JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

ניפוי עיסת פירות לאיתור זבובי פירות טפריטידים לא בשלים בשדה

Published: July 28, 2023
doi:
10.3791/65501
, , , , , , , , ,
1Animal Plant Health Inspection Service (APHIS), Plant Protection and Quarantine (PPQ), Science and Technology (S&T) Miami,United States Department of Agriculture (USDA), 2Division of Plant Industry,Florida Department of Agriculture and Consumer Services, 3APHIS, PPQ, S&T,USDA, 4IFAS, Tropical Research and Education Center,University of Florida, 5Agricultural Research Service (ARS), Pacific Basin Agricultural Research Center,USDA, 6APHIS, PPQ, Field Operations,USDA, 7ARS, Subtropical Horticulture Research Station,USDA

Summary

הגברת האיתור של זבובי פירות טפריטידים לא בוגרים בשטח יכולה לעורר מאמצים בזמן לחסל אוכלוסיות של מזיקים הרסניים אלה. איתור זחלי אינסטאר מאוחרים הוא מהיר ומדויק יותר כאשר מועכים פירות פונדקאי בשקית ומעבירים את הציפה דרך סדרה של מסננות מאשר חיתוך ידני ובדיקה חזותית.

Abstract

זבובי פירות ממשפחת Tephritidae הם בין המזיקים החקלאיים ההרסניים והפולשים ביותר בעולם. מדינות רבות נוקטות בתוכניות מיגור יקרות כדי לחסל אוכלוסיות מתחילות. במהלך תוכניות מיגור, נעשה מאמץ מרוכז לאתר זחלים, שכן זה מצביע מאוד על אוכלוסיית רבייה ומסייע לקבוע את ההיקף המרחבי של ההתפשטות. גילוי שלבי חיים לא בוגרים מעורר פעולות בקרה וויסות נוספות כדי להכיל ולמנוע כל התפשטות נוספת של המזיק. באופן מסורתי, זיהוי הזחלים מתבצע על ידי חיתוך פירות פונדקאים בודדים ובדיקתם באופן חזותי. שיטה זו דורשת עבודה רבה, שכן ניתן לעבד רק מספר מוגבל של פירות, וההסתברות להחמיץ זחל גבוהה. נבדקה טכניקת מיצוי המשלבת i) מחיצת פרי פונדקאי בשקית ניילון, ii) סינון עיסה דרך סדרה של מסננות, iii) הנחת עיסה שמורה בתמיסת מי סוכר חומים, ו-iv) איסוף זחלים הצפים אל פני השטח. השיטה הוערכה בפלורידה עם גויאבה שנאספה בשדה שורצת באופן טבעי על ידי Anastrepha suspensa. כדי לחקות אוכלוסיות נמוכות המייצגות יותר את התוכנית להשמדת זבוב הפירות, המנגו והפפאיה בהוואי שורצים מספר ידוע ונמוך של זחלי Bactrocera dorsalis . ישימות השיטה נבדקה בשטח על גויאבה שורצת באופן טבעי על ידי B. dorsalis כדי להעריך את השיטה בתנאים שחוו העובדים במהלך תוכנית חירום של זבוב הפירות. הן בניסויי שדה והן בניסויי מעבדה, השטיפה והסינון של הציפה היו יעילים יותר (דרשו פחות זמן) ורגישים יותר (נמצאו יותר זחלים) מאשר חיתוך פירות. הצפת הציפה בתמיסת מי סוכר חומים סייעה לזהות זחלי כוכבים מוקדמים יותר. ריסוק וניפוי עיסת פירות של פונדקאים חשובים עשויים להגדיל את ההסתברות לגילוי זחלים במהלך תוכניות חירום.

Introduction

זבובי פירות Tephritid הם בין המזיקים החקלאיים ההרסניים ביותר, כאשר הסוגים Anastrepha, Bactrocera, ו Ceratitis מהווים את הסיכון הגדול ביותר1. אזורים רבים נמצאים בסיכון גבוה להתבססות זבוב פירות אקזוטי, בהתבסס על 1) פלישות היסטוריות ותוכניות תיחום ומיגור נלוות, 2) שיעור ההגעה הגבוה של חומר מארח של זבוב הפירות לנמלי הכניסה, ו -3) תנאי אקלים נוחים להקמת אוכלוסיות רבייה. מדינת קליפורניה חווה פלישות מרובות וגילויים של tephritids מדי שנה2. היו יותר מ -200 פלישות ותוכניות מיגור נגד tephritids ברחבי העולם במהלך המאה האחרונה, וזה הואץ באופן משמעותי בעשורים האחרונים3. אף על פי שרובן המכריע של תוכניות אלה מצליחות למגר את זבוב הפירות הפולש3,4, הנטל הכלכלי והסביבתי של פלישות אלה נותר עדיין גבוה, והאפשרות להתבססות קיימת תמיד; דוגמה קטסטרופלית עדכנית היא זיהום של Bactrocera dorsalis ביבשת אפריקה5.

במהלך תוכניות חירום של זבוב הפירות, נעשה מאמץ מרוכז לאתר ולשלוט באוכלוסיות הרבייה של המינים הפולשים. לדוגמה, מדינת פלורידה מגיבה לפלישות טפריטידיות על ידי מריחת שאריות קרקע (מתחת לטפטוף של צמחים פונדקאים נושאי פרי) וסילוק פירות פונדקאים ברדיוס של 200 מטר סביב אתרים שבהם נמצאות נקבות ו/או זחלים מזווגים6. פעולות וטקטיקות אלה משמשות להרוג זחלים וגלמים באדמה ולהסיר ביצים וזחלים מפירות באזור. בחלק מתוכניות ההשמדה מסולקת כמות משמעותית של פרי פונדקאי. בשנת 2015, מעל 100,000 ק”ג של פירות נהרסו במהלך תוכנית ביעור B. dorsalis בפלורידה6. ההפסדים הכלכליים למגדלים ולתעשיות הקשורות אליהם באזור ההסגר לבדו נאמדו ביותר מ-10.7 מיליון דולר7.

כדי למצוא זחלי טפריטיד באזורי ההסגר, צוות קטן של אנטומולוגים אוסף פירות פונדקאים ברדיוס של 200 מטר סביב אזור גילוי נקבות זבובים, חותך ובודק חזותית כל פרי עבור זחלים6. עם משאבי צוות מוגבלים ומאות מארחים אפשריים, המשימה הופכת לקשה, במיוחד באזורים שבהם מגוון הצמחים הן באזורי הייצור המסחריים והן בחצרות המגורים גבוה. בנוסף, הזחלים עלולים לפספס בעת חיתוך פירות המארחים. במחקר שבדק חיתוך פירות בנמלי הכניסה, נמצא כי חיתוך פירות אינו יעיל באותה מידה באיתור A. suspensa בהשוואה להחזקת הפירות השורצים במשך מספר שבועות וספירת הזחלים והגלמים שנמצאו במצע הגור8.

ישנן חלופות לחיתוך פירות לאיתור נגע 9,10,11,12,13. לדוגמה, ציפה של סוכר חום ושיטת מים חמים הן שתי שיטות מקובלות המשמשות לאיתור זבובי פירות דובדבן מערביים בדובדבנים שנקטפו 9,10. שיטת הסוכר החום כוללת הנחת פירות כתושים בתמיסת מי סוכר ואיסוף זחלים הצפים למעלה. שיטת הציפה של סוכר חום פותחה במיוחד כדי לעמוד בכללים הרגולטוריים לדובדבנים מיוצאים, המחייבים את בתי האריזה לפקח על מזיקים של זבוב הפירות. קיימת גם תוכנית מאושרת להסמכת אוכמניות בארה”ב-קנדה הכוללת ציפה של מי סוכר חום, ציפה של מי מלח או הרתחה לתמיכה בפיטוסניטציה14. כאשר בדקו את הדיוק של ציפה של סוכר ומים חמים, החוקרים השתמשו בשיטת הניפוי כדי לקבוע כמה זחלים חסרים 9,10,11,12,13. מחקר הראה כי ערבוב אוכמניות כתושות בתמיסת מלח וסינון התמיסה דרך פילטר קפה רב פעמי היה טוב פי ארבעה בזיהוי זחלי סוזוקי דרוזופילה מאשר בדיקה חזותית של פני השטח של תמיסות מלח וסוכר14. בנוסף, כרומטוגרפיית גז שימשה לאיתור זחלי A. suspensa בהדר15. גישות אלה לא נבדקו לתחולה בסקרי שטח.

מטרתנו הייתה לפתח ולבדוק שיטה למציאת זחלי טפריטיד בשטח באמצעות מסננת וציפה של מי סוכר. שיטה זו מאפשרת איתור יעיל יותר של זבובי פירות לא בוגרים מאשר שיטת חיתוך הפירות המסורתית, ותומכת בשליטה בזמן על אוכלוסיות הרבייה במהלך תוכניות להשמדת זבוב הפירות.

Protocol

1. בחירת פירות קבע איזה פרי זמין באזור להיסקר. בחר פרי מארח בהתבסס על רשימת המארחים הידועים עבור מיני הטפריטיד היעד. בחרו פירות רכים ובשלים, כמו מנגו, פפאיה וגויאבה. פירות בוסר או בשר קשה, כגון שקדים טרופיים, יש לבדוק בשיטה אחרת, כגון חיתוך פירות. בחרו פירות שנפלו, פרי בשל מדי או פרי בשל על עצים עם סימני נזק, צלקות אוביפוזיציה וכתמים רכים. מעבדים כ-2 ליטר פירות בבת אחת (למשל, 5 גויאבות או 5 מנגו בינוני מהווים דגימות מתאימות לשיטה זו). מספר הפירות שניתן לעבד בבת אחת תלוי בגודל הפירות (איור 1A). 2. מושינג חתכו את הפרי לחתיכות גדולות והכניסו אותו לשקית אחסון עם נעילת רוכסן בנפח 4 ליטר (איור 1B). הוסיפו מים לשקית עד שהמים יכסו את הפרי הקצוץ ב-25-50 מ”מ (איור 1C). סחטו את הפרי ביד בעדינות עד שכל העיסה התנתקה מהקליפה וקיבלה מרקם חלק (כלומר, ללא גושים גדולים) (איור 1D). 3. מסננת לקולקציית כוכבים מאוחרת עורמים את המסננות. השתמש במסננות גדולות (בקוטר 457 מ”מ) לעיבוד כמויות גדולות של פירות (~ 5 פירות בבת אחת) ובמסננות קטנות יותר (קוטר 305 מ”מ) עבור פירות בודדים או דגימות קטנות יותר (< 5 פירות). ערמו את המסננת ברשת גדולה (מס’ 8; 2.36 מ”מ) על גבי מסננת רשת קטנה (מס’ 20; 0.85 מ”מ). לגילוי כוכבים מוקדמים, הניחו מסננת שלישית (מס’ 45; 0.35 מ”מ) בתחתית הערימה (איור 1E). שפכו את העיסה לתוך המסננת העליונה (איור 1F). שטפו ביסודיות את העיסה דרך ערימת המסננות באמצעות מים מברז, צינור או בקבוק עד שהעיסה העדינה עברה דרך המסננות (איור 1G). סרקו ויזואלית את המסננות העליונות בחיפוש אחר זחלי אינסטאר מאוחרים שאולי נשמרו עם הקליפה או עם חתיכות פרי גדולות (איור 1H). בדוק היטב את המסננת השנייה עבור זחלי instar מאוחר. עם כמויות גדולות של עיסה עדינה, שטיפה נוספת עשויה להיות נחוצה. אספו זחלים מהמסננות בעזרת מלקחיים והכניסו אותם לבקבוקונים עם 70% EtOH. 4. ציפה בסוכר לקולקציית כוכבים מוקדמת ערבבו מראש את תמיסת הסוכר על ידי המסת 453 גרם (קופסה אחת) של סוכר חום כהה ב-2 ליטר מי ברז, מה שמניב קריאת בריקס של 19°10. שטפו את העיסה ממסננות הרשת העדינות יותר (למשל, מס’ 20 ומס’ 45) לקצה המסננת במי ברז, ולאחר מכן העבירו את החומר לצלחת פלסטיק (11 ליטר). מוסיפים את תמיסת הסוכר החום עד שהיא מכסה את העיסה ב 25-50 מ”מ ומוסיפים 2 טיפות אנטי קצף. תן את העיסה לשבת בתמיסת סוכר חום במשך כ 5 דקות. אספו זחלים שצפים על פני השטח של התמיסה עם מלקחיים לזחלים לתוך בקבוקונים עם 70% EtOH. 5. אוצרות הזחלים תייגו בקבוקון עם מיקום האיסוף, התאריך, סוג הפרי והאספן לצורך בדיקה וזיהוי מאוחרים יותר.

Representative Results

מיצוי מוקדם ומאוחר של Anastrepha suspensa מפירות שנאספו בשדהבניסוי זה השווינו את חיתוך הפירות ואת שיטות השאיכה, הניפוי והציפה (MSF) ביחס לשיעור הזחלים שזוהו ולזמן הממוצע הדרוש לגילוים. גויאבה, שורצת מאוד בזחלים של Anastrepha suspensa, נאספו מצמח הממוקם באוניברסיטת פלורידה, המכון למדעי המזון והחקלאות, מרכז המחקר והחינוך הטרופי, הומסטד, פלורידה. הפרי מוין באופן אקראי לקבוצות של 5 וחולק ל-1 מתוך 2 שיטות מיצוי זחלים: 1) חיתוך ידני או 2) שיטת MSF. הזמן לאסוף את כל הזחלים הנראים לעין בלתי באמצעות כל שיטת מיצוי נרשם. שיטת חיתוך היד פעלה על פי השיטה המשמשת כיום בתוכנית מיגור. לכל אחד מחמשת העובדים (n=5) הוקצו 5 פירות כדי לחפש את כל שלבי הזחלים על ידי חיתוך הפירות לחתיכות קטנות יותר ובדיקה חזותית של העיסה. כדי לקבוע אם הזחלים הוחמצו בבדיקה החזותית, חתיכות הפרי החתוכות ביד נבדקו מחדש באמצעות מיקרוסקופ מנתח (פי 10). בשיטת MSF, 5 פירות נחתכו לחתיכות גדולות (50-80 ס”מ), הוכנסו לשקיות נעילת רוכסן, ונסחטו בעדינות ביד עד שכל העיסה נעקרה מהקליפה והציפה קיבלה מרקם חלק (כלומר, ללא גושים גדולים). הפרי המעוך עבר סינון דרך סדרה של מסננות פליז גדולות (45.7 ס”מ). הרשת הגדולה ביותר (מס’ 8) נערמה בחלקה העליון, ואחריה מסננת רשת מס’ 20 ומסננת רשת מס’ 45. הצוות שהוקצה לטיפול זה שטף את העיסה דרך הרשת באמצעות מים מצינור המחובר לברז כיור. זחלי הכוכב המאוחרים ניכרו במסננות. הכוכבים הקטנים יותר עורבבו עם עיסה, מה שהקשה על ראייתם והסרתם. לכן, תערובת העיסת / הזחלים מהמסננות הוכנסה לדליים עם 1 ליטר של תמיסת מי סוכר חומים. הזחלים צפו מיד אל פני השטח. התמיסה עורבבה בעדינות, ולאחר 5 דקות הוצאו הזחלים מהדליים ונספרו. הזמן לעיבוד הפרי היה שילוב של משיכה, ניפוי והוצאת הזחלים מתמיסת מי הסוכר. נתונים על מספר הזחלים שנמצאו באמצעות חיתוך ידני או שיטות מסננת וציפה נותחו באמצעות הבדיקה הלא פרמטרית Kruskal-Wallis (p = 0.05)16. שיטת MSF הניבה מספר גדול יותר של זחלים (איור 2A) ויותר זחלים לדקה (איור 2B) מאשר חיתוך ידני. למרות שזיהוי הכוכבים השונים לא כומת במחקר זה, ראינו שכל הכוכבים (הראשון, השני והשלישי) נמצאו באמצעות מסננות, בעוד שרק כוכבים מאוחרים יותר (שני ושלישי) נצפו באמצעות חיתוך ידני. כאשר הדגימות שנחתכו ונבדקו ויזואלית נבדקו מחדש במיקרוסקופ מנתח, 40% מזחלי הכוכב המאוחר ששורצים את הפירות הוחמצו. עם זאת, כוכבים מוקדמים יותר נמצאו בעיקר עם הבדיקה מחדש. ניסוי זה הראה כי השימוש בשיטת MSF יעיל ואפקטיבי יותר למציאת זחלים בפירות שורצים מאוד. עם זאת, פירות שורצי מספר נמוך יותר של זחלים נוטים יותר להיתקל בתוכנית מיגור, שבה המינים הפולשים יהיו נדירים מאוד. לכן, ערכנו מחקר מעבדה שבו הפרי הפונדקאי היה שורץ מספר ידוע ונמוך של זחלים. התפשטות ידנית של מנגו ופפאיה כדי לדמות התפשטות נמוכה Bactrocera dorsalisניסוי זה השווה את שיטות חיתוך הפירות ושיטות MSF ביחס לשיעור הזחלים שזוהו והזמן שנדרש לזיהויים כאשר ההתפשטות הייתה נמוכה יחסית. התפשטות ידנית שימשה ככלי ניסיוני להערכת יעילותה של כל שיטה, שכן מספר הזחלים הנוכחים היה ידוע בוודאות. בורר שעם (קוטר 1.0 ס”מ) שימש ליצירת 5 חורים בפירות מנגו ופפאיה בודדים שהיו נקיים מזחלי זבוב הפירות. זחל יחיד בסוף השני עד תחילת השלישי בכוכב B. dorsalis הוכנס לכל אחד מ-5 החורים של תת-קבוצה של הפרי. החורים נסגרו באמצעות החתיכה המשועממת מהפרי והפירות הנותרים כוסו ללא החדרת זחל כדי לדמות ויזואלית התפשטות ידנית. הפירות הוחזקו בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות כדי לאפשר התפתחות זחלים. הניסוי נערך במעבדת ARS בהילו, האי הוואי (n = 5 עובדים) ובמעבדת APHIS-PPQ באי אואהו, הוואי (n = 4 עובדים). לחיתוך פירות, כל עובד קיבל 5 מנגו (1 שורץ 1 זחלים ו -4 לא שורץ) ו -4 פפאיות (אחד שורץ ו -3 לא שורץ). עובד חתך כל פרי בנפרד לחתיכות קטנות יותר ויותר ובדק ללא הרף את הציפה לאיתור זבובי פירות לא בוגרים. החיפוש הופסק כאשר העיסה נבדקה ביסודיות. המספר הכולל של הזחלים שנמצאו והזמן שהשקיע כל עובד כדי לעבד את כל הפירות באמצעות חיתוך תועדו (איור 3) ו-(איור 4). כל עובד קיבל סט פירות דומה נוסף (5 מנגו ו-4 פפאיה) למיסה או ניפוי (ללא חיתוך פירות), כאשר 2 חתיכות שורצות כפי שתואר קודם לכן. העיסה נשפכה לתוך המסננת העליונה ונשטפה דרך ערימת המסננות באמצעות מים מברז וזחלים שהוסרו, כמתואר בפרוטוקול. הניסוי נערך פעמיים, עם ציפה של סוכר וללא ציפה של סוכר, כדי לקבוע אם הסרת שלב הציפה תגביר את מהירות התהליך מבלי לאבד רגישות (כלומר, כל הזחלים או רובם נמצאו) (איור 3). תועדו מספר הזחלים שנמצאו והזמן שהשקיע כל עובד בעיבוד הפרי בשיטת החיתוך, MSF או MS. הן עבור מנגו והן עבור פפאיה, שיטת MSF המלאה (כולל ציפה) הביאה למספר גבוה יותר של גילויי זחלים והייתה מהירה יותר מאשר חיתוך פירות (טבלה 1). עובדים שהשתמשו בשיטת חיתוך הפירות המסורתית פספסו 32% ו-35% מהזחלים שהונחו במנגו ובפפאיה, בהתאמה (טבלה 1). עיבוד פירות בכמויות גדולות באמצעות טכניקת MSF דרש 30% פחות זמן מאשר חיתוך מנגו בודד ו-35% פחות זמן מאשר חיתוך פפאיות בודדות (איור 3). נמצאו יותר זחלים בדקה בשיטת MSF עבור פפאיה (איור 3C) ומנגו (איור 3D) בהשוואה לשיטת חיתוך הפירות. כל הזחלים שנמצאו היו בחיים. זיהוי מורפולוגי של הזחל אפשרי רק עבור כוכבים מאוחרים. חזרנו על הניסוי הנ”ל אך השמטנו את הליך הציפה כדי לקבוע אם התאוששות הזחלים נותרה גבוהה ומהירות עיבוד הפירות גדלה. שיטת הטרשת הנפוצה (עם השמטת הציפה) הביאה ליותר זיהויים של זחלים עבור פפאיה (איור 4A) ומנגו (איור 4B) בהשוואה לחיתוך ולבדיקה חזותית. נוסף על כך, הטכניקה הייתה מהירה יותר מאשר חיתוך ובדיקה ויזואלית של פפאיה (איור 4C) ומנגו (איור 4D). הסרת שלב הציפה משיטת MSF קיצרה את הזמן למציאת זחלי כוכב מאוחרים ב-90% עבור פפאיה וב-48% עבור מנגו (טבלה 2). אחוז הזחלים שנמצאו היה גבוה בשתי השיטות והיה גבוה באופן עקבי עבור טרשת נפוצה (ציפה הושמטה). עבור פפאיה, 80% ו-85% מהזחלים נמצאו בשיטות MSF ו-MS, בהתאמה (טבלה 1 וטבלה 2). עבור מנגו, 88% ו-95% נמצאו בשיטות MSF ו-MS, בהתאמה (טבלה 1 וטבלה 2). השוואה בשטח בין שיטות חיתוך הפירות ושיטות MSFמטרת הניסוי הייתה להשוות בין שיטות חיתוך הפירות ושיטות MSF בתנאי שדה, תוך חיקוי תוכנית חירום של זבוב הפירות. עיבוד הפירות נעשה ללא הנוחות והתשתית של המעבדה לבדיקת מוכנות השטח של שתי שיטות מיצוי הזחלים. העבודה נערכה במטע גויאבה הממוקם ביחידה לחקר משאבים גנטיים ומחלות של צמחים טרופיים במשרד החקלאות האמריקאי (USDA-ARS) ליד הילו. בסך הכל נאספו 40 גויאבות שהראו סימני התפשטות וחולקו לשתי קבוצות. סה”כ 20 גויאבות עברו בדיקה חיתוך/ויזואלית ולאחריה MSF (כולל ציפה), שאפשרה להעריך את רגישות שיטת החיתוך בהשוואה לשיטת MSF. הנתיחה התנהלה כמתואר לעיל. כאשר זוהו, הזחלים הוסרו ונספרו. ארבעה פועלים ניתחו 5 גויאבות כל אחד, והזמן הדרוש לחיתוך ולבדיקה נרשם עבור כל פועל. לאחר החיתוך נערך MSF כאמור לעיל, אלא שבנוסף למסננות מס’ 8 ו-20 מ”מ נעשה שימוש במסננת רשת שלישית קטנה יותר (מס’ 40, 0.420 מ”מ) לאיסוף זחלים קטנים יותר. הסט השני של 20 גויאבות הוכנסו ל-2 שקיות עם רוכסן (10 פירות בכל שקית) והיו חשופות ל-MSF בלבד (כלומר, ללא חיתוך), מה שאפשר השוואה של הזמן הדרוש לחיתוך פירות לעומת MSF. כאמור, בהליך זה נעשה שימוש בשלוש מסננות. תועדו מספר הזחלים שנמצאו והזמן הכולל לעיבוד הפרי (מחיצת הפרי והחזקתו במשך 5 דקות בשקית/ניפוי/ציפה בתמיסת סוכר). כפי שנמצא במעבדה, חיתוך פירות המעיט בהערכת התפשטות הפירות והיה משתנה מאוד, וזיהה 25%-83% פחות זחלים ממה שניתן היה לשחזר בשיטות MSF (טבלה 3). יתר על כן, במדגם עם מספר נמוך של זחלים, MSF התאושש 500% יותר זחלים, מתן רגישות גבוהה יותר assay וסיכוי גדול יותר לזהות את האורגניזם שורץ. פירות עובדו הרבה יותר מהר בשיטת MSF בהשוואה לחיתוך; חיתוך ובדיקה של 5 פירות דרשו בערך אותו פרק זמן כמו עיבוד 10 פירות באמצעות MSF. איור 1: שלבים של פרוטוקול מיצוי זחלי זבוב הפירות. (A) לעבד כ-2 ליטר לפי נפח הפרי בבת אחת (למשל, 5 גויאבות או 5 מנגו בינוני מהווים דגימות מתאימות לשיטה זו). (B) חתכו את הפרי לחתיכות גדולות והכניסו אותו לשקית אחסון עם רוכסן בנפח 4 ליטר. (ג) הוסיפו מים לשקית עד שהמים יכסו את הפרי הקצוץ ב-25-50 מ”מ. (D) סחטו את הפרי בעדינות ביד עד שכל העיסה התנתקה מהקליפה וקיבלה מרקם חלק (כלומר, ללא גושים גדולים). (E) ערמו את המסננת עם המסננת הגדולה (מס’ 8; 2.36 מ”מ) ומעליה המסננת הקטנה (מס’ 20; 0.85 מ”מ). עבור כוכבים מוקדמים, הניחו מסננת שלישית (מס’ 45; 0.35 מ”מ) בתחתית הערימה. (F) יוצקים את העיסה לתוך המסננת העליונה. (ז) שטפו היטב את העיסה דרך ערימת המסננות באמצעות מים מברז, צינור או בקבוק עד שהעיסה הדקה עברה דרך המסננת הראשונה. (H) סרוק ויזואלית את המסננות העליונות לאיתור זחלי אינסטאר מאוחרים שאולי נשמרו עם הקליפה או כל פיסת פרי גדולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: מיצוי מוקדם ומאוחר של Anastrepha suspensa מפירות שנאספו בשדה. המספר הממוצע (± שגיאת תקן של הממוצע [SE]) של זחלי Anastrepha suspensa מחמישה פירות גויאבה שנאספו על ידי חיתוך ובדיקה חזותית (חיתוך: 70.4 ± 11.9) או שטיפת העיסה דרך סדרה של שלוש מסננות ולאחר מכן השריית העיסה בתמיסת מי סוכר (MSF: 175.6 ± 21.91) (A). המספר הממוצע של זחלים (±SE) שנאספו לדקה מ-5 גויאבות שעובדו על ידי חיתוך (1.21 ±-0.16) ועל ידי MSF (3.71 ±-0.50) (B). כל שיטה שוכפלה 5 פעמים, וכוכביות מעל הסורגים מצביעות על הבדלים משמעותיים במספר הזחלים (χ 2 = 6.81, p < 0.01) ובזמן התהליך (χ2 = 6.80, p < 0.01) בהתבסס על מבחן Kruskal-Wallis. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: אימות של שיטת ההשתקה-ניפוי-ציפה המלאה באמצעות התפשטות ידנית של מנגו ופפאיה כדי לדמות התפשטות נמוכה של Bactrocera dorsalis. המספר הממוצע של זחלי Bactrocera dorsalis (±SE) שנמצאו בפפאיה (חיתוך: 3.25 ± 0.51, MSF: 4.0 ± 0.4) (A) ומנגו (חיתוך: 3.4 ± 0.51, MSF: 4.4 ± 0.4) (B) פירות והמספר הממוצע של זחלים (±SE) שנאספו לדקה מפפאיה (חיתוך: 0.21 ± 0.1, MSF: 0.4 ± 0.15) (C) ומנגו (חיתוך: 0.14 ± 0.01, MSF: 0.21 ± 0.03) (D). פירות שעובדו בשיטות החיתוך או MSF (כולל ציפה, n = 5) שורצים ידנית 5 זחלי כוכב שלישי. כוכביות מעל הסורגים מצביעות על הבדלים משמעותיים במספר הזחלים שנמצאו בפפאיה (χ 2 = 5.39, p = 0.02) ובמנגו (χ2 = 3.94, p = 0.05) בהשוואה לחיתוך פירות המבוסס על בדיקות Kruskal-Wallis. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: תיקוף של שיטת הניפוי (הציפה הוסרה) באמצעות התפשטות ידנית של מנגו ופפאיה כדי לדמות התפשטות נמוכה של Bactrocera dorsalis. המספר הממוצע של זחלים (±SE) שנמצאו בפפאיה (חיתוך: 1.25 ± 0.48, MS: 4.25 ± 0.48) (A) ומנגו (חיתוך: 2.5 ± 0.5, MS: 4.75 ± 0.25) (B) פירות והמספר הממוצע של זחלים שנאספו לדקה (±SE) בפפאיה (חיתוך: 0.15 ± 0.05, MS: 0.76 ± 0.15) (C) ומנגו (חיתוך: 0.16 ± 0.04, MS: 0.44 ± 0.04) (D). פירות שורצים ידנית עם 5 זחלי כוכב שלישי Bactrocera dorsalis ועובדו על ידי חיתוך ובדיקה חזותית (חיתוך) או מעוך בשקית ונשטף דרך מסננות (רק מיסה וניפוי, ללא ציפה, n = 4). כוכביות מעל הסורגים מצביעות על הבדלים משמעותיים במספר הזחלים הנמצאים בפפאיה (χ 2 = 5.46, p = 0.02) ובמנגו (χ 2 = 5.25, p = 0.02) ובזמן עיבוד פפאיה (χ 2 = 5.39, p = 0.02) ומנגו (χ 2 = 5.39, p = 0.02) בהשוואה לחיתוך פירות, בהתבסס על בדיקות קרוסקל-ואליס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. פירות # פירות מעובדים #Larvae נוסף שיטת עיבוד נמצאו #Larvae זמן עיבוד (מינימום)* % התאוששות מנגו 25 25 חיתוך 17 158 68% מנגו 25 25 MSF 22 113 88% פפאיה 16 20 חיתוך 13 62 65% פפאיה 16 20 MSF 16 40 80% *סה”כ זמן מסכם מעל 5 עובדים. טבלה 1: מספר הזחלים שהתאוששו והזמן לעיבוד פירות באמצעות חיתוך ובדיקה חזותית (חיתוך) או שיטת השאיבה, הניפוי והציפה המלאה (MSF). פרי הבדיקה שורץ ידנית 5 זחלי אינסטאר שלישי מעורבבים עם פירות משועממים ומכוסים רק (1 מתוך 5 מנגו, 1 מתוך 4 פפאיות). פירות # פירות מעובדים #Larvae נוסף שיטת עיבוד נמצאו #Larvae זמן עיבוד (מינימום)* % התאוששות מנגו 20 20 חיתוך 10 66 50% מנגו 20 20 מ.ס. 19 44 95% פפאיה 16 20 חיתוך 5 38 25% פפאיה 16 20 מ.ס. 17 25 85% *סה”כ זמן מסכם מעל 4 עובדים. טבלה 2: מספר הזחלים שהתאוששו והזמן לעיבוד פירות על ידי חיתוך או מחיכה וניפוי בלבד, ציפה הושמטה (MS). פירות הניסוי שורצים ידנית חמישה זחלי אינסטאר שלישי מעורבבים עם פירות משועממים ומכוסים רק (1 מתוך 5 מנגו, 1 מתוך 4 פפאיה). עובד/שיטה #Fruit מעובד זמן לעיבוד (דקות) #Larvae נמצא חיתוך נמצאו #Larvae MSF* % מכלל הזחלים שנמצאו בחיתוך עובד 1: חיתוך 5 18 33 14 70% עובד 2: חיתוך 5 18 1 5 17% עובד 3: חיתוך 5 26 9 11** 75% עובד 4: חיתוך 5 20 24 עובד 5: MSF 10 22 נה 22 נה עובד 6: MSF 10 18 נה 37 נה * עיסת החיתוך והבדיקה החזותית מעובדת שוב בשיטת MSF כדי לקבוע את מספר הזחלים המאוחרים 2-3rd instar שהוחמצו ** ציפה של עובדים 2 ו-3 פירות שנאספו לפני עיבודם בשיטת MSF טבלה 3: מספר הזחלים הנמצאים בגויאבה שנאספה בשדה על-ידי חיתוך ובדיקה חזותית של הפרי (חיתוך) או על-ידי מחיצה, ניפוי וציפה (MSF) של הפרי.

Discussion

מטרתנו הייתה לפתח דרך יעילה ואפקטיבית למצוא זחלי טפריטיד בשטח. המוטיבציה להשקת תוכנית מיגור או הקמת אזור הסגר היא איתור נקבות או זחלים מזווגים6, המעידים על אוכלוסיית רבייה. השיטה הנוכחית של חיתוך וחיפוש חזותי של פירות אינה יעילה במציאת זחלים מכיוון שבדרך כלל יש הרבה יותר פירות פונדקאים מאשר ניתן לבדוק בנפרד. בנוסף, אוכלוסיות הטפריטידים ככל הנראה נמוכות באזור של פלישה חדשה, מה שהופך את הסיכויים למצוא זחלים בכמות גדולה של פירות לקשה מאוד. לדוגמה, בתוכנית למיגור Bactrocera dorsalis בפלורידה בשנת 2015, זוהו 54 מינים פונדקאים שונים, ויותר מ-4,000 פירות נחתכו. בתוכנית מיגור זו נמצאו רק זחלים בודדים במנגו, ולא נמצאו פונדקאים אחרים שורצים6. מצאנו כי שיטת MSF/MS הייתה רגישה יותר ומהירה יותר בזיהוי זחלי A. suspensa ו-B. dorsalis בעת עיבוד פירות עם כמות גדולה של עיסה (מנגו, גויאבה ופפאיה) בתפזורת בהשוואה לחיתוך פירות. הכמות הגדולה יותר של פירות פונדקאים שניתן לבדוק בשיטת השטיפה והניפוי, בשילוב עם הגברת הגילוי של זחל נדיר, עשויה להגדיל את ההסתברות לגילוי מוקדם של הזחל. גילוי מוקדם של אוכלוסיית רבייה עשוי להגדיל את הסיכוי למיגור ולהוזיל את עלויות התוכנית.

הניסויים שלנו הראו שמספר הזחלים שזוהו על ידי עובדים שחתכו ובדקו חזותית פירות השתנה במידה ניכרת. עובדים שחותכים פירות פספסו 50% ו-75% מזחלי B. dorsalis שהונחו במנגו ופפאיה, בהתאמה. לעומת זאת, רק 5% ו-15% מהזחלים הוחמצו בשיטת טרשת נפוצה לעיבוד פרי המנגו והפפאיה, בהתאמה. כמו כן, מחקר שבדק חיתוך פירות בנמלי הכניסה הראה שונות ניכרת במספר הפירות והזחלים השורצים שנמצאו על ידי המפקחים8. המחקר הראה כי פקחי נמלים מנוסים פספסו 64%-99% מזחלי A. suspensa ו-16%-82% מהפירות השורצים כאשר הפירות נחתכו ונבדקו ויזואלית8. התוצאות שלנו מצביעות על כך ששיטת השטיפה והניפוי עשויה להפחית את הסיכוי שעובד יחמיץ גילוי פרי שורץ.

ציפה של סוכר ומים חמים הם פרוטוקולים מקובלים בשיטת גישה מערכתית להבטחת דובדבנים ואוכמניות נקיים מזבובי פירות14. תת-קבוצה של משלוח נמעכת לתוך התמיסה, ואז מפקח מסנן חזותית את פני השטח של תמיסת הסוכר לנוכחות ביצים וזחלים. למרות שניתן לעבד מספר גדול יותר של פירות בהשוואה לחיתוך פירות בודדים, ההסתברות למצוא זחלים בטכניקות אלה עדיין מושפעת מיכולתו של המפקח, שלב ומספר הזחלים הנוכחים, וסוג הפרי8. מצאנו שכמו טפריטידים אחרים, B. dorsalis ו-A. suspensa נעקרים מעיסת הפרי וצפים אל פני השטח. באופן מעניין, מצאנו שעם זחלי אינסטאר מאוחרים גדולים יותר, שהם המטרה בתוכניות חירום ומיגור כפי שניתן לזהות אותם מורפולוגית, כולל ציפה של סוכר, לא הגבירו את הדיוק של השיטה. למעשה, הוספת שיטת הציפה הגדילה את זמן העיבוד ב -90% עבור פפאיה וב -48% עבור מנגו. זמן עיבוד ארוך יותר בתוספת החומרים הנוספים (כגון מים, פחים, סוכר וכו’) אינם תומכים תפעולית בהוספת שלב זה בעת חיפוש כוכבים גדולים בשטח. שיטת ציפה בסוכר עשויה להתאים כאשר המטרה היא לאתר את כל השלבים כולל כוכבים מוקדמים, כגון בנמלי כניסה ובתי אריזה. סינון תמיסת הסוכר עם מסננת רשת עדינה יספק ככל הנראה את הזיהוי המדויק ביותר של ביצים וכוכבי זחלים מוקדמים11,12.

טכניקות MS ו- MSF עובדות היטב עם פירות שניתן למעוך בקלות ויש להם נפח גדול של עיסה. זחלי Tephritid נוטים להתחפר לתוך עיסת פירות, מה שהופך זיהוי חזותי קשה. היבט קריטי של שיטות MS ו- MSF הוא הפרדת הזחלים ממוך השן. תהליך הניפוי מסיר את הציפה ובכך חושף את הזחלים על רשתות המסננת. באופן דומה, שיטת מי הסוכר מפרידה את הזחלים מהציפה על ידי כך שהיא גורמת לזחלים לצוף, בעוד העיסה שוקעת לתחתית המחבת. זחלים המופרדים ממוך השן בשיטות MS או MSF נצפים בקלות נעים על מסך המסננת או על פני המים. למרות ששיטת ההשתקה, הניפוי והציפה האופציונלית שיפרה מאוד את המהירות והדיוק של איתור זחלי טפריטיד בפירות פונדקאים חשובים, ייתכן שהתהליך אינו מתאים לכל הפירות. לדוגמה, פירות מארחים עם עיסה קשה, כגון אבוקדו ירוק או פרי עם זרע / בור גדול וכמות קטנה יחסית של עיסת, כגון שקדים טרופיים, עשויים להיות קלים יותר לעיבוד על ידי חיתוך ידני ובדיקה חזותית.

מצאנו ששיטות הטרשת הנפוצה וה-MSF היו מהירות יותר כאשר מספר קטן יחסית של פירות (5-10) עובדו. סביר להניח שההבדל יהיה גדול יותר אם יעובדו כמויות גדולות יותר של פירות, מה שעשוי להיות נחוץ ואופייני לתוכניות חירום של זבוב הפירות. הסרת שלב הציפה הגבירה עוד יותר את מהירות הגילוי מבלי לפגוע בדיוק של מציאת זחלי טפריטיד גדולים (>3 מ”מ). הראינו שאפשר לקחת את הטכניקות האלה לשטח, שדימה את התנאים שחווים עובדים במהלך תוכנית חירום של זבוב הפירות. המחקרים שלנו מצביעים על כך ששיטות הטרשת הנפוצה עשויות לאפשר זיהוי מהיר יותר של זחלי אינסטאר מאוחרים ולאחר מכן חיסול של אוכלוסיות רבייה של טפריטידים. MSF יכול לשמש לאיתור ביצים וכוכבים מוקדמים שאינם נמצאים כרגע על הכוונת של תוכניות מיגור.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לסילביה דוראן, טרי אלן, חוזה אלגריה ואלחנדרה קאנון על הסיוע בעיבוד הגויאבה באוניברסיטת פלורידה, ריק קורשימה, ג’ין אות’ וברוס אינאפוקו על העזרה בהערכת הפרי המלאכותי השורץ בהוואי, ולמייקל סטולברג על הערות מועילות על גרסאות מוקדמות יותר של כתב היד. פרויקט זה מומן בחלקו על ידי USDA APHIS והסכם שיתוף הפעולה של אוניברסיטת פלורידה ונתמך בחלקו על ידי USDA-ARS (פרויקט 2040-22430-027-00D). הממצאים והמסקנות בפרסום ראשוני זה לא הופצו באופן רשמי על ידי משרד החקלאות האמריקאי ואין לפרש אותם כמייצגים כל קביעה או מדיניות של הסוכנות. אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה נועד אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מרמז על המלצה או תמיכה של USDA. משרד החקלאות האמריקאי הוא ספק הזדמנויות שוות ומעסיק.

Materials

Anti foamer MicroLubrol ML200-50-4 MicroLubrol 2000 Fluid Pure Silicone Oil, https://www.microlubrol.com
Brown Sugar Dominos 1 lb Box  Dark Brown Sugar Crystals, https://www.dominosugar.com/products/dark-brown-sugar
Cutting Boards KitchenAid KE703NOSMGA KitchenAid Classic Nonslip Plastic Cutting Board, 12×18-Inch, https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11×14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&crid=UXMLNC72BL0
M&cv_ct_cx=cutting%2Bboards&keywords=cutting%2Bboards
&pd_rd_i=B091118V8T&pd_rd_r=
4c48b4ad-4d4d-4b4b-8799-fc7313
2f8e34&pd_rd_w=li862&pd_rd_wg
=KogbB&pf_rd_p=1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&pf_rd_r=9ATJD6W
QBF9DVRY889MP&qid=1673911
429&refresh=1&sprefix=cutting%2Bboards%2Caps%2C198&sr=1-2-8b2f235a-dddf-4202-bbb9-592393927392&th=1
Dish Pans Sterilite 06578012 White 12 qrt Dishpan, https://www.amazon.com/STERILITE-06578012-Sterilite-White-Dishpan/dp/B0039V2G5E/ref=sr_1_1?crid=2SMBMLFJF18U&keywords=
white+12+qt+dishpan+sterilite&qid=1673911729&s=home
-garden&sprefix=white+12+qr+dishpan+sterlite%2Cgarden%2C184&sr=1-1
EthOH Fisher Scientific BP8202500 Ethanol Solution 96%, Molecular Biology Grade, https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500
Glass Vials Fisher Scientific 0333921H Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials With Closures, https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H
Knives Zyliss 31380 5.25" Utility Knife, https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&keywords=
fruit%2Bcutting%2Bknives&qid=1673911609&s=
home-garden&sprefix=fruit%2Bcutting%2Bknives%2Cgarden%2C145&sr=1-7&th=1
No. 20 Mesh sieves Hogentogler & Co. Inc. 4221 U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
No. 45 Mesh sieves Hogentogler & Co. Inc. 4226 U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
No. 8 Mesh sieves Hogentogler & Co. Inc. 4215 U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
Soft Forceps DR Instruments DRENTF01 DR Instruments Featherweight Entomology Forceps, https://www.amazon.com/DR-Instruments-DRENTF01-Featherweight-Entomology/dp/B008RBLO8Q
Zipper Lock Storage Bags Ziploc 682254 Ziploc brand 2 gal Clear Freezer Bags, https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&keywords=
ziploc+freezer+bags+2+gallon&qid=1674504602&
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, I. M., Elson-Harris, M. M. . Fruit Files of Economic Significance: Their Identification and Bionomics. , (1992).
  2. Papadopoulos, N. T., Plant, R. E., Carey, J. R. From trickle to flood: the large-scale, cryptic invasion of California by tropical fruit flies. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 280 (1768), 20131466 (2013).
  3. Suckling, D. M., et al. Eradication of tephritid fruit fly pest populations: outcomes and prospects. Pest Management Science. 72 (3), 456-465 (2016).
  4. Mcinnis, D. O., et al. Can polyphagous invasive tephritid pest populations escape detection for years under favorable climatic and host conditions. American Entomologist. 63 (2), 89-99 (2017).
  5. Mutamiswa, R., Nyamukondiwa, C., Chikowore, G., Chidawanyika, F. Overview of oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel) (Diptera: Tephritidae) in Africa: From invasion, bio-ecology to sustainable management. Crop Protection. 141, 105492 (2021).
  6. Steck, G., et al. Oriental fruit fly eradication in Florida 2015-2016: program implementation, unique aspects, and lessons learned. American Entomologist. 65 (2), 108-121 (2019).
  7. Alvarez, S., Evans, E., Hodges, A. W. Estimated costs and regional economic impacts of the oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis) outbreak in Miami-Dade County, Florida. University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , (2016).
  8. Gould, W. Probability of detecting Caribbean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation by fruit dissection. Florida Entomologist. 73 (3), 502-507 (1995).
  9. Yee, W. L. Detection of Rhagoletis indifferens (Diptera: Tephritidae) larvae using brown sugar flotation and hot water methods. Journal of Applied Entomology. 136 (7), 549-560 (2012).
  10. Yee, W. L. Comparison of the brown sugar, hot water, and salt methods for detecting western cherry fruit fly (Diptera: Tephritidae) larvae in sweet cherry. Florida Entomologist. 97 (2), 422-430 (2014).
  11. Van Timmeren, S., Diepenbrock, L. M., Bertone, M. A., Burrack, H. J., Isaacs, R. A filter method for improved monitoring of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) larvae in fruit. Journal of Integrated Pest Management. 8 (1), 23 (2017).
  12. Van Timmeren, S., Davis, A. R., Isaacs, R. Optimization of a larval sampling method for monitoring Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) in blueberries. Journal of Economic Entomology. 114 (4), 1690-1700 (2021).
  13. Balagawi, S., et al. Evaluation of brown sugar flotation for detecting Queensland and Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation in Australian cherries. Crop Protection. 151, 105823 (2022).
  14. CFIA (Canadian Food Inspection Agency). Directive D-02-04: The Blueberry Certification Program and domestic phytosanitary requirements to prevent the spread of blueberry maggot (Rhagoletis mendax) within Canada. 2 Revision 10. CFIA (Canadian Food Inspection Agency). , (2020).
  15. Kendra, P. E., et al. Gas chromatography for detection of citrus infestation by fruit fly larvae (Diptera: Tephritidae). Postharvest Biology and Technology. 59 (2), 143-149 (2011).
  16. SAS Institute Inc. SAS 9.4 Guide to Software Updates and Product Changes. SAS Institute Inc. , (2013).

Tags

Tephritid Fruit FliesFruit Pulp SievingLarval DetectionAnastrepha SuspensaGuavaMangoPapayaInfestationEradication ProgramMushingSievingBrown Sugar Water SolutionImmature Life StagesLabor-intensiveCutting FruitVisual InspectionExtraction TechniqueField-collectedLow Infestation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Roda, A. L., Steck, G., Fezza, T., Shelly, T., Duncan, R., Manoukis, N., Carvalho, L., Fox, A., Kendra, P., Carrillo, D. Sieving Fruit Pulp to Detect Immature Tephritid Fruit Flies in the Field. J. Vis. Exp. (197), e65501, doi:10.3791/65501 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image