Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo
Summary
Mantenere l’integrità del genoma dell’ovocita è necessario per garantire la fedeltà genetica nell’embrione risultante. Qui, presentiamo un protocollo accurato per rilevare le rotture del doppio filamento del DNA nelle cellule germinali femminili dei mammiferi.
Abstract
Gli ovociti sono tra le cellule più grandi e longeve del corpo femminile. Si formano nelle ovaie durante lo sviluppo embrionale e rimangono arrestate alla profase della meiosi I. Lo stato di quiescenza può durare per anni fino a quando gli ovociti ricevono uno stimolo per crescere e ottenere la competenza per riprendere la meiosi. Questo stato di arresto prolungato le rende estremamente suscettibili all’accumulo di insulti dannosi per il DNA, che colpiscono l’integrità genetica dei gameti femminili e, quindi, l’integrità genetica del futuro embrione.
Di conseguenza, lo sviluppo di un metodo accurato per rilevare il danno al DNA, che è il primo passo per stabilire meccanismi di risposta al danno al DNA, è di vitale importanza. Questo articolo descrive un protocollo comune per testare la presenza e l’andamento del danno al DNA in ovociti arrestati dalla profase durante un periodo di 20 ore. In particolare, sezioniamo le ovaie di topo, recuperiamo i complessi cumulo-ovocita (COC), rimuoviamo le cellule del cumulo dai COC e coltiviamo gli ovociti in un terreno Μ2 contenente 3-isobutil-1-metilxantina per mantenere lo stato di arresto. Successivamente, gli ovociti vengono trattati con il farmaco antineoplastico citotossico, l’etoposide, per generare rotture a doppio filamento (DSB).
Utilizzando l’immunofluorescenza e la microscopia confocale, rileviamo e quantifichiamo i livelli della proteina core γH2AX, che è la forma fosforilata dell’istone H2AX. H2AX diventa fosforilato nei siti dei DSB dopo un danno al DNA. L’incapacità di ripristinare l’integrità del DNA in seguito a danni al DNA negli ovociti può portare a infertilità, difetti alla nascita e aumento dei tassi di aborti spontanei. Pertanto, la comprensione dei meccanismi di risposta al danno del DNA e, allo stesso tempo, la creazione di un metodo intatto per lo studio di questi meccanismi sono essenziali per la ricerca in biologia riproduttiva.
Introduction
Il processo di meiosi nelle cellule germinali femminili dei mammiferi inizia nelle ovaie prima della nascita. Il numero totale di ovociti si stabilisce nelle ovaie principalmente durante l’embriogenesi. Gli ovociti entrano in meiosi e rimangono arrestati alla profase I1. Dopo l’inizio della pubertà e la produzione e l’azione endocrina dell’ormone follicolo-stimolante (FSH) e dell’ormone luteinizzante (LH), gli ovociti possono ricominciare e completare la meiosi2. Nell’uomo, l’arresto della profase può durare fino a 50 anni3. Le divisioni cellulari che seguono l’ingresso nella meiosi I sono asimmetriche, con conseguente produzione di un piccolo corpo polare e di un ovocita che mantiene le sue dimensioni. Pertanto, la maggior parte dei componenti citoplasmatici sono immagazzinati nell’ooplasma durante l’embriogenesi precoce4. Successivamente, gli ovociti entrano nella meiosi II, senza riformare il nucleo o decondensare i cromosomi, e rimangono arrestati alla metafase II fino alla fecondazione5.
Una caratteristica unica che distingue gli ovociti dalle cellule somatiche è lo stato di arresto nella profase I, quando l’ovocita possiede un nucleo intatto (arresto della vescicola germinale [GV]), indicato come stadioGV 6. In base all’organizzazione della cromatina, gli ovociti allo stadio GV sono classificati in due categorie: nucleolo non circondato (NSN) e nucleolo circondato (SN)7,8. Negli ovociti in stadio NSN GV, la cromatina si diffonde in tutta la regione nucleare e la trascrizione è attiva, mentre negli ovociti SN, la cromatina forma un anello compatto che circonda il nucleolo e la trascrizione è silente9. Entrambi i tipi di ovociti allo stadio GV mostrano competenza meiotica; entrano in meiosi alla stessa velocità, ma gli ovociti NSN presentano una bassa capacità di sviluppo e non possono svilupparsi oltre lo stadio embrionale10 a due cellule.
Lo stato prolungato di arresto della profase I aumenta l’incidenza dell’accumulo di danni al DNA11. Pertanto, i meccanismi di risposta al danno al DNA negli ovociti sono essenziali per consentire la produzione di gameti con integrità genetica e per garantire che l’embrione risultante abbia un contenuto cromosomico fisiologico.
Un aspetto centrale della risposta al danno del DNA è la riparazione del DNA. Le principali vie per la riparazione del DSB nelle cellule eucariotiche includono l’unione delle estremità non omologhe (NHEJ), la ricombinazione omologa (HR) e l’NHEJ alternativo12,13,14,15. NHEJ è un meccanismo più veloce ma più soggetto a errori, mentre HR richiede più tempo per essere completato, ma ha un’alta fedeltà16.
Non ci sono abbastanza conoscenze sui meccanismi che gli ovociti utilizzano per riparare i danni al DNA. Gli studi hanno dimostrato che il danno al DNA indotto negli ovociti di mammiferi adulti dall’uso di agenti genotossici, come l’etoposide, la doxorubicina o le radiazioni UVB o ionizzanti, non influisce sui tempi e sui tassi di uscita dall’arresto della profase I17. Gli ovociti possono andare incontro a rottura del GV (GVBD) anche in presenza di livelli elevati di danno. Questo danno può essere determinato dall’osservazione di γH2AX. Questa forma fosforilata di H2AX (γΗ2ΑΧ) è un marcatore DSB, che si trova nel sito delle rotture e funziona come un’impalcatura per aiutare i fattori di riparazione e le proteine ad accumularsi alle estremità rotte18.
L’assenza di arresto del ciclo cellulare a seguito di un danno al DNA è dovuta a un insufficiente checkpoint del danno al DNA che consente agli ovociti con DNA non riparato di rientrare in meiosi. A seguito di alti livelli di danno al DNA, un checkpoint può mantenere l’arresto della profase attraverso l’attivazione di una via dipendente da ATM/Chk1. La limitata risposta dei punti di controllo ai DSB è dovuta all’attivazione limitata di ATM17,19. Nella fase M della meiosi I, la ricerca ha dimostrato che il danno al DNA può attivare un checkpoint della meiosi I indotto dal checkpoint dell’assemblaggio del fuso (SAC), che impedisce l’attivazione del complesso/ciclosoma promotore dell’anafase dell’ubiquitina ligasi E3 (APC/C) e, quindi, l’uscita dalla fase M. Inoltre, l’ablazione delle proteine SAC supera lo stato di arresto della fase M, sottolineando così l’importanza della SAC nello stabilire il puntodi controllo 20 della meiosi I.
Come dimostrano chiaramente ricerche precedenti, i DSB non possono indurre un robusto checkpoint profasico negli ovociti di topo. Se tale danno non viene riparato, potrebbe portare a embrioni portatori di anomalie cromosomiche. Pertanto, è importante studiare la risposta al danno del DNA nelle diverse fasi della gametogenesi femminile per comprendere meglio i percorsi unici che gli ovociti utilizzano per far fronte a potenziali insulti genetici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando il metodo qui descritto, abbiamo rilevato DSB negli ovociti di mammifero. Questo metodo consente di rilevare e studiare il processo di riparazione del DNA negli ovociti. Lo stesso protocollo potrebbe essere utilizzato anche per l’analisi di altre proteine che partecipano ai processi fisiologici negli ovociti di mammifero. È importante studiare come gli ovociti rispondono a potenziali danni al DNA per comprendere meglio la causa della subfertilità femminile nell’uomo.
Studiare la risposta al danno al DNA negli ovociti dei mammiferi può essere difficile a causa della sensibilità degli ovociti. La manipolazione degli ovociti richiede temperature specifiche e concentrazioni di CO 2 e O2 . Allo stesso tempo, gli ovociti devono essere protetti dalla luce. La manipolazione deve essere effettuata utilizzando pipette di vetro non troppo strette, in quanto ciò potrebbe essere dannoso per gli ovociti, ma anche non troppo larghe, in quanto ciò potrebbe causare la diluizione del terreno e, quindi, influire negativamente sulla procedura di fissazione. In ogni fase della fissazione, vengono utilizzate diverse gocce di tamponi per ridurre al minimo l’effetto di diluizione. Un modo alternativo per osservare i DSB è il saggio Comet24. Anche se questa tecnica è più sensibile, è più complicata. Allo stesso tempo, utilizzando il test Comet, non è possibile rilevare l’esatta regione del DNA in cui si verifica il danno e nelle cellule con abbondanti molecole di RNA, come gli ovociti in stadio GV25, il fondo potrebbe essere aumentato, portando a un falso segnale di danno al DNA26.
Utilizzando il protocollo di immunofluorescenza qui descritto, siamo in grado di rilevare i DSB con precisione e stimare il progresso della riparazione negli ovociti in stadio GV, come indicato dalla riduzione della fluorescenza γH2AX nel tempo. Tuttavia, una limitazione di questo metodo è che alcuni anticorpi possono presentare una distribuzione aspecifica in tutto l’ooplasma, portando così a immagini con un’elevata fluorescenza di fondo. Il tampone PFA-Tx-100 viene utilizzato al posto del PFA sequenziale e del Tx-100, in quanto abbiamo osservato che migliora il processo di fissazione consentendo la rilevazione di una minore fluorescenza di fondo e non specifica. Una seconda limitazione dell’uso di γH2AX per il rilevamento di DSB è che il danno non può essere stimato dopo GVBD a causa della fosforilazione spontanea di γH2AX nella meiosi23.
In questo protocollo di immunofluorescenza, gli ovociti rimangono in un tampone liquido e non possono essere conservati all’interno di vetrini. Questo fatto rende difficile conservare le cellule fisse per giorni dopo l’aggiunta dell’anticorpo secondario. Al fine di ottenere immagini di buona qualità e di non perdere il segnale, è preferibile eseguire l’imaging entro poche ore dall’aggiunta dell’anticorpo secondario. Va anche notato che la scansione dei nuclei attraverso l’asse Z potrebbe rendere il segnale più debole a causa della sovraesposizione. Per questo motivo, è preferibile ridurre la potenza del laser e aumentare la velocità di scansione.
Infine, un’altra limitazione del protocollo di immunofluorescenza è che può essere utilizzato solo per cellule fisse/non viventi. Pertanto, possiamo stimare solo la presenza e l’assenza di fattori in punti temporali specifici senza sapere se ci sono fluttuazioni nella loro concentrazione o cambiamenti nel loro comportamento nel tempo. Questo problema potrebbe essere superato utilizzando l’imaging di cellule vive e marcatori marcati con fluorescenza.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il sostegno a questo lavoro da parte del progetto “Creazione di infrastrutture di ‘capacity building’ nella ricerca biomedica (BIOMED-20)” (MIS 5047236), che è implementato nell’ambito dell’azione “Rafforzamento dell’infrastruttura di ricerca e innovazione”, finanziata dal programma operativo “Competitività, imprenditorialità e innovazione” (NSRF 2014-2020) e cofinanziata dalla Grecia e dall’Unione europea (Fondo europeo di sviluppo regionale).
Materials
| 3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated | APTACA | 1502 | |
| 10 cc syringes | SoftCare | 114.104.21 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab | Biotium | 20012 | |
| Anti-phospho-H2A.X (Ser139) | Merck Millipore | 07-164 | |
| ARE Heating Magnetic Stirrer | VELP Scientifica | F20500162 | |
| BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| BD Microlance 3 Needles 27 G – 0.40 x 13 mm | Becton Dickinson | 300635 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| DMSO Anhydrous | Biotium | 90082 | |
| DRAQ7 DNA dye | BioStatus | DR71000 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| EMSURE MgCl2. 6H2O | Merck Millipore | 1058330250 | |
| Etoposide | CHEMIPHARM | L01CB01 | |
| FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | Corning Science | 532057 | |
| FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style | Corning Science | 353001 | |
| Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147-25G | |
| HERACELL 150i CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 50116048 | |
| IBMX powder | Sigma-Aldrich | I5879-100MG | |
| Leica M125 Stereo Microscope | Leica Microsystems | ||
| M16 Medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| NaN3 | Honeywell | 13412H | |
| NaOH | Merck Millipore | 1064981000 | |
| Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope | Nikon Corporation | ||
| Nikon SMZ800N Stereo Microscope | Nikon Corporation | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm | DURAN WHEATON KIMBLE | 357335 | |
| pH/ORP meter | Hanna Instruments Ltd | HI2211 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| PMSG Protein Lyophilised | Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology) | GWB-2AE30A (now OPPA01037) | |
| QBD4 Dry block heater | Grant Instruments (Cambridge) Ltd | A25218 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Whatman Puradisc 25 mm 0.2 μm filters | GE Healthcare | 6780-2502 |
References
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