ± 0.48) (A) y mango (corte: 2.5 ± 0.5, MS: 4.75 ± 0.25) (B) frutos y el número promedio de larvas recolectadas por minuto (±SE) en papaya (corte: 0.15 ± 0.05, MS: 0.76 ± 0.15) (C) y mango (corte: 0.16 ± 0.04, MS: 0.44 ± 0.04) (D). Los frutos se infestaron manualmente con 5 larvas de Bactrocera dorsalis de tercer estadio y se procesaron cortando e inspeccionando visualmente (corte) o triturados en una bolsa y lavados a través de tamices (solo mushing y tamizado, sin flotación, n = 4). Los asteriscos por encima de las barras indican diferencias significativas para el número de larvas encontradas en la papaya (χ 2 = 5.46, p = 0.02) y el mango (χ 2 = 5.25, p = 0.02) y el tiempo para procesar la papaya (χ 2 = 5.39, p = 0.02) y el mango (χ 2 = 5.39, p = 0.02) en comparación con el corte de frutas, según las pruebas de Kruskal-Wallis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Fruta # Fruta procesada #Larvae añadido Método de procesamiento #Larvae encontrado Tiempo de procesamiento (min)* % de recuperación Mango 25 25 Cortante 17 158 68% Mango 25 25 MSF 22 113 88% Papaya 16 20 Cortante 13 62 65% Papaya 16 20 MSF 16 40 80% *Tiempo total sumado más de 5 trabajadores. Tabla 1: El número de larvas recuperadas y el tiempo para procesar la fruta mediante el método de corte e inspección visual (corte) o el método completo de mushing, tamizado y flotación (MSF). La fruta de prueba se infestó manualmente con 5 larvas de tercer estadio mezcladas con fruta aburrida y tapada (1 de los 5 mangos, 1 de las 4 papayas). Fruta # Fruta procesada #Larvae añadido Método de procesamiento #Larvae encontrado Tiempo de procesamiento (min)* % de recuperación Mango 20 20 Cortante 10 66 50% Mango 20 20 SRA. 19 44 95% Papaya 16 20 Cortante 5 38 25% Papaya 16 20 SRA. 17 25 85% *Tiempo total sumado más de 4 trabajadores. Tabla 2: El número de larvas recuperadas y el tiempo para procesar la fruta cortando o mushing y tamizando solamente, flotación omitida (MS). Las frutas de prueba se infestaron manualmente con cinco larvas de tercer estadio mezcladas con fruta aburrida y tapada (1 de cada 5 mangos, 1 de cada 4 papayas). Trabajador/método #Fruit procesado Tiempo de procesamiento (min) #Larvae encontrado cortando #Larvae encontrado MSF* % del recuento total de larvas encontradas por corte Trabajador 1: corte 5 18 33 14 70% Trabajador 2: corte 5 18 1 5 17% Trabajador 3: corte 5 26 9 11** 75% Trabajador 4: corte 5 20 24 Trabajador 5: MSF 10 22 NA 22 NA Trabajador 6: MSF 10 18 NA 37 NA * La pulpa del corte y la inspección visual se procesaron nuevamente utilizando el método MSF para determinar el número de larvas tardías del 2º-3º estadio omitidas ** Pulpa de los trabajadores 2 y 3 frutas agrupadas antes del procesamiento utilizando el método MSF Tabla 3: El número de larvas encontradas en la guayaba recolectada en el campo cortando e inspeccionando visualmente la fruta (corte) o cortando, tamizando y flotando (MSF) la fruta.

Discussion

Nuestro objetivo era desarrollar una forma eficiente y efectiva de encontrar larvas de tefrítidos en el campo. La motivación para lanzar un programa de erradicación o establecer un área bajo cuarentena es la detección de hembras o larvas apareadas6, lo que indica una población reproductora. El método actual de cortar y buscar visualmente la fruta es ineficiente para encontrar larvas, ya que generalmente hay muchas más frutas huésped presentes de las que se pueden inspeccionar individualmente. Además, las poblaciones de tefrrítidos son probablemente bajas en un área de nueva invasión, lo que hace que las posibilidades de encontrar larvas en una gran cantidad de fruta sean increíblemente difíciles. Por ejemplo, en el programa de erradicación de Bactrocera dorsalis 2015 en Florida, se identificaron 54 especies hospedadoras diferentes y se cortaron más de 4,000 frutas. En este programa de erradicación, solo se encontraron unas pocas larvas en el mango, y no se encontraron otros huéspedes infestados6. Encontramos que el método MSF / MS fue más sensible y más rápido en la detección de larvas de A. suspensa y B. dorsalis al procesar frutas que tenían una gran cantidad de pulpa (mangos, guayaba y papaya) a granel en comparación con el corte de frutas. La mayor cantidad de frutas huésped que es posible inspeccionar utilizando el método de mushing y tamizado, combinada con el aumento de la detección de una larva rara, podría aumentar la probabilidad de que se encuentre una infestación temprano. La detección temprana de una población reproductora podría aumentar la probabilidad de erradicación y reducir los costos del programa.

Nuestros experimentos mostraron que el número de larvas detectadas por los trabajadores que cortan e inspeccionan visualmente las frutas varió considerablemente. Los trabajadores que cortaban la fruta perdieron el 50% y el 75% de las larvas de B. dorsalis colocadas en mangos y papaya, respectivamente. En contraste, solo el 5% y el 15% de las larvas se perdieron utilizando el método MS para procesar la fruta de mango y papaya, respectivamente. Del mismo modo, un estudio que evaluó el corte de frutas en los puertos de entrada mostró que había una variación considerable en el número de frutas infestadas y larvas encontradas por los inspectores8. El estudio mostró que los inspectores portuarios experimentados pasaron por alto el 64% -99% de las larvas de A. suspensa y el 16% -82% de la fruta infestada cuando la fruta fue cortada e inspeccionada visualmente8. Nuestros resultados sugieren que el método de mushing y tamizado podría disminuir la probabilidad de que un trabajador no detecte una fruta infestada.

La flotación de azúcar y agua caliente son protocolos aceptados en un método de enfoque sistémico para garantizar que las cerezas y los arándanos estén libres de moscas de la fruta14. Un subconjunto de un envío se tritura en la solución, con lo cual un inspector examina visualmente la superficie de la solución de azúcar para detectar la presencia de huevos y larvas. Aunque se puede procesar un mayor número de frutos en comparación con el corte de fruta individual, la probabilidad de encontrar larvas utilizando estas técnicas todavía se ve afectada por la capacidad del inspector, la etapa y el número de larvas presentes, y el tipo de fruta8. Encontramos que, al igual que otros tefrítidos, B. dorsalis y A. suspensa se desprenden de la pulpa de la fruta y flotan hacia la superficie. Curiosamente, encontramos que con larvas de estadio tardío más grandes, que son el objetivo en los programas de emergencia y erradicación, ya que pueden identificarse morfológicamente, incluida la flotación de azúcar, no aumentó la precisión del método. De hecho, agregar el método de flotación aumentó el tiempo de procesamiento en un 90% para la papaya y en un 48% para el mango. El aumento del tiempo de procesamiento más los materiales adicionales (es decir, agua, contenedores, azúcar, etc.) no admiten operativamente la adición de este paso cuando se buscan estadios grandes en el campo. El método de flotación de azúcar puede ser apropiado cuando el objetivo es detectar todas las etapas, incluidos los estadios tempranos, como en los puertos de entrada y las empacadoras. El filtrado de la solución de azúcar con un tamiz de malla fina probablemente proporcionaría la detección más precisa de huevos y estadios larvales tempranos11,12.

Las técnicas MS y MSF funcionan bien con frutas que se pueden triturar fácilmente y tienen un gran volumen de pulpa. Las larvas de Tephritid tienden a excavar en la pulpa de la fruta, lo que dificulta la detección visual. Un aspecto crítico de los métodos MS y MSF es separar las larvas de la pulpa. El proceso de tamizado elimina la pulpa, exponiendo así las larvas en pantallas de tamiz. Del mismo modo, el método de agua azucarada separa las larvas de la pulpa haciendo que las larvas floten, mientras que la pulpa se hunde hasta el fondo de la sartén. Las larvas separadas de la pulpa por los métodos MS o MSF se observan fácilmente moviéndose en la pantalla del tamiz o en la superficie del agua. Aunque el método de mushing, tamizado y, opcionalmente, flotación mejoró en gran medida la velocidad y la precisión de la detección de larvas de tefritida en frutas huésped importantes, el proceso puede no ser apropiado para todas las frutas. Por ejemplo, la fruta huésped con pulpa dura, como los aguacates verdes o la fruta con una semilla / hueso grande y una cantidad relativamente pequeña de pulpa, como las almendras tropicales, puede ser más fácil de procesar mediante corte manual e inspección visual.

Encontramos que los métodos MS y MSF fueron más rápidos cuando se procesó un número relativamente pequeño de fruta (5-10). La diferencia probablemente sería mayor si se procesaran mayores cantidades de frutas, lo que podría ser necesario y típico de los programas de emergencia contra la mosca de la fruta. La eliminación del paso de flotación aumentó aún más la velocidad de detección sin comprometer la precisión de encontrar larvas grandes de tefrítido (>3 mm). Demostramos que estas técnicas podían llevarse al campo, que simulaba las condiciones experimentadas por los trabajadores durante un programa de emergencia contra la mosca de la fruta. Nuestros estudios indican que los métodos de EM pueden permitir una detección más oportuna de larvas de estadio tardío y la posterior erradicación de las poblaciones reproductoras de tephritid. MSF podría usarse para detectar huevos y estadios tempranos que actualmente no son objeto de programas de erradicación.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a Silvia Durand, Teri Allen, José Alegría y Alejandra Canon por su ayuda en el procesamiento de la guayaba en la Universidad de Florida, a Rick Kurashima, Jean Auth y Bruce Inafuku por su ayuda en la evaluación de la fruta infestada artificialmente en Hawai, y a Michael Stulberg por sus útiles comentarios sobre versiones anteriores del manuscrito. Este proyecto fue financiado en parte por el USDA APHIS y el Acuerdo de Cooperación de la Universidad de Florida y apoyado en parte por USDA-ARS (proyecto 2040-22430-027-00D). Los hallazgos y conclusiones en esta publicación preliminar no han sido difundidos formalmente por el USDA y no deben interpretarse como una determinación o política de la agencia. La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación tiene el único propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o respaldo por parte del USDA. El USDA es un proveedor y empleador de igualdad de oportunidades.

Materials

Anti foamer MicroLubrol ML200-50-4 MicroLubrol 2000 Fluid Pure Silicone Oil, https://www.microlubrol.com
Brown Sugar Dominos 1 lb Box  Dark Brown Sugar Crystals, https://www.dominosugar.com/products/dark-brown-sugar
Cutting Boards KitchenAid KE703NOSMGA KitchenAid Classic Nonslip Plastic Cutting Board, 12×18-Inch, https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11×14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&crid=UXMLNC72BL0
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Dish Pans Sterilite 06578012 White 12 qrt Dishpan, https://www.amazon.com/STERILITE-06578012-Sterilite-White-Dishpan/dp/B0039V2G5E/ref=sr_1_1?crid=2SMBMLFJF18U&keywords=
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EthOH Fisher Scientific BP8202500 Ethanol Solution 96%, Molecular Biology Grade, https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500
Glass Vials Fisher Scientific 0333921H Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials With Closures, https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H
Knives Zyliss 31380 5.25" Utility Knife, https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&keywords=
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No. 20 Mesh sieves Hogentogler & Co. Inc. 4221 U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
No. 45 Mesh sieves Hogentogler & Co. Inc. 4226 U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
No. 8 Mesh sieves Hogentogler & Co. Inc. 4215 U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
Soft Forceps DR Instruments DRENTF01 DR Instruments Featherweight Entomology Forceps, https://www.amazon.com/DR-Instruments-DRENTF01-Featherweight-Entomology/dp/B008RBLO8Q
Zipper Lock Storage Bags Ziploc 682254 Ziploc brand 2 gal Clear Freezer Bags, https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&keywords=
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Roda, A. L., Steck, G., Fezza, T., Shelly, T., Duncan, R., Manoukis, N., Carvalho, L., Fox, A., Kendra, P., Carrillo, D. Sieving Fruit Pulp to Detect Immature Tephritid Fruit Flies in the Field. J. Vis. Exp. (197), e65501, doi:10.3791/65501 (2023).
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