בדיקת מיקרו-צלחות מותאמת מבוססת צפיפות אופטית לאפיון זיהום אקטינובקטריופאג'

בעוד פרוטוקול זה נכתב עבור Gordonia terrae, הוא שימש בהצלחה גם עבור Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta, ו Gordonia westfalica. 1. הכנת חיידקים בארון בטיחות ביולוגית, השתמש בתרגול מיקרוביולוגי טוב17 כדי לחסן מושבה אחת של Gordonia terrae CAG3 לתוך בקבוק 1 ליטר סטרילי מבולבל עם 200 מ”ל של שמרי פפטון מרק סידן18 (PYCa) המכיל 0.01 מ”ג / מ”ל cycloheximide (ראה טבלת חומרים). לדגור את הבקבוק ב 30 ° C עם רעד ב 250 סל”ד עד התרבות רוויה או במשך 3 ימים7. יש לדלל באופן סדרתי את תרבית G. terrae הרוויה בציר PYCa, ולמרוח 100 μL כל אחד מהדילולים 10-4, 10-5 ו-10-6 על לוחות PYCa 19,20. מקררים את התרבית הרוויה הלא מדוללת ב-4 מעלות צלזיוס. לדגור את לוחות התפשטות הפוך במשך 3 ימים ב 30 ° C. לאחר הדגירה מזהים “צלחת ניתנת לספירה”, צלחת עם 20-200 מושבות. ספרו את מספר המושבות על לוח זה, וחשבו את היחידות יוצרות המושבה למיליליטר (cfu/mL)19,20. לדלל את התרבית הרוויה עם ציר PYCa ל 4.0 x 106 cfu/mL חיידקים. 2. הכנת פאגים הערה: התוצאות המייצגות שדווחו התקבלו עם פאג גורדוניה דלריו21, בקטריופאג’ ממוזג שבודד על G. terrae. שיטות אלה שימשו בהצלחה גם עם פאגים אחרים של גורדוניה . החל מבקטריופאג’ מבודד, מדללים סדרתית את דגימת הפאגים בחיץפאגים 7 לדילול של 1 x 10-8 . בצע בדיקת אגר פאג titer7 דו-שכבתית על ידי הדבקת 0.3 מ”ל של תרבית G. terrae רווי עם 10 μL של כל דילול פאגים. לאחר דגירה של 5-10 דקות בטמפרטורת החדר, ערבבו את תערובת החיידקים-פאגים עם 3 מ”ל של אגר עליון PYCa, ושפכו על צלחות אגר PYCa. לדגור את הלוחות הפוך ב 30 ° C במשך 3 ימים או עד פלאקים טופס7. לאחר הדגירה, זהה “צלחת ספירה”, צלחת עם 20-200 לוחות. ספור את מספר הלוחות על לוח זה, וחשב יחידות יוצרות פלאק למיליליטר (pfu/mL)7. 3. הכנת Microplate הערה: יש להשתמש במיקרו-צלחות בעלות תחתית שטוחה של 96 בארות (ראה טבלת חומרים) עבור שיטה זו. יש להשלים את כל הכנת הצלחת והטענתה בארון בטיחות ביולוגית, ויש להשתמש בתרגול מיקרוביולוגי טוב17. הכן את תמיסת ציפוי מכסה נגד ערפל על ידי שילוב של 100 μL של Triton-X 100, 40 מ”ל של 100% איזופרופנול, ו 160 מ”ל של מים deionized22. מערבבים לערבוב ומאחסנים בטמפרטורת החדר. בארון בטיחות ביולוגית, הוסף 6 מ”ל של תמיסת ציפוי מכסה למשטח הפנימי של מכסה מיקרו-צלחת סטרילי בעל 96 בארות, החזק את המכסה בקצוות וסובב אותו כדי להבטיח שהוא מכוסה בתמיסה. תנו לתמיסה לשבת על המכסה למשך 20 שניות, ואז שפכו את התמיסה והפכו את המכסה על מגבת נייר בזווית עד שהמכסה יבש לחלוטין, מה שבדרך כלל לוקח 35-45 דקות. יש להקפיד להחזיק את המכסה בקצוות. הכינו 20 מ”ל של 0.1% אגרוז במים עבור כל מיקרו-צלחת 96 בארות, במיקרו כדי להמיס את האגרוז. לאחר שהאגרוז התקרר לטמפרטורה של 50-60 מעלות צלזיוס, צינור 100 מיקרוליטר של 0.1% האגרוז לתוך כל החללים שבין בארות הצלחת ו-200 מיקרוליטר של אגרוז לתוך הבארות בשורה A ובשורה H ועמודה 1, עמודה 2, עמודה 11 ועמודה 1223 (איור 1). 4. העמסת הצלחת בחיידקים ופאגים הערה: יש להשלים את כל הכנת הצלחת והטענתה בארון בטיחות ביולוגית, ויש להשתמש בתרגול מיקרוביולוגי טוב17 . צלחת 96 בארות תכיל 75 μL של 2.0 x 106 cfu/mL חיידקים בכל באר9. לדלל את 4.0 x 106 cfu/mL תרבית חיידקים 1: 1 עם 2x ציר PYCa ל 2.0 x 106 cfu/mL. מכינים 5 מ”ל לכל צלחת 96 באר. דללו את הפאג’ ליזט באמצעות חיץ פאגים7 כדי ליצור 1 מ”ל כל אחד בריכוזים של 2.0 x 106 pfu/mL, 2.0 x 105 pfu/mL ו-2.0 x 104 pfu/mL. זה יאפשר ריבוי של זיהום (MOI) של 1, 0.1, ו 0.01 בתוך microplate9. כדי להעמיס את צלחת המיקרו, קחו צלחת שהוכנה עם תמיסת אנטי-ערפל ואגרוז, ופיפט 75 μL של חיידקי 2.0 x 106 cfu/mL לעמודות 3-10, בעקבות איור 1. לעמודה 3 ולעמודה 4, הוסיפו 75 מיקרוליטר של חיץ פאגים סטרילי לכל באר כדי לשמש כבקרה חיובית ללא פאגים, בעקבות איור 1, ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב אחרי כל תוספת. הוסף 75 μL של הפאג 2.0 x 10 6 pfu/mL לעמודה 5 ולעמודה6 , 75 μL של הפאג 2.0 x 105 pfu/mL לעמודה 7 ולעמודה 8, ו- 75 μL של הפאג 2.0 x 104 pfu/mL לעמודה 9 ולעמודה 10, תוך פיטום למעלה ולמטה כדי לערבב לאחר כל תוספת. הדביקו את שני הצדדים הקצרים של הצלחת עם 0.5 בסרט תיוג כדי לאטום חלקית את הצלחת תוך מתן אפשרות להחלפת גזים. 5. מדידת דגירה וספיגה ברגע שהצלחות עמוסות בחיידקים ופאגים, הניחו אותן על שייקר מיקרו-צלחות ב-250 סל”ד, ודגרו ב-30°C. דגרו על הלוחות במשך 96 שעות, ובצעו מדידת צפיפות אופטית של 600 ננומטר בקורא מיקרו-צלחות כל 8 שעות החל משעה 16. מחזירים את הצלחות לשייקר בין המדידות.הערה: תקופות מדידה של 4, h 6 h, 8 h ו-12 h הוערכו, החל משעה 0, ונקבע כי תקופת דגימה של 8 שעות המתחילה ב-16 שעות לאחר ההדבקה לכדה בצורה הטובה ביותר את אינטראקציות גורדוניה-פאג’. נטרו את המכסה לעיבוי במהלך הניסוי. אם נצפה עיבוי, החליפו את המכסה במכסה אחר מצופה לפי שלב 3.2. יצירת בקרה ועקומות גדילה נגועות בהתאם לפרוטוקול סעיף 6. 6. ניתוח נתונים השתמש בתוכנית גיליון אלקטרוני כדי לחשב את הממוצע ואת סטיית התקן עבור כל דילול פאגים, בהתאם לפריסת הגיליון האלקטרוני במאגר GitHub של Stacy-Ceballos-Index (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index). צור עקומות בקרה וגדילה נגועות, וחשב מדדי זיהום באמצעות R (ראה טבלת חומרים) עם חבילות DescTools24, dplyr 25, ggplot226 ו- readxl27 ועקוב אחר סקריפט R במאגר GitHub של Stacy-Ceballos-Index (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).AUC con הוא האזור מתחת לעקומת הבקרה הלא נגועה, בעוד AUCinf הוא האזור מתחת לעקומה הנגועה16. חשב את AUC ולאחר מכן חשב עיכוב צמיחה באחוזים בהתבסס על האזור מתחת לערכי העקומה, PIAUC16, באמצעות המשוואה הבאה:(1 – [AUCinf/AUCcon]) × 100 הקווים האופקיים המקווקווים בכל עקומה מראים את שיא הצמיחה, כאשר שיא הצמיחה הלא נגוע מסומן N asymptote(con) ושיא הצמיחה הנגוע מסומן Nasymptote(inf). זהה את ערכיN אסימפטוטה ולאחר מכן חשב עיכוב גדילה באחוזים בהתבסס על ערכי שיא גדילה אלה, PImax16, באמצעות המשוואה הבאה:(1 – [N asymptote(inf)/ Nasymptote(con)]) × 100 חשב את מדד Stacy-Ceballos, ISC16, מתוך ערכי PIAUC ו- PI max , כדלקמן:(PIAUC × PImax) 0.5חישוב אלימות יחסית על ידי שילוב מדד Stacy-Ceballos לאורך זמן16.