Aktinobakteriyofaj enfeksiyonunu karakterize etmek için uyarlanmış optik yoğunluk tabanlı mikroplaka testi

Bu protokol Gordonia terrae için yazılmış olsa da, Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta ve Gordonia westfalica için de başarıyla kullanılmıştır. 1. Bakteri preparatı Bir biyogüvenlik kabininde, Gordonia terrae CAG3’ün tek bir kolonisini, 0.01 mg / mL sikloheksimid içeren 200 mL pepton maya kalsiyum suyu 18 (PYCa) içeren 1 L steril şaşkın bir şişeye aşılamak için iyi mikrobiyolojik uygulama17’yi kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Şişeyi 30 ° C’de, kültür doygunluğa ulaşana kadar veya 3 gün boyunca 250 rpm’de çalkalayarak inkübe edin7. Doymuş G. terrae kültürünü PYCa suyunda seri olarak seyreltin ve PYCa plakaları 19,20 üzerindeki 10−4, 10−5 ve 10−6 seyreltmelerin her biri100 μL yayılmış plaka 19,20. Seyreltilmemiş doymuş kültürü 4 °C’de soğutun. Yayılmış plakaları 30 ° C’de 3 gün boyunca ters çevrilmiş olarak inkübe edin. Kuluçkadan sonra, 20-200 kolonili bir plaka olan “sayılabilir bir plaka” tanımlayın. Bu plakadaki koloni sayısını sayın ve mililitre başına koloni oluşturan birimleri hesaplayın (cfu / mL)19,20. Doymuş kültürü PYCa suyu ile 4.0 x 106 cfu / mL bakteriye seyreltin. 2. Faj hazırlama NOT: Bildirilen temsili sonuçlar, G. terrae üzerinde izole edilen ılıman bir bakteriyofaj olan Gordonia fajı DelRio21 ile elde edilmiştir. Bu yöntemler diğer Gordonia fajlarıyla da başarıyla kullanılmıştır. İzole edilmiş bir bakteriyofajla başlayarak, faj örneğini faj tamponu7’de seri olarak 1 x 10−8 seyreltmeye kadar seyreltin. Doymuş G. terrae kültürünün 0.3 mL’sini her faj seyreltmesinin 10 μL’si ileenfekte ederek çift katmanlı bir agar faj titresi testi 7 gerçekleştirin. 5-10 dakikalık oda sıcaklığında bir inkübasyonun ardından, bakteri-faj karışımını 3 mL PYCa üst agar ile birleştirin ve PYCa agar plakalarına dökün. 30 ° C’de ters çevrilmiş plakaları 3 gün boyunca veya plaklar7 oluşana kadar inkübe edin. Kuluçkadan sonra, 20-200 plakalı bir plaka olan “sayılabilir bir plaka” tanımlayın. Bu plakadaki plak sayısını sayın ve mililitre başına plak oluşturan birimleri hesaplayın (pfu/mL)7. 3. Mikroplaka hazırlama NOT: Bu yöntem için düz tabanlı 96 kuyucuklu mikroplakalar ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılmalıdır. Tüm plaka hazırlama ve yükleme bir biyogüvenlik kabininde tamamlanmalı ve iyi mikrobiyolojik uygulama17kullanılmalıdır. 100 μL Triton-X 100, 40 mL 0 izopropanol ve 160 mL deiyonize su22’yi birleştirerek buğu önleyici kapak kaplama çözeltisini hazırlayın. Karıştırmak için karıştırın ve oda sıcaklığında saklayın. Bir biyogüvenlik kabininde, steril 96 delikli bir mikroplaka kapağının iç yüzeyine 6 mL kapak kaplama çözeltisi ekleyin, kapağı kenarlarından tutun ve çözelti tarafından kaplandığından emin olmak için döndürün. Çözeltinin kapağın üzerine 20 saniye boyunca oturmasına izin verin, ardından çözeltiyi dökün ve kapağı otoklavlanmış bir kağıt havlu üzerinde, kapak tamamen kuruyana kadar bir açıyla ters çevirin, bu da tipik olarak 35-45 dakika sürer. Kapağı kenarlarından tutmaya dikkat edin. Her 96 delikli mikroplaka için suda 20 mL% 0.1 agaroz hazırlayın, agarozu eritmek için mikrodalga fırınlayın. Agaroz 50-60 ° C’ye soğuduktan sonra, plakanın kuyucukları ile 200 μL agaroz arasındaki tüm boşluklara %0,1 agarozun 100 μL’sini A sırası ve H satırı ve sütun 1, sütun 2, sütun 11 ve sütun 1223’teki kuyucuklara pipet edin (Şekil 1). 4. Plakanın bakteri ve fajla yüklenmesi NOT: Tüm plaka hazırlama ve yükleme işlemleri bir biyogüvenlik kabininde tamamlanmalı ve iyi mikrobiyolojik uygulama17 kullanılmalıdır. 96 delikli plaka, her bir kuyucuk9’da 75 μL 2.0 x 106 cfu / mL bakteri içerecektir. 4.0 x 10 6 cfu/mL bakteri kültürü 1:1’i 2x PYCa suyu ile 2.0 x 106 cfu/mL’ye seyreltin. 96 delikli plaka başına 5 mL hazırlayın. Her biri 2.0 x 106 pfu / mL, 2.0 x 105 pfu / mL ve 2.0 x 104 pfu / mL konsantrasyonlarında 1 mL yapmak için faj tamponu7 kullanarak faj lizatını seyreltin. Bu, mikroplaka9 içinde 1, 0.1 ve 0.01’lik bir enfeksiyon çokluğuna (MOI) izin verecektir. Mikroplakayı yüklemek için, buğu önleyici çözelti ve agaroz ile hazırlanmış bir plaka alın ve Şekil 1’i takip eden 2.0 x 106 cfu / mL bakterilerinin 75 μL’sini 3-10 numaralı sütunlara pipetin. Sütun 3 ve sütun 4’e, Şekil 1’i izleyerek fajsız pozitif kontrol görevi görmesi için her bir kuyucuğa 75 μL steril faj tamponu ekleyin ve her eklemeden sonra karıştırmak için pipeti yukarı ve aşağı doğru çekin. Sütun 5 ve sütun 6’ya 2,0 x 106 pfu/mL fajın 75 μL’sini, sütun 7 ve sütun 8’e 2,0 x 105 pfu/mL fajın 75 μL’sini ve sütun 9 ve sütun 10’a 2,0 x 104 pfu /mL fajın 75 μL’sini ekleyin ve her eklemeden sonra karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Gaz değişimine izin verirken plakayı kısmen kapatmak için plakanın her iki kısa tarafını etiketleme bandında 0,5 ile bantlayın. 5. Kuluçka ve absorbans ölçümü Plakalar bakteri ve fajla yüklendikten sonra, bunları 250 rpm’de bir mikroplaka çalkalayıcıya yerleştirin ve 30 ° C’de inkübe edin. Plakaları 96 saat boyunca inkübe edin, saat 16’dan başlayarak her 8 saatte bir mikroplaka okuyucuda 600 nm’de optik yoğunluk ölçümü yapın. Plakaları ölçümler arasında çalkalayıcıya geri döndürün.NOT: Saat 0’dan başlayarak 4, h 6 saat, 8 saat ve 12 saatlik ölçüm periyotları değerlendirilmiş ve enfeksiyon sonrası 16 saatte başlayan 8 saatlik bir örnekleme periyodunun Gordonia-faj etkileşimlerini en iyi şekilde yakaladığı belirlenmiştir. Deney boyunca kapağı yoğuşma açısından izleyin. Yoğuşma gözlenirse, kapağı adım 3.2’ye göre kaplanmış başka bir kapakla değiştirin. Protokol bölüm 6’yı izleyerek kontrol ve enfekte büyüme eğrileri oluşturun. 6. Veri analizi Stacy-Ceballos-Index GitHub deposundaki (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index) elektronik tablo düzenini izleyerek her faj seyreltmesinin ortalama ve standart sapmasını hesaplamak için bir elektronik tablo programı kullanın. DescTools24, dplyr 25, ggplot2 26 ve readxl27 paketleriyle ve Stacy-Ceballos-Index GitHub deposundaki (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index) R betiğini izleyerek kontrol ve virüslü büyüme eğrileri oluşturun ve R kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın) enfeksiyon ölçümlerini hesaplayın.AUCcon , enfekte olmamış kontrol eğrisinin altındaki alandır, AUCinf ise enfekte eğri16’nın altındaki alandır. AUC’yi hesaplayın ve ardından aşağıdaki denklemi kullanarak PIAUC16 eğri değerleri altındaki alana göre yüzde büyüme inhibisyonunu hesaplayın:(1 – [AUCinf/AUCcon]) × 100 Her eğrideki kesikli yatay çizgiler, enfekte olmayan büyüme zirvesi Nasimptote (con ) ve enfekte büyüme zirvesi Nasimptote (inf ) etiketli olarak tepe büyümesini gösterir. Nasimptot değerlerini tanımlayın ve ardından aşağıdaki denklemi kullanarak bu tepe büyüme değerlerine (PImax16) dayanarak yüzde büyüme inhibisyonunu hesaplayın:(1 – [N asimptote(inf)/ Nasimptote(con)]) × 100 PIAUC ve PImax değerlerinden Stacy-Ceballos endeksi ISC16’yı aşağıdaki gibi hesaplayın:(PIAUC × PImaks.) 0.5Stacy-Ceballos endeksini zaman içinde entegre ederek göreceli virülansı hesaplayın16.