マウス卵母細胞におけるDNA二本鎖切断の検出

すべてのマウス実験は、地方自治体(ギリシャのヨアニナ州)によって承認され、欧州共同体理事会指令2010/63 / EUに従って実施されました。3Rの原理に関して実験を行った。実験に用いたCD-1マウスは全て、ギリシャ・ヨアニナ大学の動物飼育施設で、温度(22°C)、湿度(60%)を制御した室内で飼育し、 自由摂食させた。動物小屋は、繁殖(EL33-BIObr01)、供給(EL33-BIOsup01)、および実験(EL33BIO-exp01)のための施設を運営するライセンスを持っています。 1.試薬の調製 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)粉末(材料表を参照)をジメチルスルホキシド(DMSO)(材料表を参照)で最終濃度200 mMに希釈します。10 μLをアリコートし、-20°Cで保存します。 1ヶ月以内にソリューションを使用してください。注:IBMXパウダーは-20°Cに保たれます。 すべての免疫蛍光バッファーを調製し、4°Cで保存します。1つのPBS錠剤( 材料表を参照)を200mLのddH2Οで希釈することにより、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製します。 マグネチックスターラー(材料表参照)で攪拌しながら、80 mLのddH 2 Ο、0.59575 gのHEPES、1.81422 gのPIPES、0.38035 gのEGTAおよび0.04066 gのMgCl2(材料表を参照)を添加してPHEMバッファーを作成し、pHが6.9に達するまで同時にNaOH(材料表を参照)を添加します(pH/ORPメーターを使用して確認してください[材料表を参照])。次に、ddH2Οを最終容量100 mLまで加えます。 PFA粉末(材料表参照)をPHEMバッファーで希釈し、最終濃度4%PFAで加熱しながらマグネチックスターラーで攪拌することにより、パラホルムアルデヒド-トリトン-X-100(PFA-Tx-100)バッファーを調製します。次に、シリンジと0.2 μmフィルターを使用してバッファーをろ過し(材料表を参照)、0.5%Tx-100を追加します(材料表を参照)。約10 mLのPFA-Tx-100(0.4 gのPFA、50 μLのTx-100)を準備しますが、これは1回の実験に十分です。4°Cで最大1週間保管してください。注意: PFAを取り扱うために手袋を着用し、皮膚や目との接触を避けてください。 PBSにウシ血清アルブミン(最終濃度:0.5% w/v BSA)(材料表参照)を加えて洗浄バッファーを調製し、機械的に撹拌します。10%w/v NaN3バッファー(アジ化ナトリウム)を1:1,000希釈で添加し、真菌および細菌汚染のリスクを最小限に抑えます。10mLのddH2Oに1gのNaN 3粉末(材料表を参照)を加えることにより、10%w/v NaN3緩衝液を作る。NaN3バッファーを室温で保存する。 PBSにBSA(最終濃度:3%w/v)を添加し、機械的に撹拌してブロッキングバッファーを調製します。10%NaN3 バッファーを1:1,000希釈で添加します。 2.解剖した卵巣からのGV卵母細胞の採取とDSBの誘導 注意: すべてのツールとソリューションは無菌である必要があります。卵母細胞の取り扱いは、実体顕微鏡下でマウスピペットを使用して行われ(材料の表を参照)、すべての滴は鉱油で覆われています(材料の表と図1Eを参照)。 頸部脱臼によってマウスを淘汰する46〜48時間前に、妊娠中の牝馬の血清ゴナドトロピン(PMSG)( 材料の表を参照)の7国際単位(IU)をマウス腹腔内注射します。注:使用するすべてのマウスは8〜12週齢である必要があります。 M2培地(材料表参照)をシリンジと0.2 μmフィルターでろ過し、IBMX 200 mMを14 mL丸底チューブ(材料表参照)で最終濃度200 μMまで添加して、卵母細胞を前期Iで停止させます。次に、プラスチック組織培養皿(材料表を参照)でM2-IBMX培地の滴を調製し、卵母細胞単離の前に少なくとも30分間、37°Cのホットブロック(材料表を参照)に置きます。M2は4°Cで保管してください。 子宮頸部脱臼によってマウスを屠殺し、卵巣を解剖し、M2-IBMXで5 mLの丸底チューブ( 材料表を参照)に入れます。 卵巣を1.5 mLのM2-IBMXを含むプラスチック製の蓋に移し、卵巣周囲脂肪組織または卵管セグメントを取り除き、27 Gの針で卵巣を機械的に穿孔してCOCを放出します(材料表および図1A-Cを参照)。 COCをM2-IBMX(それぞれ約25〜30 μL)の滴を入れた培養皿に移し、狭口径ガラスパスツールピペットを使用してピペッティングを繰り返して卵丘細胞を除去します( 材料表 および 図1Dを参照)。 SN GV期の卵母細胞を選択し、光から保護された37°Cのホットブロック上のM2-IBMX培地のドロップ(25 μL)に移します(図1F)。核が末梢に配置されているNSN卵母細胞とは対照的に、より大きなサイズと中央に配置された核に基づいてSN卵母細胞を探します21。いずれの場合も、GV卵母細胞の種類(SNまたはNSN)について最終決定を下す前に、共焦点顕微鏡でDNA構成を観察してください。 エトポシドを使用してDSBを誘導します( 材料表を参照)。GV期の卵母細胞を遺伝毒性物質の滴(各25 μL)に入れて、暗条件下で37°Cのホットブロックに1時間置きます。注:エトポシドは、DSBをDNA22に導入するトポイソメラーゼII阻害剤です。エトポシドを20 mg/mLの10 μLアリコートに保ち、室温で光から保護します。テストされた濃度は、5 μg/mL、20 μg/mL、および50 μg/mLです。 GV期の卵母細胞を長期間停止させ続けるには、37°C、5%CO2のインキュベーター(材料表を参照)で400 μM IBMXを添加したM16培養培地(材料表を参照)の滴に卵母細胞を入れます。M16を4°Cで保存し、シリンジと0.2 μmフィルターで培地をろ過し、使用前に少なくとも1時間インキュベートします。 図1:卵母細胞の単離プロセス 。 (A)IBMXを用いたM2培地中の卵巣からの卵巣周囲脂肪組織および残りの卵管セグメントの除去。実体顕微鏡接眼レンズを通して得られた写真。スケールバー = 1 mm。 (B)IBMXを用いたM2培地中の単離された卵巣。実体顕微鏡接眼レンズを通して得られた画像。スケールバー = 1 mm。 (C)IBMXを用いたM2培地中の27G針を用いた卵巣の機械的穿孔。実体顕微鏡接眼レンズを通して得られた画像。スケールバー = 1 mm。 (D)IBMXを用いたM2培地での穿孔後に卵巣から放出されたCOC。実体顕微鏡接眼レンズを通して得られた画像。スケールバー = 100 μm。 (E)マウスピペットを用いた卵母細胞採取。(f)剥巣した卵母細胞を、周囲の卵丘細胞を除去した後、IBMXと共にM2培地に入れる。実体顕微鏡接眼レンズを通して得られた画像。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 3.卵母細胞の固定と免疫蛍光 注:卵母細胞の取り扱いは、実体顕微鏡下でマウスピペットを使用して行われ、すべての滴は鉱油で覆われています。 コントロールおよびエトポシド処理したGV卵母細胞を、PFA-Tx-100バッファーを含む異なるプラスチック組織培養皿に室温で40分間入れます。 卵母細胞を3つの異なる滴の洗浄バッファー(各50 μL)で室温で洗浄します。卵母細胞を各滴で5分間放置します。 卵母細胞をブロッキングバッファー(各25 μL)の滴に37°Cのホットブロック上で1時間入れます。 γH2AX(ウサギリン酸化-Η2ΑΧ)を認識する一次抗体(Ser139)( 材料表参照)を調製します(原液:1 mg/mL)。ブロッキングバッファーで1:200希釈し、卵母細胞を一次抗体の滴(各15 μL)に入れて4°Cで一晩入れます。注:Phospho-Η2ΑΧ(γH2AX)は、体細胞とGV卵母細胞の両方でDSBを検出するための一般的なマーカーです18,23。 翌日、室温で3つの異なる滴の洗浄バッファー(各50μL)で卵母細胞を洗浄します。卵母細胞を各滴で5分間放置します。 二次抗体であるAlexa Fluor 488結合ヤギ抗ウサギ( 材料表参照)を調製します(原液:2 mg/mL)。ブロッキングバッファーで1:200希釈し、卵母細胞を二次抗体(各15 μL)の滴に入れて、光から保護された37°Cのホットブロックに1時間置きます。 卵母細胞を、透過処理された細胞のDNAのみを染色する遠赤色蛍光DNA色素であるDRAQ7(各25 μL)(ストック溶液:0.3 mM、 材料表を参照)の滴に移します。洗浄バッファーで1:250希釈し、暗所で室温で10分間使用します。 卵母細胞を3つの異なる滴の洗浄バッファー(各50 μL)で室温で洗浄します。各滴を5分間放置した後、共焦点顕微鏡用に35 mmのガラス底ペトリ皿( 材料表を参照)の少量の滴(各約5 μL)の洗浄バッファーに移します(図2A)。注:DNA染色剤と二次抗体の両方の洗浄は同時に行われます。 4. 共焦点顕微鏡 注:共焦点顕微鏡は、ガラス底皿に卵母細胞を配置した後の蛍光強度の低下を避けるために、直ちに実施する必要があります。電動ステージを備えた共焦点顕微鏡( 材料表を参照)へのアクセスが必要です。 顕微鏡のセットアップ共焦点システムでは、レーザーコントローラー、レーザー、顕微鏡コントローラー、透過光用ランプ、およびPCのスイッチを入れます(図2B、D)。 共焦点ソフトウェアを開き、 40倍オイルレンズを選択します。 ディッシュを標本ホルダーに入れ、ジョイスティックを使用してステージをXY軸とZ軸で動かして、卵母細胞に焦点を合わせようとします(図2C)。 卵母細胞のスキャン飽和を最小限に抑えるために、 実験ごとにレーザー出力、 ゲイン、 ピンホールサイズ を個別に設定します。 卵母細胞ごとに、関心のある領域、特にDNA領域の核を設定します。DNA領域の境界を定義し、 zステップサイズ を 3μmに調整します。次に、スキャンを開始します。 選択したフォルダー内の各セルの画像を保存します。 スキャンが完了したら、ソフトウェアを終了し、コンピューターをシャットダウンして、レーザーコントローラー、レーザー、顕微鏡コントローラー、および透過光のランプをオフにします。 図2:共焦点顕微鏡 。 (A)免疫蛍光プロトコルとDNA染色を行った後に卵母細胞を固定し、別々の滴の洗浄バッファーに入れ、鉱油で覆い、ガラス底皿に入れ、共焦点顕微鏡イメージング用に準備しました。各ドロップには、異なる実験カテゴリが含まれています。実体顕微鏡接眼レンズを通して得られた画像。スケールバー = 1 mm/100 μm (ズームイン部分)(B)共焦点顕微鏡ステージに載せたガラス底板。(C)共焦点顕微鏡で得られた卵母細胞の明視野画像。スケールバー = 100 μm。 (D)共焦点顕微鏡システム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 5. イメージング解析 Fiji ImageJ-win64 をブラウザー (https://imagej.net/software/fiji/downloads) でダウンロードして開き、データを TIFF スタック ファイルとしてインポートします。注: 各卵母細胞ファイルを個別に開きます。 画像をクリック |カラー |[チャネルの分割] : すべてのチャネルを分割します。 LUT(ルックアップテーブル)をクリックして、各チャンネルの好みの色を選択します。 画像をクリック |カラー |チャンネルをマージ して、γΗ2ΑΧとDNAのチャンネルをマージします。明視野チャネルはマージしないままにします。 NSN卵母細胞およびDNA損傷のレベルが低いSN卵母細胞では、γΗ2ΑΧがDNA領域の病巣として検出されます。この場合、「 マルチポイント」またはポイント コマンドをクリックして、DNAと一致するすべてのγΗ2ΑΧフォーカスを選択します。すべてのスタックに対してこの手順を繰り返します。 高レベルのDNA損傷を有するSN卵母細胞では、γΗ2ΑΧシグナルはDNA領域全体に分布している。この場合、 画像|スタック |Z プロジェクトを選択し、[ フリーハンド選択 ]コマンドを使用して、DNA 領域全体を選択します。 γΗ2ΑΧ蛍光を測定するには、 解析|測定し、測定値を.xlsxファイルにコピーします。次に、平均蛍光を計算し、値を正規化し、焦点の数を数えてからグラフを作成します。 [分析] をクリックします。[スケールを設定]を設定してスケールを設定し、[分析]をオンにします。ツール |縮尺記号: チャンネルに縮尺記号を追加します。