アクチノバクテリオファージ感染の特性評価に適応した光学密度ベースのマイクロプレートアッセイ(英語)

このプロトコルはGordonia terrae用に書かれていますが、Gordonia lacunae、Gordonia rubripertincta、および Gordonia westfalicaにも使用されています。 1.細菌の準備 バイオセーフティキャビネットでは、優れた微生物学的慣行17 を使用して、 Gordonia terrae CAG3の単一コロニーを、0.01 mg / mLのシクロヘキシミドを含む200 mLのペプトン酵母カルシウムブロス18(PYCa)を含む1 Lの滅菌バッフルフラスコに接種します( 材料の表を参照)。 フラスコを30°Cでインキュベートし、培養液が飽和するまで250rpmで振とうするか、または7日間インキュベートします。 飽和G. terrae培養物をPYCaブロスで段階的に希釈し、PYCaプレート19,20上で10−4、10−5、および10−6希釈液のそれぞれ100μLをプレートに広げます。原液飽和培養液を4°Cで冷蔵する。 スプレッドプレートを倒立させて30°Cで3日間インキュベートします。 インキュベーション後、20〜200個のコロニーを有するプレートである「計数可能なプレート」を同定する。そのプレート上のコロニーの数を数え、ミリリットルあたりのコロニー形成単位(cfu / mL)19,20を計算します。 飽和培養物をPYCaブロスで4.0 x 106 cfu / mL細菌に希釈します。 2.ファージの調製 注:報告された代表的な結果は、G. terraeで単離された温帯バクテリオファージであるゴルドニアファージDelRio21で得られたものです。これらの方法は、他のゴルドニアファージでも成功裏に使用されています。 単離されたバクテリオファージから始めて、ファージバッファー7 でファージサンプルを1 x 10-8 希釈まで段階的に希釈します。2層寒天ファージ力価アッセイ7 を、0.3 mLの飽和 G.テラエ 培養物を10 μLの各ファージ希釈液で感染させて実施する。5〜10分間の室温インキュベーションの後、細菌とファージの混合物を3 mLのPYCaトップ寒天培地と混合し、PYCa寒天プレートに注ぎます。 プレートを倒立させて30°Cで3日間、またはプラークが7になるまでインキュベートします。 インキュベーション後、20〜200個のプラークを有するプレートである「カウント可能なプレート」を特定する。そのプレート上のプラークの数を数え、ミリリットルあたりのプラーク形成単位(pfu / mL)7を計算します。 3. マイクロプレート作製 注:この方法には、平底の96ウェルマイクロプレート( 材料表を参照)を使用する必要があります。すべてのプレートの準備とローディングはバイオセーフティキャビネットで完了する必要があり、優れた微生物学的慣行17を使用する必要があります。 100 μLのTriton-X 100、40 mLの100%イソプロパノール、および160 mLの脱イオン水を組み合わせて、防曇蓋コーティング溶液を調製します22。攪拌して混合し、室温で保存します。 バイオセーフティキャビネットで、滅菌済みの96ウェルマイクロプレート蓋の内面に6 mLの蓋コーティング溶液を加え、蓋の端を持って回転させ、溶液で覆われていることを確認します。溶液を蓋の上に20秒間置いてから、溶液を注ぎ、蓋が完全に乾くまで、オートクレーブ処理したペーパータオルの蓋を斜めにひっくり返します(通常は35〜45分かかります)。蓋の端を持ってください。 各96穴マイクロプレートに対して水中の0.1%アガロース20 mLを準備し、電子レンジでアガロースを融解します。 アガロースが50〜60°Cに冷却されたら、プレートのウェル間のすべてのスペースに0.1%アガロース100 μLをピペットで入れ、列Aと列Hと列1、列2、列11、および列12のウェルに200 μLをピペットで入れます(図1)。 4.プレートにバクテリアとファージを入れる 注:すべてのプレートの準備とローディングはバイオセーフティキャビネットで完了する必要があり、優れた微生物学的慣行17 を使用する必要があります。 96ウェルプレートには、各ウェル9に75 μLの2.0 x 106 cfu / mL細菌が含まれます。4.0 x 10 6 cfu / mL細菌培養物を2x PYCaブロスで1:1に希釈し、2.0 x 106 cfu / mLにします。96ウェルプレートあたり5 mLを調製します。 ファージバッファー7 を使用してファージライセートを希釈し、2.0 x 106 pfu/mL、2.0 x 105 pfu/mL、および2.0 x 104 pfu/mLの濃度をそれぞれ1 mLにします。これにより、マイクロプレート9内で1、0.1、および0.01の感染多重度(MOI)が可能になります。 マイクロプレートをロードするには、防曇液とアガロースで調製したプレートを取り、2.0 x 106 cfu/mL細菌75 μLをカラム3-10にピペットで移します( 下記図1)。 カラム3およびカラム4に、図 1以下のノーファージポジティブコントロールとして機能する75 μLの滅菌ファージバッファーを各ウェルに加え、各添加後に上下にピペットで混合します。75 μL の 2.0 x 10 6 pfu/mL ファージをカラム 5 およびカラム6 に、75 μL の 2.0 x 105 pfu/mL ファージをカラム 7 およびカラム 8 に、75 μL の 2.0 x 104 pfu/mL ファージをカラム 9 およびカラム 10 に添加し、各添加後に上下にピペッティングして混合します。 プレートの両側を0.5のラベリングテープでテープで固定し、ガス交換を可能にしながらプレートを部分的にシールします。 5.インキュベーションと吸光度測定 プレートにバクテリアとファージが入ったら、マイクロプレートシェーカーに250 rpmで置き、30°Cでインキュベートします。 プレートを96時間インキュベートし、16時間目から8時間ごとにマイクロプレートリーダーで600 nmで光学密度を測定します。測定の合間にプレートをシェーカーに戻します。注:0時間目から4、h 6時間、8時間、および12時間の測定期間が評価され、感染後16時間から始まる8時間のサンプリング期間が ゴルドニアとファージの相互作用を最もよく捉えていると判断されました。. 実験中は蓋の結露を監視します。結露が見られる場合は、手順3.2に従ってコーティングされた別の蓋と蓋を交換します。 プロトコルセクション6に従って、コントロールおよび感染した成長曲線を生成します。 6.データ分析 スプレッドシートプログラムを使用して、Stacy-Ceballos-Index GitHubリポジトリ(https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index)のスプレッドシートレイアウトに従って、各ファージ希釈の平均および標準偏差を計算します。 コントロールと感染の成長曲線を作成し、DescTools 24、dplyr 25、ggplot226、および readxl27 パッケージを使用して R (材料表を参照) を使用し、Stacy-Ceballos-Index GitHub リポジトリ (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index) の R スクリプトに従って感染メトリックを計算します。AUCcon は非感染管理曲線下の領域であり、AUCinf は感染曲線16の下の領域です。AUC を計算し、次の式を使用して、曲線下面積の値 PIAUC16 に基づいて成長阻害率を計算します。(1 – [AUCinf/AUCcon]) × 100 各曲線の破線の水平線はピーク成長を示し、感染していない成長ピークはN漸近線(con )とラベル付けされ、感染した成長ピークはN漸近線(inf )とラベル付けされています。N漸近 値を特定し、次の式を使用して、これらのピーク成長値(PImax16)に基づいて成長阻害率を計算します。(1 – [N 漸近線(inf)/ N漸近線(con)]) × 100 ステイシー・セバージョス指数ISC16を、PIAUC とPIの最大値 から次のように計算します。(PIAUC × PI最大)≦0.5時間の経過に伴うステイシー-セバージョス指数を積分することにより、相対病原性を計算します16。