Un ensayo de microplacas basado en densidad óptica adaptado para caracterizar la infección por actinobacteriófagos

Si bien este protocolo está escrito para Gordonia terrae, también se ha utilizado con éxito para Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta y Gordonia westfalica. 1. Preparación de bacterias En un gabinete de bioseguridad, utilice una buena práctica microbiológica17 para inocular una sola colonia de Gordonia terrae CAG3 en un matraz deflector estéril de 1 L con 200 ml de caldo cálcico de levadura peptona18 (PYCa) que contiene 0,01 mg/ml de cicloheximida (ver la Tabla de materiales). Incubar el matraz a 30 °C agitando a 250 rpm hasta que el cultivo esté saturado o durante 3 días7. Diluir en serie el cultivo saturado de G. terrae en caldo PYCa y extender en placa 100 μL cada una de las diluciones 10−4, 10−5 y 10−6 en placas PYCa19,20. Refrigerar el cultivo saturado sin diluir a 4 °C. Incubar las placas extendidas invertidas durante 3 días a 30 °C. Después de la incubación, identifique una “placa contable”, una placa con 20-200 colonias. Cuente el número de colonias en esa placa y calcule las unidades formadoras de colonias por mililitro (ufc/ml)19,20. Diluir el cultivo saturado con caldo PYCa a 4.0 x 106 ufc/ml bacterias. 2. Preparación de fagos NOTA: Los resultados representativos reportados se obtuvieron con el fago de Gordonia DelRio21, un bacteriófago templado aislado en G. terrae. Estos métodos también se han utilizado con éxito con otros fagos de Gordonia . Comenzando con un bacteriófago aislado, diluir en serie la muestra de fagos en tampón de fagos 7 a una diluciónde 1 x 10−8 . Realizar un ensayo de título de fagos de agar de doble capa7 infectando 0,3 ml del cultivo saturado de G. terrae con 10 μL de cada dilución de fagos. Después de una incubación a temperatura ambiente de 5-10 minutos, combine la mezcla de bacterias y fagos con 3 ml de agar superior PYCa y vierta en placas de agar PYCa. Incubar las placas invertidas a 30 °C durante 3 días o hasta que se formenplacas 7. Después de la incubación, identifique una “placa contable”, una placa con 20-200 placas. Cuente el número de placas en esa placa y calcule las unidades formadoras de placa por mililitro (ufp/ml)7. 3. Preparación de microplacas NOTA: Para este método se deben utilizar microplacas de fondo plano de 96 pocillos (consulte la Tabla de materiales). Toda la preparación y carga de la placa debe completarse en un gabinete de bioseguridad, y se deben utilizar buenas prácticas microbiológicas17. Prepare la solución de recubrimiento de la tapa antivaho combinando 100 μL de Triton-X 100, 40 mL de isopropanol al 100% y 160 ml de agua desionizada22. Revuelva para mezclar y guárdelo a temperatura ambiente. En un gabinete de bioseguridad, agregue 6 ml de solución de recubrimiento de tapa a la superficie interior de una tapa estéril de microplaca de 96 pocillos, sosteniendo la tapa por los bordes y girándola para asegurarse de que esté cubierta por la solución. Deje que la solución repose en la tapa durante 20 s, luego vierta la solución e invierta la tapa en una toalla de papel esterilizada en autoclave en ángulo hasta que la tapa esté completamente seca, lo que generalmente toma 35-45 minutos. Tenga cuidado de sostener la tapa por los bordes. Prepare 20 ml de agarosa al 0,1% en agua para cada microplaca de 96 pocillos, en el microondas para derretir la agarosa. Una vez que la agarosa se haya enfriado a 50-60 °C, pipetear 100 μL de agarosa al 0,1% en todos los espacios entre los pocillos de la placa y 200 μL de agarosa en los pocillos de la fila A y la fila H y la columna 1, columna 2, columna 11 y columna 1223 (figura 1). 4. Cargar la placa con bacterias y fagos NOTA: Toda la preparación y carga de la placa debe completarse en un gabinete de bioseguridad, y se deben usar buenas prácticas microbiológicas17 . La placa de 96 pocillos contendrá 75 μL de 2.0 x 106 ufc/ml de bacterias en cada pocillo9. Diluir el cultivo bacteriano 4.0 x 10 6 ufc/ml 1:1 con 2x caldo PYCa a 2.0 x 106 ufc/ml. Prepare 5 ml por placa de 96 pocillos. Diluir el lisado de fagos usando el tampón de fagos7 para hacer 1 ml de concentraciones de 2.0 x 106 ufp/ml, 2.0 x 105 ufc/ml y 2.0 x 104 ufc/ml. Esto permitirá una multiplicidad de infección (MOI) de 1, 0.1 y 0.01 dentro de la microplaca9. Para cargar la microplaca, tome una placa preparada con solución antivaho y agarosa, y pipete 75 μL de las bacterias 2.0 x 106 ufc/ml en las columnas 3-10, siguiendo la Figura 1. A la columna 3 y a la columna 4, añadir 75 μL de tampón fágico estéril a cada pocillo para que sirva como control positivo sin fagos, siguiendo la figura 1, y pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar después de cada adición. Añadir 75 μL del fago 2,0 x 10 6 ufp/ml a la columna 5 y a la columna6 , 75 μL del fago 2,0 x 105 ufc/ml a la columna 7 y a la columna 8, y 75 μL del fago 2,0 x 104 ufc/ml a la columna 9 y a la columna 10, pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mezclar después de cada adición. Pegue con cinta adhesiva ambos lados cortos de la placa con cinta de etiquetado de 0.5 pulgadas para sellar parcialmente la placa y permitir el intercambio de gases. 5. Incubación y medición de absorbancia Una vez que las placas estén cargadas de bacterias y fagos, colóquelas en un agitador de microplacas a 250 rpm e incube a 30 °C. Incubar las placas durante 96 h, tomando una medición de densidad óptica a 600 nm en un lector de microplacas cada 8 h a partir de la hora 16. Devuelva las placas al agitador entre mediciones.NOTA: Se evaluaron los períodos de medición de 4, h 6 h, 8 h y 12 h, comenzando en la hora 0, y se determinó que un período de muestreo de 8 h que comenzó a las 16 h después de la infección capturó mejor las interacciones Gordonia-fagos. Controle la tapa para detectar condensación durante todo el experimento. Si se observa condensación, sustituir la tapa por otra tapa recubierta según el paso 3.2. Generar curvas de crecimiento de control e infección siguiendo la sección 6 del protocolo. 6. Análisis de datos Utilice un programa de hoja de cálculo para calcular la desviación promedio y estándar para cada dilución de fagos, siguiendo el diseño de hoja de cálculo en el repositorio de GitHub Stacy-Ceballos-Index (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index). Cree curvas de control y crecimiento infectadas, y calcule métricas de infección usando R (consulte la Tabla de materiales) con los paquetes DescTools 24, dplyr 25, ggplot226 y readxl 27 y siguiendo el script R en el repositorio de GitHub Stacy-Ceballos-Index (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).AUCcon es el área bajo la curva de control no infectada, mientras que AUCinf es el área bajo la curva infectada16. Calcule el AUC y, a continuación, calcule el porcentaje de inhibición del crecimiento en función del área bajo los valores de la curva, PIAUC16, utilizando la siguiente ecuación:(1 – [AUCinf/AUCcon]) × 100 Las líneas horizontales discontinuas en cada curva muestran el crecimiento máximo, con el pico de crecimiento no infectado etiquetado como N asíntota(con) y el pico de crecimiento infectado etiquetado como Nasíntota(inf). Identifique los valores deasíntota N y luego calcule el porcentaje de inhibición del crecimiento en función de estos valores de crecimiento máximo, PImax16, utilizando la siguiente ecuación:(1 – [N asíntota(inf)/ Nasíntota(con)]) × 100 Calcule el índice de Stacy-Ceballos, ISC16, a partir de los valoresPI AUC y PImax , de la siguiente manera:(PI AUC × PImax) 0.5 EspañolCalcular la virulencia relativa integrando el índice de Stacy-Ceballos a lo largo del tiempo16.