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Peneiramento de polpa de frutas para detecção de moscas tefritídeos imaturas no campo

Published: July 28, 2023
doi:
10.3791/65501
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1Animal Plant Health Inspection Service (APHIS), Plant Protection and Quarantine (PPQ), Science and Technology (S&T) Miami,United States Department of Agriculture (USDA), 2Division of Plant Industry,Florida Department of Agriculture and Consumer Services, 3APHIS, PPQ, S&T,USDA, 4IFAS, Tropical Research and Education Center,University of Florida, 5Agricultural Research Service (ARS), Pacific Basin Agricultural Research Center,USDA, 6APHIS, PPQ, Field Operations,USDA, 7ARS, Subtropical Horticulture Research Station,USDA

Summary

Aumentar a detecção de moscas-das-frutas tefritídeos imaturas no campo pode desencadear esforços oportunos para eliminar populações dessas pragas destrutivas. A detecção de larvas de ínstar tardio é mais rápida e precisa ao acumular frutos hospedeiros em um saco e passar a polpa por uma série de peneiras do que o corte manual e a inspeção visual.

Abstract

As moscas-das-frutas da família Tephritidae estão entre as pragas agrícolas mais destrutivas e invasoras do mundo. Muitos países empreendem programas dispendiosos de erradicação para eliminar populações incipientes. Durante os programas de erradicação, um esforço concentrado é feito para detectar larvas, pois isso indica fortemente uma população reprodutora e ajuda a estabelecer a extensão espacial da infestação. A detecção de estágios de vida imaturos desencadeia ações adicionais de controle e regulamentação para conter e prevenir qualquer propagação adicional da praga. Tradicionalmente, a detecção de larvas é realizada cortando frutos hospedeiros individuais e examinando-os visualmente. Este método é trabalhoso, pois apenas um número limitado de frutos pode ser processado, e a probabilidade de perder uma larva é alta. Foi testada uma técnica de extração que combina i) cogumelo de frutos hospedeiros em um saco plástico, ii) coação da polpa através de uma série de peneiras, iii) colocação da polpa retida em solução de água com açúcar mascavo e iv) coleta de larvas que flutuam até a superfície. O método foi avaliado na Flórida com goiabas naturalmente infestadas por Anastrepha suspensa. Para mimetizar populações baixas mais representativas de um programa de erradicação de moscas-das-frutas, mangas e mamão no Havaí foram infestados com um número conhecido e baixo de larvas de Bactrocera dorsalis . A aplicabilidade do método foi testada em campo em goiabas naturalmente infestadas por B. dorsalis para avaliar o método nas condições experimentadas pelos trabalhadores durante um programa emergencial de moscas-das-frutas. Tanto nos ensaios de campo quanto de laboratório, o cogumelo e o peneiramento da polpa foram mais eficientes (demandaram menos tempo) e mais sensíveis (mais larvas encontradas) do que o corte dos frutos. A flutuação da polpa em solução de água com açúcar mascavo ajudou a detectar larvas de ínstar mais precoces. O cogumelo e o peneiramento da polpa de frutos de importantes hospedeiros tefritídeos podem aumentar a probabilidade de detecção de larvas durante programas de emergência.

Introduction

As moscas-das-frutas tefritídeos estão entre as pragas agrícolas mais destrutivas, sendo os gêneros Anastrepha, Bactrocera e Ceratitis os de maior risco1. Muitas áreas estão em alto risco para o estabelecimento de moscas-das-frutas exóticas, com base em 1) incursões históricas e programas de delimitação e erradicação associados, 2) a alta taxa de chegada de material hospedeiro de moscas-das-frutas nos portos de entrada e 3) condições climáticas favoráveis para o estabelecimento de populações reprodutoras. O estado da Califórnia experimenta múltiplas incursões e detecções de tefritídeos anualmente2. Houve mais de 200 incursões e programas de erradicação contra os tefritídeos em todo o mundo no último século, e isso se acelerou significativamente nas últimas décadas3. Embora a grande maioria desses programas seja bem-sucedida na erradicação da mosca-das-frutas invasora3,4, a carga econômica e ambiental dessas invasões ainda é alta, e a possibilidade de estabelecimento está sempre presente; um exemplo catastrófico recente é a infecção por Bactrocera dorsalis no continente africano5.

Durante os programas emergenciais de moscas-das-frutas, um esforço concentrado é feito para detectar e controlar as populações reprodutoras das espécies invasoras. Por exemplo, o estado da Flórida responde às incursões tefritídeos aplicando drenos de solo (sob a gotejamento de plantas hospedeiras frutíferas) e removendo frutos hospedeiros em um raio de 200 m ao redor de locais onde fêmeas e/ou larvas acasaladas são encontradas6. Essas ações e táticas servem para matar larvas e pupas no solo e remover quaisquer ovos e larvas de frutos dentro da área. Em alguns programas de erradicação, uma quantidade significativa de frutos hospedeiros é removida. Em 2015, mais de 100.000 kg de frutos foram destruídos durante o programa de erradicação do B. dorsalis na Flórida6. As perdas econômicas para os produtores e indústrias associadas somente na área de quarentena foram estimadas em mais de US$ 10,7 milhões7.

Para encontrar larvas de tefritídeos nas áreas de quarentena, uma pequena equipe de entomologistas coleta frutos hospedeiros em um raio de 200 m ao redor de uma área de detecção de moscas fêmeas e corta e inspeciona visualmente cada fruto em busca de larvas6. Com recursos humanos limitados e centenas de possíveis anfitriões, a tarefa torna-se difícil, particularmente nas áreas onde a diversidade de plantas em áreas de produção comercial e pátios residenciais é alta. Além disso, as larvas podem ser perdidas ao cortar frutos hospedeiros. Em um estudo que avaliou o corte de frutos nos portos de entrada, o corte de frutos não foi tão eficaz na detecção de A. suspensa quando comparado à retenção dos frutos infestados por várias semanas e à contagem de larvas e pupas encontradas no substrato de pupação8.

Existem alternativas ao corte dos frutos para a detecção de uma infestação 9,10,11,12,13. Por exemplo, uma flutuação de açúcar mascavo e um método de água quente são procedimentos aceitos usados para detectar moscas da cereja ocidental em cerejas colhidas 9,10. O método do açúcar mascavo envolve a colocação dos frutos triturados em solução de água com açúcar e a coleta de larvas que flutuam até o topo. O método de flutuação do açúcar mascavo foi desenvolvido especificamente para atender às regras regulatórias para cerejas exportadas, que exigem que os packing houses monitorem a presença de pragas de moscas-das-frutas em quarentena. Há também um programa de certificação de mirtilo aprovado nos EUA e Canadá que inclui flutuação de água de açúcar mascavo, flutuação de água salgada ou fervura para apoiar o fitossaneamento14. Ao testar a precisão da flutuação de açúcar e água quente, os pesquisadores usaram o método de peneiramento para determinar quantas larvas são perdidas 9,10,11,12,13. Um estudo mostrou que misturar mirtilos triturados em uma solução salina e filtrar a solução através de um filtro de café reutilizável foi quatro vezes melhor na detecção de larvas de Drosophila suzukii do que inspecionar visualmente a superfície de soluções de sal e açúcar14. Além disso, cromatografia gasosa foi utilizada para a detecção de larvas de A. suspensa em citros15. Essas abordagens não foram testadas quanto à aplicabilidade em levantamentos de campo.

Nosso objetivo foi desenvolver e testar um método para encontrar larvas de tefritídeos no campo usando peneiramento e flutuação de água com açúcar. Este método permite a detecção mais eficiente de moscas-das-frutas imaturas do que o método tradicional de corte de frutos, apoiando o controle oportuno das populações de reprodutores durante programas de erradicação de moscas-das-frutas.

Protocol

1. Seleção de Frutas Determinar quais frutos estão disponíveis na área a ser pesquisada. Selecione o fruto hospedeiro com base na lista de hospedeiros conhecidos para a espécie de tefritídeo alvo. Escolha frutas maduras e de polpa macia, como manga, mamão e goiaba. Frutos de polpa madura ou dura, como amêndoas tropicais, devem ser inspecionados com um método diferente, como o corte de frutas. Selecione frutos caídos, supermaduros ou maduros em árvores que tenham sinais de danos, cicatrizes de oviposição e pontos moles. Processar aproximadamente 2 L de frutos de uma só vez (por exemplo, 5 goiabas ou 5 mangas de tamanho médio constituem amostras adequadas para este método). O número de frutos que podem ser processados de uma só vez depende do tamanho dos frutos (Figura 1A). 2. Mushing Corte a fruta em pedaços grandes e coloque-a em um saco zip lock de 4 L (Figura 1B). Adicione água ao saco até que a água cubra a fruta picada em 25-50 mm (Figura 1C). Esprema a fruta suavemente com a mão até que toda a polpa tenha se deslocado da casca e tenha uma consistência lisa (ou seja, sem grandes pedaços) (Figura 1D). 3. Peneiramento para coleta de ínstar tardio Empilhe as peneiras. Use peneiras grandes (457 mm de diâmetro) para processar grandes quantidades de frutas (~ 5 frutas de uma só vez) e peneiras menores (305 mm de diâmetro) para frutas individuais ou amostras menores (< 5 frutas). Empilhe a peneira com uma peneira de malha grande (nº 8; 2,36 mm) sobre uma peneira de malha pequena (nº 20; 0,85 mm). Para a detecção dos primeiros ínstares, colocar uma terceira peneira (nº 45; 0,35 mm) no fundo da pilha (Figura 1E). Despeje a polpa na peneira superior (Figura 1F). Lave bem a polpa através da pilha de peneiras usando água de uma torneira, mangueira ou garrafa até que a polpa fina tenha passado pelas peneiras (Figura 1G). Examinar visualmente as peneiras superiores em busca de larvas de ínstar tardio que possam ter sido retidas com a casca ou qualquer pedaço grande de fruto (Figura 1H). Inspecione cuidadosamente a segunda peneira em busca de larvas de ínstar tardio. Com grandes quantidades de polpa fina, pode ser necessário enxágue adicional. Recolher as larvas das peneiras com pinças larvais e colocá-las em frascos com EtOH 70%. 4. Flutuação de açúcar para coleta antecipada de ínstar Pré-misturar a solução de açúcar dissolvendo 453 g (1 caixa) de açúcar mascavo escuro em 2 L de água da torneira, o que resulta numa leitura Brix de 19°10. Lave a polpa das peneiras de malha mais fina (por exemplo, nº 20 e nº 45) até a borda da peneira com água da torneira e, em seguida, mova o material para um dishpan plástico (11 L). Adicione a solução de açúcar mascavo até cobrir a polpa em 25-50 mm e adicione 2 gotas de antiespumante. Deixe a polpa descansar na solução de açúcar mascavo por cerca de 5 min. Coletar larvas que flutuam até a superfície da solução com pinças de larva em frascos com EtOH 70%. 5. Curadoria larval Rotule um frasco com o local de coleta, data, tipo de fruta e coletor para posterior exame e identificação.

Representative Results

Extração precoce e tardia de Anastrepha suspensa de frutos coletados em campoNeste experimento, comparamos os métodos de corte dos frutos e de cogumelo, peneiramento e flutuação (MSF) em relação à proporção de larvas detectadas e ao tempo médio necessário para detectá-las. Goiaba, altamente infestadas por larvas de Anastrepha suspensa, foram coletadas de uma planta localizada na Universidade da Flórida, Instituto de Ciências Alimentares e Agrárias, Centro de Pesquisa e Educação Tropical, Homestead, FL. Os frutos foram aleatoriamente separados em grupos de 5 e distribuídos em 1 de 2 métodos de extração larval: 1) corte manual ou 2) método MSF. O tempo para coletar todas as larvas visíveis a olho nu usando cada método de extração foi registrado. O método de corte manual seguiu o método atualmente utilizado em um programa de erradicação. Cada uma das 5 operárias (n=5) recebeu 5 frutos para pesquisar todos os estágios das larvas, cortando os frutos em pedaços menores e inspecionando visualmente a polpa. Para determinar se as larvas foram perdidas na inspeção visual, os pedaços de frutas cortados manualmente foram inspecionados novamente usando um microscópio dissecante (10x). Para o método MSF, 5 frutos foram cortados em pedaços grandes (50-80 cm), colocados em sacos zip lock e espremidos suavemente à mão até que toda a polpa fosse desalojada da casca e a polpa tivesse uma consistência lisa (ou seja, sem pedaços grandes). O fruto coado foi coado através de uma série de peneiras grandes (45,7 cm) de latão. A maior malha (nº 8) foi empilhada no topo, seguida por uma peneira nº 20 e uma peneira nº 45. A equipe designada para este tratamento lavou a polpa através da malha usando água de uma mangueira conectada a uma torneira da pia. As larvas de ínstar tardio eram aparentes nas peneiras. Os ínstares menores foram misturados com polpa, tornando-os difíceis de ver e remover. Para tanto, a mistura polpa/larva das peneiras foi colocada em baldes com 1 L de solução de água mascava. As larvas flutuaram imediatamente para a superfície. A solução foi agitada suavemente e, após 5 min, as larvas foram retiradas dos baldes e contadas. O tempo para o processamento do fruto foi uma combinação de cogumelo, peneiramento e remoção das larvas da solução de água com açúcar. Os dados referentes ao número de larvas encontradas pelos métodos de corte manual ou peneiramento e flutuação foram analisados pelo teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis (p = 0,05)16. O método MSF produziu maior número de larvas (Figura 2A) e mais larvas por minuto (Figura 2B) do que o corte manual. Embora a detecção dos diferentes ínstares não tenha sido quantificada neste estudo, observamos que todos os ínstares (primeiro, segundo e terceiro) foram encontrados por meio de peneiras, enquanto que apenas os ínstares posteriores (segundo e terceiro) foram vistos com o corte manual. Quando as amostras previamente cortadas e inspecionadas visualmente foram novamente inspecionadas com um microscópio dissecante, 40% das larvas de ínstar tardio que infestavam os frutos foram perdidas. No entanto, os ínstares anteriores foram encontrados principalmente com a nova inspeção. Este experimento mostrou que o uso do método MSF é mais eficaz e eficiente para encontrar larvas em frutos altamente infestados. No entanto, frutos infestados com menor número de larvas são mais prováveis encontrados em um programa de erradicação, onde as espécies invasoras seriam muito raras. Portanto, realizamos um estudo de laboratório no qual o fruto hospedeiro estava infestado com um número conhecido e baixo de larvas. Infestação manual de manga e mamão para simular baixa infestação por Bactrocera dorsalisEste experimento comparou os métodos de corte dos frutos e MSF com relação à proporção de larvas detectadas e o tempo necessário para detectá-las quando a infestação era relativamente baixa. A infestação manual foi utilizada como ferramenta experimental para avaliar a eficácia de cada método, uma vez que o número de larvas presentes era conhecido com certeza. Uma broca da cortiça (1,0 cm de diâmetro) foi usada para fazer 5 furos em frutos individuais de manga e mamão que estavam livres de larvas de moscas-das-frutas. Uma única larva tardia de segundo a início do terceiro ínstar de B. dorsalis foi colocada em cada um dos 5 orifícios de um subconjunto do fruto. Os orifícios foram tampados com a peça furada do fruto e os demais frutos foram tampados sem inserir larva para simular visualmente a infestação manual. Os frutos foram mantidos a 27 °C por 48 h para permitir o desenvolvimento larval. O experimento foi conduzido no laboratório ARS em Hilo, Ilha Havaí (n = 5 trabalhadores) e no laboratório APHIS-PPQ na Ilha Oahu, Havaí (n = 4 trabalhadores). Para o corte dos frutos, cada operária recebeu 5 mangas (1 infestada com 1 larva e 4 não infestadas) e 4 mamões (um infestado e 3 não infestado). Um trabalhador cortava cada fruto individualmente em pedaços cada vez menores e inspecionava continuamente a polpa em busca de moscas-das-frutas imaturas. As buscas foram interrompidas quando a polpa foi minuciosamente inspecionada. O número total de larvas encontradas e o tempo despendido por cada trabalhador para processar todos os frutos por corte foram registrados (Figura 3) e (Figura 4). Cada trabalhador recebeu outro conjunto semelhante de frutos (5 mangas e 4 mamões) para cozimento ou peneiramento (sem corte de frutos envolvido), com 2 pedaços infestados conforme descrito anteriormente. A polpa foi vertida na peneira superior e lavada através da pilha de peneiras com água de uma torneira e larvas removidas, conforme descrito no protocolo. O experimento foi conduzido duas vezes, com flutuação de açúcar e sem flutuação de açúcar, para determinar se a remoção da etapa de flutuação aumentaria a velocidade do processo sem perder a sensibilidade (ou seja, todas ou a maioria das larvas foram encontradas) (Figura 3). O número de larvas encontradas e o tempo gasto por cada trabalhador para processar os frutos pelo método de estaquia, MSF ou MS foram registrados. Tanto para mangas quanto para mamão, o método MSF completo (flutuação incluída) resultou em maior número de detecções larvais e foi mais rápido do que o corte dos frutos (Tabela 1). Os trabalhadores que utilizaram o método tradicional de corte dos frutos perderam 32% e 35% das larvas colocadas em manga e mamão, respectivamente (Tabela 1). O processamento de frutas a granel pela técnica MSF demandou 30% menos tempo do que o corte de mangas individuais e 35% menos tempo do que o corte de mamões individuais (Figura 3). Foram encontradas mais larvas por minuto pelo método MSF para mamão (Figura 3C) e manga (Figura 3D) quando comparado ao método de corte dos frutos. Todas as larvas encontradas estavam vivas. A identificação morfológica das larvas só é possível para os ínstares tardios. Repetimos o experimento acima, mas omitimos o procedimento de flutuação para determinar se a recuperação de larvas permaneceu alta e a velocidade de processamento dos frutos aumentou. O método MS (com flutuação omitida) resultou em mais detecções larvais para mamão (Figura 4A) e manga (Figura 4B) em comparação com corte e inspeção visual. Além disso, a técnica foi mais rápida do que o corte e inspeção visual do mamão (Figura 4C) e da manga (Figura 4D). A remoção da etapa de flutuação do método MSF reduziu o tempo de localização de larvas de ínstar tardio em 90% para o mamão e em 48% para as mangas (Tabela 2). A porcentagem de larvas encontrada foi alta para ambos os métodos e foi consistentemente maior para MS (flutuação omitida). Para o mamoeiro, 80% e 85% das larvas foram recuperadas pelos métodos MSF e MS, respectivamente (Tabela 1 e Tabela 2). Para a manga, 88% e 95% foram recuperados pelos métodos MSF e MS, respectivamente (Tabela 1 e Tabela 2). Comparação de campo dos métodos de corte de frutas e MSFO objetivo deste experimento foi comparar os métodos de corte e MSF em condições de campo, mimetizando um programa emergencial de moscas-das-frutas. O processamento dos frutos foi realizado sem a conveniência e infraestrutura do laboratório para testar a prontidão de campo dos dois métodos de extração de larvas. O trabalho foi conduzido em um pomar de goiaba localizado na Unidade de Pesquisa de Germoplasma de Recursos Genéticos de Plantas Tropicais e Pesquisa de Doenças do USDA-ARS, perto de Hilo. Um total de 40 goiabas com sinais de infestação foi coletado e dividido em 2 grupos. Um total de 20 goiabas foi submetido à inspeção de corte/visual seguida de MSF (flutuação incluída), o que permitiu avaliar a sensibilidade do método de corte em comparação com o método MSF. A dissecação prosseguiu conforme descrito acima. Quando detectadas, as larvas foram removidas e contadas. Quatro trabalhadores dissecaram 5 goiabas cada, e o tempo necessário para o corte e inspeção foi registrado para cada trabalhador. O MSF pós-corte foi conduzido como acima, exceto que uma terceira peneira de malha menor (nº 40, 0,420 mm) foi usada, além das peneiras nº 8 e nº 20 para coletar larvas menores. O segundo conjunto de 20 goiabas foi colocado em 2 sacos zip lock (10 frutos por saco) e submetido apenas ao MSF (i.e., sem corte), o que permitiu uma comparação do tempo necessário para o corte dos frutos versus MSF. Como acima, três peneiras foram utilizadas neste procedimento. O número de larvas encontradas e o tempo total para o processamento dos frutos (cogumelo e retenção do fruto por 5 min no saco/peneiramento/flutuação em solução de açúcar) foram registrados. Conforme encontrado em laboratório, o corte dos frutos subestimou a infestação dos frutos e foi altamente variável, detectando 25%-83% menos larvas do que as que poderiam ser recuperadas pelos métodos de MSF (Tabela 3). Além disso, na amostra com baixo número de larvas, MSF recuperou 500% mais larvas, proporcionando maior sensibilidade ao ensaio e maior chance de identificar o organismo infestante. As frutas foram processadas muito mais rapidamente usando o método MSF em comparação com o corte; O corte e a inspeção de 5 frutas exigiram aproximadamente a mesma quantidade de tempo que o processamento de 10 frutas via MSF. Figura 1: Etapas do protocolo de extração das larvas de moscas-das-frutas. (A) Processar aproximadamente 2 L em volume de frutos de uma só vez (por exemplo, 5 goiabas ou 5 mangas médias constituem amostras adequadas para este método). (B) Corte a fruta em pedaços grandes e coloque-a em um saco de armazenamento zip lock de 4 L. (C) Adicione água ao saco até que a água cubra a fruta picada em 25-50 mm. (D) Esprema a fruta suavemente com a mão até que toda a polpa tenha se deslocado da casca e tenha uma consistência lisa (ou seja, sem pedaços grandes). (E) Empilhar a peneira com a peneira de malha grande (nº 8; 2,36 mm) em cima seguida da peneira de malha pequena (nº 20; 0,85 mm). Para os primeiros ínstares, coloque uma terceira peneira (nº 45; 0,35 mm) no fundo da pilha. (F) Despeje a polpa na peneira superior. (G) Lave bem a polpa através da pilha de peneiras usando água de uma torneira, mangueira ou garrafa até que a polpa fina tenha passado pela primeira peneira. (H) Examine visualmente as peneiras superiores em busca de larvas de ínstar tardio que possam ter sido retidas com a casca ou quaisquer pedaços grandes de fruta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Extração precoce e tardia de Anastrepha suspensa dos frutos coletados no campo. O número médio (± erro padrão da média [EP]) de larvas de Anastrepha suspensa de cinco goiabas coletadas por corte e inspeção visual (corte: 70,4 ± 11,9) ou lavagem da polpa através de uma série de três peneiras seguidas de imersão da polpa em solução de água açucarada (MSF: 175,6 ± 21,91) (A). O número médio de larvas (±SE) coletadas por minuto de 5 goiabas processadas por estaca (1,21 ± 0,16) e por MSF (3,71 ± 0,50) (B). Cada método foi replicado 5 vezes, e asteriscos acima das barras indicam diferenças significativas para o número de larvas (χ 2 = 6,81, p < 0,01) e o tempo de processamento (χ2 = 6,80, p < 0,01 ) com base no teste de Kruskal-Wallis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Validação do método de cogumelo-peneiramento-flutuação utilizando infestação manual de manga e mamão para simular baixa infestação por Bactrocera dorsalis. O número médio de larvas de Bactrocera dorsalis (±SE) encontradas no mamão (corte: 3,25 ± 0,51, MSF: 4,0 ± 0,4) (A) e manga (corte: 3,4 ± 0,51, MSF: 4,4 ± 0,4) (B) frutos e o número médio de larvas (±SE) coletadas por minuto de mamão (corte: 0,21 ± 0,1, MSF: 0,4 ± 0,15) (C) e manga (corte: 0,14 ± 0,01, MSF: 0,21 ± 0,03) (D). Frutos processados pelos métodos de estaca ou MSF (flutuação incluída, n = 5) foram infestados manualmente com larvas de 5 terceiros estádios. Asteriscos acima das barras indicam diferenças significativas para o número de larvas encontradas no mamão (χ 2 = 5,39, p = 0,02) e manga (χ2 = 3,94, p = 0,05) quando comparado ao corte dos frutos baseado no teste de Kruskal-Wallis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Validação do método de peneiramento (remoção de flutuação) utilizando infestação manual de manga e mamão para simular baixa infestação por Bactrocera dorsalis. O número médio de larvas (±SE) encontradas no mamão (corte: 1,25 ± 0,48, MS: 4,25 ± 0,48) (A) e manga (corte: 2,5 ± 0,5, MS: 4,75 ± 0,25) (B) frutos e o número médio de larvas coletadas por minuto (±SE) em mamão (corte: 0,15 ± 0,05, MS: 0,76 ± 0,15) (C) e manga (corte: 0,16 ± 0,04, MS: 0,44 ± 0,04) (D). Os frutos foram infestados manualmente com larvas de Bactrocera dorsalis de 5 terceiros ínstares e processados por corte e inspeção visual (corte) ou cogumelos em saco e lavados em peneiras (apenas cogumelo e peneiramento, sem flutuação, n = 4). Asteriscos acima das barras indicam diferenças significativas para o número de larvas encontradas no mamão (χ 2 = 5,46, p = 0,02) e manga (χ 2 = 5,25, p = 0,02) e o tempo para o processamento do mamão (χ 2 = 5,39, p = 0,02) e manga (χ 2 = 5,39, p = 0,02) em comparação com o corte dos frutos, com base nos testes de Kruskal-Wallis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Fruta # Frutas processadas #Larvae adicionado Método de processamento #Larvae encontrados Tempo de processamento (min)* % de recuperação Manga 25 25 Corte 17 158 68% Manga 25 25 MSF 22 113 88% Mamão 16 20 Corte 13 62 65% Mamão 16 20 MSF 16 40 80% *Tempo total somado acima de 5 trabalhadores. Tabela 1: Número de larvas recuperadas e tempo de processamento dos frutos pelo método de corte e inspeção visual (corte) ou cogumelo, peneiramento e flutuação (MSF). O fruto-teste foi infestado manualmente com larvas de 5 terceiros ínstares misturadas com frutos furados e tampados apenas (1 das 5 mangas, 1 dos 4 mamões). Fruta # Frutas processadas #Larvae adicionado Método de processamento #Larvae encontrados Tempo de processamento (min)* % de recuperação Manga 20 20 Corte 10 66 50% Manga 20 20 MS 19 44 95% Mamão 16 20 Corte 5 38 25% Mamão 16 20 MS 17 25 85% *Tempo total somado em 4 trabalhadores. Tabela 2: Número de larvas recuperadas e tempo para processamento dos frutos somente por corte ou cogumelo e peneiramento, flutuação omitida (MS). Os frutos teste foram infestados manualmente com cinco larvas de terceiro ínstar misturadas com frutos furados e tampados apenas (1 em 5 mangas, 1 em 4 mamões). Trabalhador/método #Fruit processado Tempo de processamento (min) #Larvae encontrado corte #Larvae encontrou MSF* % da contagem total de larvas encontradas por estaca Trabalhador 1: corte 5 18 33 14 70% Trabalhador 2: corte 5 18 1 5 17% Trabalhador 3: corte 5 26 9 11** 75% Trabalhador 4: corte 5 20 24 Trabalhador 5: MSF 10 22 NA 22 NA Trabalhador 6: MSF 10 18 NA 37 NA * Polpa do corte e inspeção visual processada novamente usando o método MSF para determinar o número de larvas de 2ºa 3º ínstar perdidas ** Polpa de 2 e 3 frutas dos trabalhadores agrupadas antes do processamento usando o método MSF Tabela 3: Número de larvas encontradas na goiaba coletada em campo por meio do corte e inspeção visual do fruto (corte) ou por cogumelo, peneiramento e flutuação (MSF) do fruto.

Discussion

Nosso objetivo foi desenvolver uma maneira eficiente e eficaz de encontrar larvas de tefritídeos no campo. A motivação para iniciar um programa de erradicação ou estabelecer uma área de quarentena é a detecção de fêmea(s) ou larva acasalada(s)6, o que indica uma população reprodutora. O método atual de corte e busca visual de frutos é ineficiente na localização de larvas, pois geralmente há muito mais frutos hospedeiros presentes do que podem ser inspecionados individualmente. Além disso, as populações dos tefritídeos são provavelmente baixas em uma área de nova invasão, tornando as chances de encontrar larvas em uma grande quantidade de frutos incrivelmente difíceis. Por exemplo, no programa de erradicação da Bactrocera dorsalis de 2015 na Flórida, 54 espécies diferentes de hospedeiros foram identificadas e mais de 4.000 frutos foram cortados. Neste programa de erradicação, apenas algumas larvas foram encontradas na manga, e nenhum outro hospedeiro foi encontrado infestado6. Verificou-se que o método MSF/MS foi mais sensível e mais rápido na detecção de larvas de A. suspensa e B. dorsalis ao processar frutos que apresentaram grande quantidade de polpa (manga, goiaba e mamão) a granel em comparação com o corte dos frutos. A maior quantidade de frutos hospedeiros que é possível inspecionar usando o método de cogumelo e peneiramento, combinada com o aumento da detecção de uma larva rara, poderia aumentar a probabilidade de que uma infestação fosse encontrada precocemente. A detecção precoce de uma população reprodutora poderia aumentar a probabilidade de erradicação e reduzir os custos do programa.

Nossos experimentos mostraram que o número de larvas detectado pelos trabalhadores que cortam e inspecionam visualmente os frutos variou consideravelmente. As operárias que cortavam os frutos perderam 50% e 75% das larvas de B. dorsalis colocadas em mangas e mamão, respectivamente. Em contraste, apenas 5% e 15% das larvas foram perdidas usando o método MS para processar manga e frutos de mamão, respectivamente. Da mesma forma, um estudo que avaliou o corte de frutos nos portos de entrada mostrou que houve uma variação considerável no número de frutos infestados e larvas encontradas pelos inspetores8. O estudo mostrou que inspetores portuários experientes perderam 64%-99% das larvas de A. suspensa e 16%-82% dos frutos infestados quando os frutos foram cortados e inspecionados visualmente8. Nossos resultados sugerem que o método de cogumelo e peneiramento pode diminuir a probabilidade de um trabalhador deixar de detectar um fruto infestado.

A flutuação de açúcar e água quente são protocolos aceitos em um método de abordagem sistêmica para garantir que cerejas e mirtilos estejam livres de moscas-das-frutas14. Um subconjunto de uma remessa é esmagado na solução, após o que um inspetor filtra visualmente a superfície da solução de açúcar para a presença de ovos e larvas. Embora um maior número de frutos possa ser processado em comparação com o corte de frutos individuais, a probabilidade de encontrar larvas usando essas técnicas ainda é afetada pela habilidade do inspetor, o estágio e o número de larvas presentes e o tipo de fruto8. Verificamos que, como outros tefritídeos, B. dorsalis e A. suspensa se deslocam da polpa do fruto e flutuam para a superfície. Curiosamente, descobrimos que com larvas de ínstar tardio maiores, que são o alvo em programas de emergência e erradicação, pois podem ser identificadas morfologicamente, incluindo a flutuação de açúcar, não aumentou a precisão do método. De fato, a adição do método de flutuação aumentou o tempo de processamento em 90% para o mamão e em 48% para a manga. O aumento do tempo de processamento mais os materiais adicionais (por exemplo, água, lixeiras, açúcar, etc.) não suportam operacionalmente a adição desta etapa ao procurar grandes ínstares no campo. O método de flutuação do açúcar pode ser apropriado quando o objetivo é detectar todos os estágios, incluindo os primeiros ínstares, como nos portos de entrada e nos packing houses. A filtragem da solução de açúcar com uma peneira de malha fina provavelmente proporcionaria a detecção mais precisa de ovos e estádios larvaisprecoces 11,12.

As técnicas de MS e MSF funcionam bem com frutas que podem ser facilmente cozidas e têm um grande volume de polpa. Larvas de tefritídeos tendem a se enterrar na polpa do fruto, o que dificulta a detecção visual. Um aspecto crítico dos métodos MS e MSF é separar as larvas da polpa. O processo de peneiramento remove a polpa, expondo as larvas em peneiras. Da mesma forma, o método da água com açúcar separa as larvas da polpa, fazendo com que as larvas flutuem, enquanto a polpa afunda para o fundo da panela. Larvas separadas da polpa pelos métodos MS ou MSF são prontamente observadas movendo-se na peneira ou na superfície da água. Embora o método de cogumelo, peneiramento e, opcionalmente, flutuação tenha melhorado muito a velocidade e a precisão da detecção de larvas de tefritídeos em importantes frutos hospedeiros, o processo pode não ser apropriado para todos os frutos. Por exemplo, frutas hospedeiras com polpa dura, como abacates verdes ou frutas com uma grande semente/caroço e quantidade relativamente pequena de polpa, como amêndoas tropicais, podem ser mais fáceis de processar por corte manual e inspeção visual.

Descobrimos que os métodos MS e MSF foram mais rápidos quando um número relativamente pequeno de frutas (5-10) foi processado. A diferença provavelmente seria maior se maiores quantidades de frutos fossem processadas, o que pode ser necessário e típico de programas emergenciais de moscas-das-frutas. A remoção da etapa de flutuação aumentou ainda mais a velocidade de detecção sem comprometer a precisão de encontrar larvas grandes de tefritídeos (>3 mm). Mostramos que essas técnicas poderiam ser levadas a campo, simulando as condições vivenciadas pelos trabalhadores durante um programa emergencial de moscas-das-frutas. Nossos estudos indicam que os métodos de EM podem permitir uma detecção mais oportuna de larvas de ínstar tardio e subsequente erradicação de populações reprodutoras de tefritídeos. MSF poderia ser usado para detectar ovos e ínstares precoces atualmente não visados por programas de erradicação.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a Silvia Durand, Teri Allen, Jose Alegria e Alejandra Canon pela assistência no processamento da goiaba na Universidade da Flórida, a Rick Kurashima, Jean Auth e Bruce Inafuku pela ajuda na avaliação da fruta artificialmente infestada no Havaí, e a Michael Stulberg pelos comentários úteis sobre versões anteriores do manuscrito. Este projeto foi financiado em parte pelo USDA APHIS e University of Florida Cooperative Agreement e apoiado em parte pelo USDA-ARS (projeto 2040-22430-027-00D). Os resultados e conclusões desta publicação preliminar não foram formalmente divulgados pelo USDA e não devem ser interpretados como representando qualquer determinação ou política da agência. A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é exclusivamente com o propósito de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo USDA. O USDA é um provedor e empregador de oportunidades iguais.

Materials

Anti foamer MicroLubrol ML200-50-4 MicroLubrol 2000 Fluid Pure Silicone Oil, https://www.microlubrol.com
Brown Sugar Dominos 1 lb Box  Dark Brown Sugar Crystals, https://www.dominosugar.com/products/dark-brown-sugar
Cutting Boards KitchenAid KE703NOSMGA KitchenAid Classic Nonslip Plastic Cutting Board, 12×18-Inch, https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11×14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&crid=UXMLNC72BL0
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Dish Pans Sterilite 06578012 White 12 qrt Dishpan, https://www.amazon.com/STERILITE-06578012-Sterilite-White-Dishpan/dp/B0039V2G5E/ref=sr_1_1?crid=2SMBMLFJF18U&keywords=
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EthOH Fisher Scientific BP8202500 Ethanol Solution 96%, Molecular Biology Grade, https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500
Glass Vials Fisher Scientific 0333921H Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials With Closures, https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H
Knives Zyliss 31380 5.25" Utility Knife, https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&keywords=
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No. 20 Mesh sieves Hogentogler & Co. Inc. 4221 U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
No. 45 Mesh sieves Hogentogler & Co. Inc. 4226 U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
No. 8 Mesh sieves Hogentogler & Co. Inc. 4215 U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
Soft Forceps DR Instruments DRENTF01 DR Instruments Featherweight Entomology Forceps, https://www.amazon.com/DR-Instruments-DRENTF01-Featherweight-Entomology/dp/B008RBLO8Q
Zipper Lock Storage Bags Ziploc 682254 Ziploc brand 2 gal Clear Freezer Bags, https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&keywords=
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Roda, A. L., Steck, G., Fezza, T., Shelly, T., Duncan, R., Manoukis, N., Carvalho, L., Fox, A., Kendra, P., Carrillo, D. Sieving Fruit Pulp to Detect Immature Tephritid Fruit Flies in the Field. J. Vis. Exp. (197), e65501, doi:10.3791/65501 (2023).
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