網膜変性マウスモデルにおける網膜下移植片の経瞳孔ガイド下経強膜移植

すべての動物実験は、National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(NIH Publications No. 8023、1978年改訂)およびARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Researchに従って実施されました。すべての手順は、ジョンズ・ホプキンス大学の動物管理および使用委員会(承認M021M459)によって承認されました。 1.動物 網膜細胞懸濁液のドナーとして Rho::EGFP マウス(P3-P6齢)を使用します。注:この株は、ベイラー医科大学のT.ウェンセル博士からの親切な贈り物でした。 OPN1LW-EGFP/NRL-/-マウス14(P3歳)を網膜シートのドナーとして使用します。 免疫不全の成体網膜変性 Rd1/NS マウス(雌雄問わず)をレシピエントとする。 すべてのマウスを12:12時間の明暗サイクルでケージに入れ、必要に応じて水と餌を与えます。 2. 神経網膜の採取(図1) 注:以下のすべてのステップは、無菌条件下で実行されました。研究ツールと製品のサプライヤー情報は、 材料表に記載されています。 ドナーマウスの準備:二酸化炭素の過剰摂取でドナーマウスを安楽死させ、子宮頸部脱臼を伴う安楽死を確認します。 マウスの眼球を分離します。これを行うには、以下の手順に従います。子犬のまぶたをマイクロハサミで慎重に開き、眼球を露出させます。 滑らかな鉗子を使用して視神経をつかみ、一対の鉗子で眼球を引き出します。 神経網膜の分離注:このステップは解剖顕微鏡の下で行われます。25Gの滅菌針を使用して角膜の中心に穴を切開します。 角膜を穴から半分に切り、切開部を強膜とRPEまで拡大し、強膜とRPEを取り除きます。 微小歯鉗子を使用して水晶体を優しく除去し、硝子体を取り除き、神経網膜を分離します。 必要に応じて、セクション3に進んでドナー網膜懸濁液を準備するか、セクション4に進んでドナー網膜シートを準備します。 3.ドナー網膜懸濁液を準備します (図1) 細胞凝集が検出されなくなるまで、パパイン溶液中で37°Cで20〜30分間神経網膜をインキュベートします。注:細胞混合物を10分ごとに15回静かにピペットで固定します。 パパイン解離キットの製造元の指示に従って、単一細胞を採取します。 4.ドナー網膜シートを準備します(図1) 注:このステップはセクション2に従い、解剖顕微鏡下で実行されます。 単離された神経網膜カップを、予冷滅菌PBSを入れた35mmペトリ皿に入れます。 マイクロハサミを使用して、神経網膜カップを複数の網膜シート(約1 mm x 2 mm)に切断します。 5. レシピエントマウスを準備する ケタミン(100 mg / kg体重)と塩酸キシラジン(20 mg / kg体重)の腹腔内注射でレシピエントマウスに麻酔をかけます。. まばたきや痛みの反射、規則的な呼吸、呼吸の喪失を確認することにより、麻酔の手術面を確認します。 テールピンチまたはペダル反射の撤退に対する反応の欠如によって麻酔薬の深さを評価します。 手術中は必ず麻酔の深さを再確認し、動物が痛みに反応する場合は麻酔の深さを調整してください。低体温症を防ぐために、マウスを事前に温めた手術台に置いてください。 手術の5分前に1%(wt / vol)トロピカミド点眼薬でレシピエントの瞳孔を拡張します。瞳孔が十分に拡張すると、手術顕微鏡下での経瞳孔の可視化が容易になります。 手術中のマウスの眼と周囲の眼組織をポビドンヨードで消毒し、滅菌したPBSで洗浄します。 鎮痛のためのマウスの目に0.5%のProparacaineの塩酸塩を加えて下さい。 6. 網膜移植片の網膜下移植(図2) 注:以下のすべてのステップは、無菌条件下で実行しました。手術器具はオートクレーブ滅菌しました(器具トレイを使用して工具先端を保護し、プランジャーをマイクロシリンジから取り出して、内腔に詰まるのを防ぎます)。研究ツールと製品のサプライヤー情報は、 材料表に記載されています。 前房穿刺:インスリン針で末梢角膜を前房に浸透させ、房水が受動的に排出できるようにして、移植中の眼圧(IOP)スパイクを防ぎます。注:穿刺の成功は、角膜の穴からの房水の流出によって示されます。 ヒアルロン酸ナトリウムを一滴垂らし、ガラスカバーガラス(直径5mm)を角膜の上に置き、手術スコープの下で眼底を経瞳孔状に可視化します。 歯付き鉗子を使用して、実験で必要に応じて上眼壁または下眼壁のいずれかを経瞳孔視の中心に向かって押すことにより、注射軌跡(角膜後1mm)を露出させます。 マイクロインジェクション針を使用して、強膜を垂直に貫通します。 針の方向を慎重に接線方向に回転させて、強膜-脈絡膜-RPE複合体を網膜下腔に完全に浸透させます。. 針を接線方向に挿入して、末端の注射軌跡にアクセスします。注意: 経瞳孔視力ガイダンスにより、針の斜角の完全な位置を確認します。表在性網膜血管を解剖学的基準として使用して、網膜下腔内で正確な針の位置決めを行います。 網膜移植片を注入する注:シリンジにプリロードされた小さな気泡の存在は、ドナー細胞の正確な網膜下位置の検証を容易にすることができます。網膜下注射による眼圧の上昇は、ドナー細胞逆流のリスクを高めます。角膜が曇った場合24,25、高IOPの指標、角膜がきれいになるまで少なくとも3分間針を網膜下腔に保持します。注意: まれに、IOPが正常化するのに時間がかかる場合があり、8〜10分かかる場合でも、角膜の透明度が回復するまで針を所定の位置に置いておくことをお勧めします。網膜構造の損傷を防ぐために、手術用顕微鏡で観察します。 微小歯鉗子で注射穴の端をつかみ、針をすばやく引き抜きます。注:網膜細胞懸濁液とシートの網膜下送達を成功させるための基準は、それぞれ網膜下腔に一定のブレブと目に見える白いシートです。 眼の手術部位を人工涙液で洗浄し、必要に応じて軟膏を塗布します。 術後投与移植したマウスをあらかじめ温めた(37°C)清潔な回収ケージに入れ、苦痛がないか注意深く観察する。 苦痛が起これば外科眼の項目0.5%のProparacaineの塩酸塩の低下を2-3回加えて下さい。 マウスが完全に警戒し、動き回った後、マウスをハウスケージに戻します。マウスがフードホッパーに到達するのに問題がある場合は、少数のフードペレットとゲルカップをケージに入れます。注意: 白内障の形成を防ぐために、麻酔が切れるまで目の表面を湿らせてください。 7.マルチモーダル共焦点走査型レーザー検眼鏡(cSLO)イメージング 移植後2ヵ月後、被験患者 Rd1/NS マウス(n=5)にケタミン(100mg/kg体重)と塩酸キシラジン(20mg/kg体重)の腹腔内注射による麻酔を行った。 1%(wt / vol)トロピカミド点眼薬で瞳孔を拡張します。 共焦点走査型レーザー検眼鏡cSLOシステム22を使用して、標準的な55°マルチモーダルイメージングを実行します。 30フレームのART平均化を使用してMRおよびSD-OCT画像を取得します。 8. 組織学的染色 以前に報告されたように、移植された Rd1 / NS マウスの眼の凍結スライドを準備します 14。 5%ヤギ血清と1%Triton X100のPBS混合物を使用して、移植された網膜の凍結スライドをブロックして浸透させます。 サンプルを一次抗体と4°Cで一晩インキュベートし、PBSでリンスします(5分、3回)。一次抗体には、ヤギ抗GFP-FITC(1:200)、ウサギ抗リカバーリン(1:1000)、およびウサギ抗S-オプシン(1:500)が含まれます。 サンプルを二次抗体(ヤギ抗ウサギCy3、1:500)とインキュベートし、DAPIで対比染色します。注:一次抗体および二次抗体の供給元は、 材料表に記載されています。