الكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل في بويضات الفئران
Summary
يعد الحفاظ على سلامة جينوم البويضة أمرا ضروريا لضمان الإخلاص الجيني في الجنين الناتج. هنا ، نقدم بروتوكولا دقيقا للكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوجة في الخلايا الجرثومية الأنثوية للثدييات.
Abstract
البويضات هي من بين أكبر الخلايا وأكثرها عمرا في جسم الأنثى. تتشكل في المبيضين أثناء التطور الجنيني وتظل محتجزة في الطور التمهيدي للانقسام الميوزي الأول. قد تستمر الحالة الهادئة لسنوات حتى تتلقى البويضات حافزا للنمو والحصول على الكفاءة لاستئناف الانقسام الميوزي. هذه الحالة المطولة من الاعتقال تجعلهم عرضة للغاية لتراكم الإهانات الضارة بالحمض النووي ، والتي تؤثر على السلامة الوراثية للأمشاج الأنثوية ، وبالتالي على السلامة الوراثية للجنين المستقبلي.
وبالتالي ، فإن تطوير طريقة دقيقة للكشف عن تلف الحمض النووي ، وهو الخطوة الأولى لإنشاء آليات استجابة لتلف الحمض النووي ، له أهمية حيوية. تصف هذه الورقة بروتوكولا شائعا لاختبار وجود وتطور تلف الحمض النووي في البويضات الموقوفة بالطور خلال فترة 20 ساعة. على وجه التحديد ، نقوم بتشريح مبيض الفئران ، واسترداد مجمعات البويضات الركامية (COCs) ، وإزالة الخلايا الركامية من موانع الحمل الفموية ، وزراعة البويضات في وسط Μ2 الذي يحتوي على 3-isobutyl-1-methylxanthine للحفاظ على حالة الاعتقال. بعد ذلك ، يتم التعامل مع البويضات بعقار مضاد للأورام سام للخلايا ، إيتوبوسيد ، لتوليد فواصل مزدوجة الخيوط (DSBs).
باستخدام التألق المناعي والمجهر متحد البؤر ، نقوم باكتشاف وتحديد مستويات البروتين الأساسي γH2AX ، وهو الشكل المفسفر للهيستون H2AX. يصبح H2AX مفسفرا في مواقع DSBs بعد تلف الحمض النووي. يمكن أن يؤدي عدم القدرة على استعادة سلامة الحمض النووي بعد تلف الحمض النووي في البويضات إلى العقم والعيوب الخلقية وزيادة معدلات الإجهاض التلقائي. لذلك ، فإن فهم آليات الاستجابة لتلف الحمض النووي ، وفي الوقت نفسه ، إنشاء طريقة سليمة لدراسة هذه الآليات أمر ضروري لأبحاث البيولوجيا الإنجابية.
Introduction
تبدأ عملية الانقسام الاختزالي في الخلايا الجرثومية الأنثوية في الثدييات في المبايض قبل الولادة. يتم إنشاء العدد الإجمالي للبويضات في المبيضين في المقام الأول أثناء التطور الجنيني. تدخل البويضات الانقسام الميوزي وتظل محتجزة في الطور التمهيديالأول 1. بعد بداية البلوغ وإنتاج وعمل الغدد الصماء للهرمون المنبه للجريب (FSH) والهرمون اللوتيني (LH) ، قد تستأنف البويضات وتكمل الانقسامالاختزالي 2. في البشر ، يمكن أن يستمر توقف الطور لمدة تصل إلى 50 عاما3. الانقسامات الخلوية بعد الدخول في الانقسام الميوزي الأول غير متماثلة ، مما يؤدي إلى إنتاج جسم قطبي صغير وخلية بويضية تحتفظ بحجمها. وبالتالي ، يتم تخزين معظم مكونات السيتوبلازم في البويضة أثناء التطور الجنينيالمبكر 4. بعد ذلك ، تدخل البويضات الانقسام الاختزالي الثاني ، دون إعادة تشكيل نواتها أو تكثيف كروموسوماتها ، وتظل محتجزة في الطور الثاني حتى الإخصاب5.
الخاصية الفريدة التي تميز البويضات عن الخلايا الجسدية هي حالة الاعتقال في الطور التمهيدي الأول ، عندما تمتلك البويضة نواة سليمة (توقف الحويصلة الجرثومية [GV]) ، يشار إليها باسم المرحلة6 من GV. بناء على تنظيم الكروماتين ، يتم تصنيف البويضات في مرحلة GV إلى فئتين: النواة غير المحاطة (NSN) والنواة المحاطة (SN) 7,8. في البويضات في مرحلة NSN GV ، ينتشر الكروماتين في جميع أنحاء المنطقة النووية بأكملها ، ويكون النسخ نشطا ، بينما في بويضات SN ، يشكل الكروماتين حلقة مضغوطة تحيط بالنواة ، ويكون النسخ صامتا9. كلا النوعين من البويضات في مرحلة GV تظهر الكفاءة الاختزالي. يدخلون الانقسام الاختزالي بنفس المعدل ، لكن بويضات NSN تقدم قدرة تنموية منخفضة ولا يمكن أن تتطور إلى ما بعد مرحلة الجنينالمكونة من خليتين 10.
تزيد الحالة المطولة للتوقف عن المرحلة الأولى من حدوث تراكم تلف الحمض النووي11. ومن ثم، فإن آليات استجابة تلف الحمض النووي (DNA) في البويضات ضرورية للسماح بإنتاج الجاميتات ذات السلامة الوراثية، ولضمان احتواء الجنين الناتج على محتوى كروموسومي فسيولوجي.
أحد الجوانب المركزية لاستجابة تلف الحمض النووي هو إصلاح الحمض النووي. تشمل المسارات الرئيسية لإصلاح DSB في الخلايا حقيقية النواة الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) ، وإعادة التركيب المتماثل (HR) ، والبديل NHEJ12،13،14،15. NHEJ هي آلية أسرع ولكنها أكثر عرضة للخطأ ، بينما تتطلب الموارد البشرية مزيدا من الوقت لإكمالها ولكنها تتمتع بدقةعالية 16.
لا توجد معرفة كافية حول الآليات التي تستخدمها البويضات لإصلاح تلف الحمض النووي. أظهرت الدراسات أن تلف الحمض النووي الناجم عن بويضات الثدييات كاملة النمو باستخدام عوامل سامة للجينات ، مثل إيتوبوسيد أو دوكسوروبيسين أو الأشعة فوق البنفسجية أو الإشعاع المؤين ، لا يؤثر على توقيت ومعدلات الخروج من الطور الأول17. يمكن أن تخضع البويضات لانهيار GV (GVBD) حتى في وجود مستويات مرتفعة من الضرر. يمكن تحديد هذا الضرر من خلال مراقبة γH2AX. هذا الشكل المفسفر من H2AX (γΗ2ΑΧ) هو علامة DSB ، والتي تقع في موقع الفواصل وتعمل كسقالة للمساعدة في إصلاح العوامل والبروتينات لتتراكم في النهايات المكسورة18.
يرجع عدم توقف دورة الخلية بعد تلف الحمض النووي إلى عدم كفاية نقطة فحص تلف الحمض النووي التي تسمح للبويضات ذات الحمض النووي غير المصلح بالعودة إلى الانقسام الاختزالي. بعد مستويات عالية من تلف الحمض النووي ، يمكن لنقطة التفتيش الحفاظ على توقف الطور من خلال تنشيط مسار يعتمد على ATM / Chk1. ترجع استجابة نقاط التفتيش المحدودة ل DSBs إلى التنشيط المحدود لأجهزة الصراف الآلي17,19. في المرحلة M من الانقسام الاختزالي الأول ، أظهرت الأبحاث أن تلف الحمض النووي قد ينشط نقطة تفتيش تجميع المغزل (SAC) التي يسببها الانقسام الاختزالي I ، مما يمنع تنشيط مركب / سيكلوزوم تعزيز الطور E3 ubiquitin ligase (APC / C) ، وبالتالي ، خروج المرحلة M. علاوة على ذلك ، فإن استئصال بروتينات SAC يتغلب على حالة توقف المرحلة M ، مما يؤكد أهمية SAC في إنشاء الانقسام الاختزالي I chekpoint20.
كما تظهر الأبحاث السابقة بوضوح ، لا يمكن ل DSBs إحداث نقطة تفتيش قوية في بويضات الفئران. إذا ترك هذا الضرر دون إصلاح ، فقد يؤدي إلى أجنة تحمل تشوهات كروموسومية. لذلك ، من المهم دراسة استجابة تلف الحمض النووي في مراحل مختلفة من تكوين الأمشاج الأنثوية لفهم المسارات الفريدة التي تستخدمها البويضات للتعامل مع الإهانات الجينية المحتملة بشكل أفضل.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، اكتشفنا DSBs في بويضات الثدييات. تسمح هذه الطريقة باكتشاف ودراسة عملية إصلاح الحمض النووي في البويضات. يمكن أيضا استخدام نفس البروتوكول لتحليل البروتينات الأخرى التي تشارك في العمليات الفسيولوجية في بويضات الثدييات. من المهم دراسة كيفية استجابة البويضات لتلف الحمض النووي المحتمل من أجل فهم سبب ضعف الخصوبة لدى الإناث لدى البشر بشكل أفضل.
يمكن أن تكون دراسة استجابة تلف الحمض النووي في بويضات الثدييات صعبة بسبب حساسية البويضات. تتطلب معالجة البويضات درجات حرارة محددة وتركيزات CO 2 و O2. في الوقت نفسه ، يجب حماية البويضات من الضوء. يجب أن تتم المناولة الكاملة باستخدام ماصات زجاجية غير ضيقة ، لأن هذا قد يكون ضارا للبويضات ، ولكن أيضا ليس بعرض كبير ، لأن هذا قد يتسبب في تخفيف الوسط ، وبالتالي يؤثر سلبا على إجراء التثبيت. في كل خطوة من خطوات التثبيت ، يتم استخدام عدة قطرات من المخازن المؤقتة لتقليل تأثير التخفيف. طريقة بديلة لمراقبة DSBs هي مقايسة المذنب24. على الرغم من أن هذه التقنية أكثر حساسية ، إلا أنها أكثر تعقيدا. في الوقت نفسه ، باستخدام مقايسة المذنب ، لا يمكن اكتشاف منطقة الحمض النووي الدقيقة التي يحدث فيها الضرر ، وفي الخلايا ذات جزيئات الحمض النووي الريبي الوفيرة ، مثل البويضات في مرحلة GV25 ، يمكن زيادة الخلفية ، مما يؤدي إلى إشارة تلف الحمض النووي الخاطئة26.
باستخدام بروتوكول التألق المناعي الموصوف هنا ، يمكننا اكتشاف DSBs بدقة وتقدير تقدم الإصلاح في البويضات في مرحلة GV ، كما يتضح من انخفاض مضان γH2AX بمرور الوقت. ومع ذلك ، فإن أحد قيود هذه الطريقة هو أن بعض الأجسام المضادة قد تقدم توزيعا غير محدد في جميع أنحاء البويضة ، مما يؤدي إلى صور ذات إضاءة خلفية عالية. يتم استخدام المخزن المؤقت PFA-Tx-100 بدلا من PFA المتسلسل و Tx-100 ، حيث لاحظنا أنه يحسن عملية التثبيت من خلال السماح باكتشاف خلفية أقل ومضان غير محدد. القيد الثاني لاستخدام γH2AX للكشف عن DSB هو أنه لا يمكن تقدير الضرر بعد GVBD بسبب الفسفرة التلقائية ل γH2AX في الانقسام الاختزالي23.
في بروتوكول التألق المناعي هذا ، تظل البويضات في مخزن مؤقت سائل ولا يمكن تخزينها داخل الشرائح. هذه الحقيقة تجعل من الصعب الحفاظ على الخلايا الثابتة لعدة أيام بعد إضافة الجسم المضاد الثانوي. من أجل الحصول على صور عالية الجودة وعدم فقدان الإشارة ، يفضل إجراء التصوير في غضون ساعات قليلة بعد إضافة الجسم المضاد الثانوي. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن مسح النوى من خلال المحور Z يمكن أن يجعل الإشارة أضعف بسبب التعرض المفرط. لهذا السبب ، يفضل خفض طاقة الليزر وزيادة سرعة المسح.
أخيرا ، هناك قيد آخر لبروتوكول التألق المناعي وهو أنه يمكن استخدامه فقط للخلايا الثابتة / غير الحية. لذلك ، يمكننا فقط تقدير وجود وغياب العوامل في نقاط زمنية محددة دون معرفة ما إذا كانت هناك أي تقلبات في تركيزها أو تغيرات في سلوكها بمرور الوقت. يمكن التغلب على هذه المشكلة باستخدام تصوير الخلايا الحية والعلامات الفلورية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف بدعم هذا العمل من مشروع “إنشاء بنى تحتية” لبناء القدرات “في البحوث الطبية الحيوية (BIOMED-20)” (MIS 5047236) ، والذي يتم تنفيذه في إطار عمل “تعزيز البنية التحتية للبحث والابتكار” ، بتمويل من البرنامج التشغيلي “القدرة التنافسية وريادة الأعمال والابتكار” (NSRF 2014-2020) ، وبتمويل مشترك من اليونان والاتحاد الأوروبي (الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية).
Materials
| 3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated | APTACA | 1502 | |
| 10 cc syringes | SoftCare | 114.104.21 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab | Biotium | 20012 | |
| Anti-phospho-H2A.X (Ser139) | Merck Millipore | 07-164 | |
| ARE Heating Magnetic Stirrer | VELP Scientifica | F20500162 | |
| BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| BD Microlance 3 Needles 27 G – 0.40 x 13 mm | Becton Dickinson | 300635 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| DMSO Anhydrous | Biotium | 90082 | |
| DRAQ7 DNA dye | BioStatus | DR71000 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| EMSURE MgCl2. 6H2O | Merck Millipore | 1058330250 | |
| Etoposide | CHEMIPHARM | L01CB01 | |
| FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | Corning Science | 532057 | |
| FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style | Corning Science | 353001 | |
| Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147-25G | |
| HERACELL 150i CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 50116048 | |
| IBMX powder | Sigma-Aldrich | I5879-100MG | |
| Leica M125 Stereo Microscope | Leica Microsystems | ||
| M16 Medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| NaN3 | Honeywell | 13412H | |
| NaOH | Merck Millipore | 1064981000 | |
| Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope | Nikon Corporation | ||
| Nikon SMZ800N Stereo Microscope | Nikon Corporation | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm | DURAN WHEATON KIMBLE | 357335 | |
| pH/ORP meter | Hanna Instruments Ltd | HI2211 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| PMSG Protein Lyophilised | Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology) | GWB-2AE30A (now OPPA01037) | |
| QBD4 Dry block heater | Grant Instruments (Cambridge) Ltd | A25218 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Whatman Puradisc 25 mm 0.2 μm filters | GE Healthcare | 6780-2502 |
References
- Wang, X., Pepling, M. E. Regulation of meiotic prophase one in mammalian oocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 667306 (2021).
- Filatov, M., Khramova, Y., Semenova, M. Molecular mechanisms of prophase I meiotic arrest maintenance and meiotic resumption in mammalian oocytes. Reproductive Sciences. 26 (11), 1519-1537 (2019).
- Adhikari, D., et al. Inhibitory phosphorylation of Cdk1 mediates prolonged prophase I arrest in female germ cells and is essential for female reproductive lifespan. Cell Research. 26 (11), 1212-1225 (2016).
- Sun, S. C., Kim, N. H. Molecular mechanisms of asymmetric division in oocytes. Microscopy and Microanalysis. 19 (4), 883-897 (2013).
- Jones, K. T. Mammalian egg activation: From Ca2+ spiking to cell cycle progression. Reproduction. 130 (6), 813-823 (2005).
- Solc, P., Schultz, R. M., Motlik, J. Prophase I arrest and progression to metaphase I in mouse oocytes: comparison of resumption of meiosis and recovery from G2-arrest in somatic cells. Molecular Human Reproduction. 16 (9), 654-664 (2010).
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Research. 22 (2), 219-231 (1989).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 41 (4), 479-485 (1995).
- Sun, X., et al. Comprehensive analysis of nonsurrounded nucleolus and surrounded nucleolus oocytes on chromatin accessibility using ATAC-seq. Molecular Reproduction and Development. 90 (2), 87-97 (2023).
- Zuccotti, M., Bellone, M., Longo, F., Redi, C. A., Garagna, S. Fully-mature antral mouse oocytes are transcriptionally silent but their heterochromatin maintains a transcriptional permissive histone acetylation profile. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (12), 1193-1196 (2011).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Lieber, M. R. The mechanism of human nonhomologous DNA end joining. The Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 1-5 (2008).
- Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757 (2013).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Shibata, A., Jeggo, P. A. Roles for the DNA-PK complex and 53BP1 in protecting ends from resection during DNA double-strand break repair. Journal of Radiation Research. 61 (5), 718-726 (2020).
- Mohiuddin, I. S., Kang, M. H. DNA-PK as an emerging therapeutic target in cancer. Frontiers in Oncology. 9, 635 (2019).
- Marangos, P., Carroll, J. Oocytes progress beyond prophase in the presence of DNA damage. Current Biology. 22 (11), 989-994 (2012).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Bakkenist, C. J., Kastan, M. B. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation. Nature. 421 (6922), 499-506 (2003).
- Marangos, P., et al. DNA damage-induced metaphase I arrest is mediated by the spindle assembly checkpoint and maternal age. Nature Communications. 6, 8706 (2015).
- Lavrentyeva, E. A., Shishova, K. V., Zatsepina, O. V. Differences in nuclear dynamics in mouse GV oocytes with a diverse chromatin configuration. Biology Bulletin Russian Academy of Sciences. 46, 332-341 (2019).
- Montecucco, A., Zanetta, F., Biamonti, G. Molecular mechanisms of etoposide. EXCLI Journal. 14, 95-108 (1998).
- Mayer, A., et al. DNA damage response during mouse oocyte maturation. Cell Cycle. 15 (4), 546-558 (2016).
- Olive, P., Banáth, J. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nature Protocols. 1, 23-29 (2006).
- Wu, D., Dean, J. EXOSC10 sculpts the transcriptome during the growth-to-maturation transition in mouse oocytes. Nucleic Acids Research. 48 (10), 5349-5365 (2020).
- Simon, L., Emery, B., Carrell, D., Agarwal, A., Henkel, R., Majzoub, A. DNA damage: COMET assay. Manual of Sperm Function Testing in Human Assisted Reproduction. , 202-212 (2021).
