JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

השתלה טרנס-סקלרלית מונחית אישונים של שתלים תת-רשתית במודל עכבר ניוון רשתית

Published: January 26, 2024
doi:
10.3791/65448
, , , , , , ,
1Wilmer Eye Institute,Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Genetic Medicine,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מציג גישה טרנס-סקלרלית מונחית ראייה טרנס-אישונים להעברה בטוחה ומדויקת של שתלים תאיים תת-רשתית, עם שיעור נמוך של סיבוכים כירורגיים, במושתלי עכבר עם או בלי ניוון רשתית.

Abstract

השתלת תאים קולטי אור ותאי אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) מספקים טיפול פוטנציאלי למחלות ניוון רשתית. השתלה תת-רשתית של תאי תורם טיפוליים למושתלי עכבר היא מאתגרת בשל שטח הניתוח המוגבל המתאפשר על ידי הנפח הקטן של עין העכבר. פיתחנו פלטפורמת השתלה כירורגית טרנס-סקלרלית עם הנחיית ראייה טרנס-אישונים ישירה כדי להקל על העברה תת-רשתית של תאים אקסוגניים במושתלי עכבר. הפלטפורמה נבדקה באמצעות מתלי תאי רשתית ויריעות רשתית תלת ממדיות שנאספו מעכברי Rho:: EGFP עשירים במוט ומ-OPN1LW-EGFP עשיר בחרוטים; NRL-/- עכברים, בהתאמה. בדיקה חיה/מתה, הראתה תמותה נמוכה של תאים בשתי צורות תאי התורם. שתלי רשתית הועברו בהצלחה לחלל התת-רשתית של מודל עכברי של ניוון רשתית, Rd1/NS, עם מינימום סיבוכים כירורגיים כפי שזוהו על ידי הדמיית אופטלמוסקופ לייזר סריקה קונפוקלית מולטימודאלית (cSLO). חודשיים לאחר ההשתלה, הצביעה ההיסטולוגית הדגימה עדות להבשלה מתקדמת של שתלי הרשתית למוטות ומדוכים “בוגרים” (על ידי ביטוי Rho::EGFP, S-opsin ו-OPN1LW:EGFP, בהתאמה) בחלל התת-רשתית. כאן, אנו מספקים פלטפורמה כירורגית שיכולה לאפשר מתן תת רשתית מדויק ביותר עם שיעור נמוך של סיבוכים אצל מושתלי עכבר. טכניקה זו מציעה דיוק וקלות יחסית של רכישת מיומנות. יתר על כן, הטכניקה יכולה לשמש לא רק למחקרים של השתלת תאים תת-רשתית, אלא גם למחקרים טיפוליים תוך עיניים אחרים, כולל טיפולים גנטיים.

Introduction

השתלת קולטי אור ותאי אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE) מספקת טיפול פוטנציאלי למחלות ניווניות ברשתית כגון ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), מחלת סטארגרדט ורטיניטיס פיגמנטוזה (RP)1,2,3,4,5,6,7 . כדי לחדש או להחליף את הפוטורצפטורים ותאי RPE החולים ברשתית מנוונת, החלל התת-רשתית מתאים במיוחד כיעד להשתלה בהתחשב באנטומיה הלמינרית של פוטורצפטורים מארחים ותאי RPE. בעוד שהליכים כירורגיים של השתלה תת-רשתית של תאי RPE מבוססים היטב בבעלי חיים גדולים 8,9,10 ובניסויים קליניים11,12,13, האתגרים העומדים בפני מחקר השתלת קולטני אור כוללים את המחסור במודלים טרנסגניים של בעלי חיים גדולים ואת ההבנה המוגבלת של מנגנוני סינפטוגנזה מעמיקים המעורבים בהשתלה עצבית, בין שאר החששות. מודלים מהונדסים גנטית, עם סוגים שונים של מוטציות ניוון רשתית, מספקים כלים שימושיים לחקר מנגנונים מולקולריים בהקשר של השתלה וניווט הפיתוח של טיפולים יעילים בתחליפי תאים בשלב הפרה-קליני 14,15,16,17,18.

שלא כמו העין הגדולה יחסית והעדשה הגבישית הקטנה אצל בעלי חיים גדולים (למשל, חזיר, קוף), הגודל הקטן והעדשה הגבישית הגדולה של עיני העכבר הופכים אותן למטרות ניתוחיות קשות, במיוחד עבור השתלות תת-רשתית שבהן אילוצי מרחב פיזי והדמיה ישירה מוגבלת הם אתגרי הליבה.

ניתן לסווג את הגישות הנוכחיות לשלושה סוגים עיקריים בהתבסס על מסלול ההזרקה. ראשית, במקרה של הגישה הטרנס-קרנית, המחט מועברת דרך הקרנית לתוך חלל הזגוגית ולאחר מכן לתוך החלל התת רשתית19,20. ניתן להגיע ללידה תת-רשתית מוצלחת בשיטה זו, אך הנזק למבני המקטע הקדמי (כלומר, הקרנית, הקשתית, העדשה) הוא סיכון משמעותי שעלול לעכב קשות את ניתוח ה- vivo במורד הזרם. שנית, במקרה של הגישה הטרנס-זגוגית, המחט נכנסת לחלל הזגוגית דרך pars plana ולאחר מכן לתוך החלל התת-רשתית21. גישה זו נמצאת בשימוש נרחב בבני אדם ובבעלי חיים גדולים. עם זאת, קיים סיכון פוטנציאלי לנזק לעדשה במכרסמים מכיוון שהעדשה תופסת נפח יחסי גדול יותר של חלל הזגוגית. יש לציין כי הן פרוטוקולים טרנס-קרניים והן טרנס-זגוגיות דורשים חדירה של הרשתית העצבית כדי להגיע לחלל התת-רשתית, מה שגורם נזק לרשתית המארחת ומגביר את הסיכון לרפלוקס של תאי תורם דרך חור החדירה. שלישית, במקרה של הגישה הטרנס-סקלרלית22,23, המחט חודרת דרך קומפלקס הסקלרלי-כורואיד-RPE ונכנסת ישירות לחלל התת-רשתית. גישה זו מפחיתה את פוטנציאל הטראומה של מבני המקטע הקדמי וחלל הזגוגית. עם זאת, ללא הדמיה ישירה של פונדוס המארח, כשלים כירורגיים הנגרמים על ידי ניקורים trans-retinal, ניתוק RPE, ודימום כורואידי מזוהים בדרך כלל.

כאן פיתחנו פלטפורמה כירורגית טרנס-סקלרלית עם הנחיית ראייה טרנס-אישונים ישירה להשתלה תת-רשתית במושתלי עכבר. אימות הכדאיות של יריעות רשתית מתורם ותרחיפים של תאים לפני ביצוע ההשתלה. העברה מוצלחת של תאי התורם לחלל התת-רשתית של מודל עכבר ניוון רשתית אושרה. התגלו רק סיבוכים כירורגיים נדירים. בנוסף, פוטורצפטורים מושתלים בשתלי הרשתית שרדו והראו עדות להבשלה מתקדמת למוטות ומדוכים “בוגרים” חודשיים לאחר ההשתלה.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (פרסומי NIH מס ‘8023, מתוקן 1978) והצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ג’ונס הופקינס (אישור M021M459). 1. בעלי חיים השתמש Rho:::EGFP עכברים (בגילאי P3-P6) כתורמים של תרחיפים של תאי רשתית.הערה: זן זה היה מתנה חביבה מד”ר ט. וונסל, מכללת ביילור לרפואה. השתמש OPN1LW-EGFP/NRL-/- עכברים14 (גיל P3) כתורמים של יריעות רשתית. השתמשו בעכברים בוגרים עם ניוון רשתית Rd1/NS עם חסר חיסוני (משני המינים) כמושתלים. אחסנו את כל העכברים בכלובים במחזור אור-חושך של 12:12 שעות עם גישה למים ולמזון לפי הצורך. 2. אספו רשתית עצבית (איור 1) הערה: כל השלבים הבאים בוצעו בתנאים סטריליים. פרטי הספקים של כלי המחקר והמוצרים מופיעים בטבלת החומרים. הכנת עכברים תורמים: הרדימו עכברים תורמים עם מנת יתר של פחמן דו חמצני ואשרו המתת חסד עם פריקת צוואר הרחם. בודדו את גלגלי העיניים של עכברים. לשם כך, בצע את השלבים הבאים.פתחו בזהירות את העפעפיים של הגורים באמצעות מספריים זעירים כדי לחשוף את גלגל העין. השתמש במלקחיים חלקים כדי לתפוס את עצב הראייה ולשלוף את גלגל העין עם זוג מלקחיים. בידוד הרשתית העצביתהערה: שלב זה מבוצע תחת מיקרוסקופ דיסקציה.חותכים חור במרכז הקרנית באמצעות מחט סטרילית 25 גרם. חותכים את הקרנית, דרך החור, לשניים והגדילו את החתך ללובן העין ול-RPE, ואז הסירו את לובן העין וה-RPE. השתמש במלקחיים מיקרו-שיניים כדי להסיר בעדינות את העדשה ואת הזגוגית כדי לבודד את הרשתית העצבית. המשך עם סעיף 3 להכנת השעיית רשתית תורם או סעיף 4 להכנת גיליון רשתית תורם, כנדרש. 3. הכינו את תרחיף הרשתית של התורם (איור 1) יש לדגור על הרשתית העצבית בתמיסת פפאין בטמפרטורה של 37°C למשך 20-30 דקות עד שלא יתגלו גושי תאים.הערה: יש לקפט בעדינות את תערובת התאים 15x כל 10 דקות. עקוב אחר הוראות היצרן של ערכת הדיסוציאציה Papain כדי לאסוף תאים בודדים. 4. הכינו יריעות רשתית מתורם (איור 1) הערה: שלב זה עוקב אחר סעיף 2 ומבוצע תחת מיקרוסקופ דיסקציה. הכניסו את הרשתית העצבית המבודדת לצלחת פטרי בקוטר 35 מ”מ עם PBS סטרילי מצונן. השתמש במספריים זעירים כדי לחתוך את הרשתית העצבית למספר יריעות רשתית (בסביבות 1 מ”מ x 2 מ”מ). 5. הכינו עכברים מושתלים מרדימים עכברים מושתלים באמצעות הזרקה תוך צפקית של קטמין (100 מ”ג/ק”ג משקל גוף) וקסילזין הידרוכלוריד (20 מ”ג/ק”ג משקל גוף). אשר את המישור הכירורגי של ההרדמה על ידי הבטחת אובדן רפלקסי מצמוץ וכאב, נשימה סדירה ונשימה. להעריך את עומק ההרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטה בזנב או נסיגה רפלקסים הדוושה. בדוק תמיד שוב את עומק ההרדמה במהלך הניתוח והתאם את עומק ההרדמה אם בעל החיים מגיב לכאב. שמור את העכברים על שולחן הניתוח שחומם מראש כדי למנוע היפותרמיה. הרחבת אישונים מושתלים עם טיפות עיניים טרופיקאמיד 1% (wt/vol) 5 דקות לפני הניתוח. אישון מורחב היטב יכול להקל על הדמיה transpupillary תחת מיקרוסקופ ההפעלה. לחטא את עין העכבר הניתוח ואת רקמות העין שמסביב עם יוד פובידון, לשטוף עם PBS מעוקר. החל 0.5% Proparacaine hydrochloride על עין העכבר עבור שיכוך כאבים. 6. השתלה תת-רשתית של שתלי רשתית (איור 2) הערה: כל השלבים הבאים בוצעו בתנאים אספטיים. כלי הניתוח היו אוטומטיים (השתמשו במגשי מכשירים כדי להגן על קצות הכלים והוציאו את הבוכנה מהמזרקים הזעירים כדי למנוע מהם להיתקע בלומן). פרטי הספקים של כלי המחקר והמוצרים מופיעים בטבלת החומרים. Paracentesis החדר הקדמי: לחדור הקרנית ההיקפית לתוך החדר הקדמי עם מחט אינסולין כדי לאפשר הומור מימי לצאת באופן פסיבי, כדי למנוע את קפיצות הלחץ תוך עיני (IOP) במהלך ההשתלה.הערה: פרסנטזיס מוצלח מסומן על ידי זרם של הומור מימי דרך חור הקרנית. הניחו טיפה של נתרן היאלורונט וכיסוי זכוכית (בקוטר 5 מ”מ) על גבי הקרנית כדי לאפשר הדמיה טרנס-אישונים של הפונדוס מתחת לטווח הניתוח. השתמש במלקחיים שיניים כדי לחשוף את מוקד ההזרקה (1 מ”מ לאחר הקרנית) על ידי לחיצה על דופן העין העליונה או התחתונה, כפי שנדרש על ידי הניסוי, לכיוון מרכז הראייה transpupillary. השתמש במחט מיקרו-הזרקה כדי לחדור בניצב לסקלרה. סובב בזהירות את כיוון המחט באופן משיק כדי לאפשר חדירה מלאה של קומפלקס sclera-choroid-RPE לתוך החלל subretinal. הכנס את המחט באופן משיק כדי לגשת למוקד ההזרקה הטרמינלי.הערה: ודא את המיקום המלא של שיפוע המחט על ידי הנחיית ראייה transpupillary. השתמש בכלי הרשתית השטחיים כהפניה אנטומית למיקום מדויק של המחט בתוך החלל התת-רשתית. הזרקת שתלי רשתיתהערה: נוכחותן של בועות קטנות הטעונות מראש במזרק יכולה להקל על אימות המיקום התת-רשתית המדויק של תאי התורם. IOP מוגבר כתוצאה מהזרקה תת רשתית מגביר את הסיכון לריפלוקס תאי תורם.אם הקרנית הופכת עכורה24,25, אינדיקטור של IOP גבוה, לשמור את המחט בחלל subretinal לפחות 3 דקות עד הקרנית מתבהרת, אינדיקטור כי IOP ירד מספיק.הערה: במקרים נדירים, IOP עשוי לקחת זמן רב יותר כדי לנרמל, מומלץ לשמור על המחט במקום עד בהירות הקרנית משוחזר גם אם זה ייקח 8-10 דקות. יש להתבונן תחת מיקרוסקופ כירורגי כדי למנוע נזק למבני הרשתית. אחזו בקצה חור ההזרקה בעזרת מלקחיים בעלי מיקרו-שיניים ומשכו במהירות את המחט.הערה: הקריטריונים למסירה תת-רשתית מוצלחת של תרחיף וגיליון של תאי רשתית הם bleb קבוע וגיליון לבן גלוי בחלל התת-רשתית, בהתאמה. לנקות את האזור הכירורגי של העין עם דמעות מלאכותיות ולמרוח משחה במידת הצורך. מתן לאחר הניתוחהכניסו עכברים מושתלים לכלוב התאוששות נקי שחומם מראש (37°C) והשגיחו בקפידה על מצוקות. יש למרוח טיפה של 0.5% פרופרקאין הידרוכלוריד מקומי על העין הכירורגית 2-3 פעמים אם מתרחשת מצוקה. להחזיר עכברים לכלוב הבית לאחר שהעכברים ערניים וניידים לחלוטין. הניחו מספר קטן של כדורי מזון וכוס ג’ל בכלוב אם העכברים מתקשים להגיע להופר המזון.הערה: יש לשמור על לחות פני העין עד להרדמה כדי למנוע היווצרות קטרקט. 7. הדמיה מולטימודאלית קונפוקלית לסריקה בלייזר אופטלמוסקופיה (cSLO) חודשיים לאחר ההשתלה, מרדימים עכברים מושתלי Rd1/NS (n=5) על ידי הזרקה תוך צפקית של קטמין (100 מ”ג/ק”ג משקל גוף) וקסילזין הידרוכלוריד (20 מ”ג/ק”ג משקל גוף) לצורך הדמיה. הרחבת אישונים עם 1% (wt/vol) טיפות עיניים טרופיקמיד. בצע הדמיה מולטימודאלית סטנדרטית של 55° באמצעות מערכת cSLO22 בלייזר לסריקה קונפוקלית. קבל תמונות MR ו- SD-OCT באמצעות ממוצע ART של 30 פריימים. 8. צביעה היסטולוגית הכינו שקופיות קפואות של עיני עכברי Rd1/NS מושתלים כפי שדווח בעבר 14. חסמו וחדרו את המגלשות הקפואות של הרשתית המושתלת באמצעות תערובת של 5% סרום עיזים ו-1% טריטון X100 ב-PBS. יש לדגור על דגימות עם נוגדנים ראשוניים במשך הלילה בטמפרטורה של 4°C ולשטוף ב-PBS (5 דקות, 3x). הנוגדנים העיקריים כוללים אנטי-GFP-FITC (1:200), ארנב נגד התאוששות (1:1000) וארנב אנטי-S-אופסין (1:500). לדגור על הדגימות עם נוגדן משני (עז נגד ארנב Cy3, 1:500) ומוכתמת נגדית עם DAPI.הערה: הספקים של נוגדנים ראשוניים ומשניים מפורטים בטבלת החומרים.

Representative Results

שתלי רשתית מועברים בהצלחה לחלל התת-רשתית ושורדים in vivo.הביצועים של פלטפורמת ההשתלה התת-רשתית שלנו הוערכו בעכברים מושתלי Rd1/NS בגילאי 6-8 שבועות כאשר הרשתית השיורית שלהם הידלדלה קשות עקב ניוון כמעט מוחלט של השכבה הגרעינית החיצונית (ONL). בהתחשב בשבריריות הרשתית, במחסור בפוטורצפטורים של חרוט וביכולת הקיום הנמוכה יחסית של תאים בתרחיף בהשוואה לתורמי יריעות, עכברים עשירים בחרוט (OPN1LW-EGFP; NRL-/-)14 שימשו כמקורות ליריעות רשתית של תורמים ולעכברים עשירים במוטות (Rho::EGFP) כתורמים לתרחיפים של תאים. יריעת רשתית עשירה בחרוט ותרחיפים עשירים במוט הועברו בהצלחה לחלל התת-רשתית של כל העכברים המקבלים באמצעות הפלטפורמה הניתוחית שלנו, כפי שאושר על ידי השכבה התת-רשתית והיריעה הלבנה שנצפו באמצעות הדמיה טרנס-אישונים מיד לאחר ההזרקה. חודשיים לאחר ההשתלה בוצעה הדמיית cSLO מולטימודאלית כדי לעקוב אחר מצבי השתלות הרשתית in vivo. סריקת OCT בחתך רוחב הראתה ששתלי רשתית שרדו בחלל התת-רשתית ויצרו מחדש את ה-ONL בכל העכברים המושתלים (איור 3A). הדמיית אינפרא-אדום לא זיהתה קטרקט ברור בכל העיניים המושתלות (איור 3B). סיבוכים כירורגיים אחרים, כולל דימום, התגלו רק לעתים רחוקות ברשתית מושתלת (n = 1/10 עיניים) באמצעות הדמיית השתקפות צבעונית חודשיים לאחר ההשתלה (איור 3C). ביצענו צביעה היסטולוגית כדי להעריך עוד יותר את ההישרדות ואת מידת ההבשלה של פוטורצפטורים בשתלי רשתית. נצפו שפע של פוטורצפטורים חרוטים המבטאים OPN1LW:EGFP ו-S-opsin ביריעות רשתית מושתלות. באופן דומה, תרחיפים מושתלים של תאי רשתית הראו שיעור גדול של קולטני אור Rec+ in vivo, כולל מוטות Rho::EGFP+ רבים (איור 3D). עכברי הביקורת שלא הושתלו הראו ניוון ONL חמור עם פוטורצפטורים שיוריים דלילים של חרוט (Rec+). לא זוהה אות EGFP ברשתית Rd1/NS שאינה מושתלת (איור 3D). איור 1: סכמטיות של איסוף גיליון רשתית תורם ותרחיפים של תאים. סכמות המציגות את שלבי המפתח של איסוף תרחיפים ויריעות של תאי רשתית מעכברי Rho::EGFP תורמים. הדמיה של שדה בהיר ופלואורסצנטי הראתה תמונות מייצגות של תאים מנותקים ויריעה מנותחת שבודדה מעכברי Rho::EGFP . קו מקווקו צהוב: שולי חתך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: הליכים של השתלה תת-רשתית של יריעות רשתית ותרחיף תאים בעכברי Rd1/NS . (A) תמונות סכמטיות של הכנת עכברים מושתלים. (B) הליכים כירורגיים מרכזיים ודיאגרמות תואמות המראות השתלה תת-רשתית של תרחיפים ויריעות של תאי רשתית. צעדים כירורגיים כוללים: 1. לחדור לחדר הקדמי; 2. זרוק את hyaluronate נתרן על הקרנית, ולאחר מכן להרכיב את הכיסוי על גבי hyaluronate נתרן כדי להקל על הדמיה transpupillary; 3. חודרים לשכבות החיצוניות של דופן העין (קומפלקס סקלרה-כורואיד-RPE). זוויות החדירה של המחט נמצאות בלוח הימני העליון של האיור; 4. הכנס מחט הזרקה; 5. הזריקו שתלים. תמונות מייצגות מראות את המסירה המוצלחת של מתלי תאי רשתית וגיליון בשני מושתלים בודדים, בהתאמה. כוכבית: ראש עצב הראייה; ראשי חץ אדומים: כלי דם ברשתית; ראש חץ לבן: קצה מחט חדור; חצים לבנים: מתלי רשתית מושתלים או יריעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: העברה מוצלחת של שתלי רשתית לחלל התת-רשתית והישרדות in vivo. (A) תמונות SD-OCT מייצגות הראו את ההתפלגות התת-רשתית של יריעות רשתית מושתלות ותרחיפים של תאים בשני עכברים בודדים מסוג Rd1/NS , בהתאמה. עכברי Rd1/NS שלא הושתלו נאספו כביקורת. אזור עניין (ROI) מסומן על ידי תיבות מנוקדות צהובות בתמונות פונדוס אינפרא אדום (IR). הרשתית הפנימית מוגדרת כלמינה של שכבת תאי גנגליון ברשתית (RGC), שכבת פרספקס פנימית (IPL) ושכבה גרעינית פנימית (INL). (B) תמונת אינפרא-אדום (IR) מייצגת של עכבר Rd1/NS מושתל לא הראתה קטרקט דרך האישון המורחב. (C) תמונות משקפות צבעוניות מייצגות (MR) של עיני Rd1/NS מושתלות ולא מושתלות. העיניים המושתלות לא הציגו סיבוכים ניתוחיים ברורים כולל דימום. (D) צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) של עכברים מושתלים (גיליון ותרחיף) ולא מושתלים (בקרה) Rd1/NS . הנתונים הראו מספר רב של פוטורצפטורים מושתלים המבטאים סמנים ספציפיים של פוטורצפטורים (Rec), מוטות (Rho::EGFP), מדוכי L/M (OPN1LW:EGFP) ומדוכי S (S-opsin) חודשיים לאחר ההשתלה. למינה רשתית מושתלת זוהתה על ידי צביעת DAPI (כחול). שתלי רשתית זוהו על ידי כתב EGFP (ירוק). רשתית העכברים שלא הושתלו הראתה ניוון ONL חמור עם פוטורצפטורים שיוריים דלילים של חרוט (Rec+). לא זוהה אות EGFP ברשתית Rd1/NS שאינה מושתלת. תמונות מוגדלות הוצגו בשני הלוחות הימניים. קיצורים: RGC: שכבת תאי גנגליון ברשתית; INL: שכבה גרעינית פנימית. ONL: שכבה גרעינית חיצונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

השתלה תת-רשתית בעכברים מאתגרת מבחינה טכנית בשל גודלן הקטן של עיני עכבר. במחקר זה פיתחנו פלטפורמה פשוטה וניתנת לשחזור להשתלה תת-רשתית במושתלי עכברים. הפלטפורמה מאפשרת עקביות בהגנה על כדאיות התורם, לידה תת רשתית מוצלחת, ומבטיחה שיעור סיבוכים נמוך.

טכניקת ההשתלה התת-רשתית המתוארת כאן פותחה על בסיס המסלול הטרנס-סקלרלי, שבו מחט ההזרקה חודרת לשכבות החיצוניות (קומפלקס סקלרה-כורויד-RPE) של דופן העין. בהשוואה לגישה טרנס-קרנית19,20 וטרנס-זגוגית21,26,27, הגישה הטרנס-סקלרלית נכנסת ישירות לחלל התת-רשתית מבלי לחדור למבני המקטע הקדמי ולרשתית העצבית, ובכך מאפשרת השתלה לא מזיקה ומפחיתה את הסיכון לרפלוקס תאי תורם דרך החור החודר. אתגר של הגישה הטרנס-סקלרלית הוא להבטיח שקצה המחט יתפשט לאורך החלל התת-רשתית לפני ההגעה לאתר המסירה הטרמינלי, תוך הימנעות מהפרעה פוטנציאלית של שכבות RPE וכורואיד סמוכות. זה מאתגר להשיג מטרות אלה באמצעות גישה טרנס-סקלרלית מסורתית28,29 ללא הדרכה חזותית ישירה. במחקר זה פיתחנו פלטפורמה מונחית ראייה טרנס-אישונים באמצעות מיקרוסקופ כירורגי והארה חיצונית של הרשתית כדי להקל על השתלה תת-רשתית במודלים של עכברים. הפלטפורמה מאפשרת למפעיל לעקוב אחר התהליך הניתוחי ומצב הרשתית של המושתלים על ידי מתן הדמיה בזמן אמת של הפונדוס המושתל תחת המיקרוסקופ הניתוחי. לדוגמה, חדירה מוצלחת של קומפלקס sclera-choroid-RPE יכול להיות פשוט מאומת על ידי השתקפות בהירה יחסית של קצה המחט באמצעות הדמיה transpupillary. חשוב לציין, כאשר הוא מונחה על ידי הדמיה טרנס-אישונים, המפעיל יכול לווסת במדויק את הזווית ואת עומק ההזרקה בהתאם למיקום היחסי בין המחט לבין מבנים אנטומיים ברשתית הנמענת (למשל, כלי דם ברשתית וראש עצב הראייה). יתר על כן, ניהול מדויק של חומרים באמצעות טכניקה זו יכול למזער RPE, טראומה כורואידית, וסיבוכים כירורגיים אחרים. ואכן, מצאנו שניתן למזער דימומים על ידי הימנעות מתמרונים בסמיכות לכלי דם ברשתית בעזרת הדמיה טרנס-אישונים.

ריפלוקס של תאי תורם הוא הגורם העיקרי לכישלון כירורגי לאחר הזרקה29,30. ישנם גורמים רבים המעורבים בקידום ריפלוקס תאי תורם. הלחץ התוך עיני הגבוה (IOP) של העיניים הנמענות הנגרם על ידי תערובות תאי התורם המוזרקים הוא גורם חשוב המקדם את הרפלוקס של התאים מחוץ לעין. הפרוטוקול שלנו מפחית את ה- IOP של המושתלים על ידי חדירה לחדר הקדמי בתחילת הניתוח ומאפשר ל- IOP להוריד באופן ספונטני על ידי יציאת נוזל מימי לפני שליפת מחט הזגוגית מחלל הזגוגית. גורם שני הוא מנהרת ההזרקה הלא אטומה בעיני המושתלים. כדי למנוע רפלוקס השתל חזרה דרך תעלת ההזרקה, אנו משתמשים במחט מיקרו-הזרקה בגודל קטן (34G) כדי ליצור מנהרה אוטמת עצמה בעת חדירה לדופן העין ובמיקרו-מלקחיים עם שיניים כדי להחזיק את קצוות פתח התעלה החיצוני בעת שליפת המחט. בהשתלות קונבנציונליות, שתלים עם ריפלוקס כמעט ולא מזוהים מכיוון שהם עלולים להתרחש במהירות או להתפוגג במהירות. הנתרן היאלורונאט, עם מריחת הכיסוי, מחליק כמעט תמיד מהקרנית כדי לכסות את רוב הלימבוס ולובן העין כולל אתר הסקלוטומיה. לאחר הזרקת תאים, נתרן היאלורונט באתר sclerotomy יכול לעזור להאט את הזרימה הגדולה של תוכן refluxed, אם בכלל, ולעזור להפוך אותם חזותית לזהות תחת המיקרוסקופ כירורגי. יתר על כן, היעדר ריפלוקס יכול גם להיות מאומת על ידי מעקב אחר הקביעות של bleb subretinal עבור השעיות תאים ואת המיקום תוך עיני של גיליון הרשתית באמצעות הפרוטוקול שלנו, אשר יכול להיות שימושי עבור מעבדות שבהן טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (OCT) אינו זמין.

בעוד מספר ניכר של תאים קולטי אור שרדו ביריעות הרשתית המושתלות, לא ניתן היה להבחין בכיוון התאים, או בכיוון היריעה. למרות שאספקה של יריעות רשתית תלת ממדיות לבעלי חיים גדולים נקבעה 26,31,32, החלל התת-רשתית בעכברים, יחד עם היעדר יכולת דימות רשתית תוך ניתוחית, הופך את זה למאתגר מאוד להבטיח שמירה על כיוון היריעה תוך ניתוחית, כמו גם בתקופה המיידית שלאחר הניתוח שבמהלכה התאים או היריעות המושתלים עלולים להפוך לבלתי יציבים ככל שהעכבר חוזר לאמבולציה.

אנו מתארים פלטפורמה כירורגית טרנס-סקלרלית עם הנחיית ראייה טרנס-אישונים ישירה להשתלה תת-רשתית במושתלי עכבר. פלטפורמה זו מאפשרת דיוק גבוה של ההזרקה ושיעור נמוך של סיבוכים כירורגיים. פלטפורמה זו מאפשרת העברה מדויקת של מינונים ידועים של תאים, קלה יחסית ללמידה, ומאפשרת מתן תת רשתית בנוסף לזריקות תוך רשתית או תוך ויטריאלית לסוגים שונים של חומרים טיפוליים כולל ריפוי גנטי.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי המימון הבא: NEI R01EY033103 (MSS), הקרן למלחמה בעיוורון (MSS), קרן שולסקי (MSS), קרן יוסף אלברט הקימיאן (MSS), קרן ג’ולייט RP Vision (YVL), מחקר למניעת עיוורון (מענק בלתי מוגבל למכון העיניים וילמר באוניברסיטת ג’ונס הופקינס ומכון העיניים קאלן במכללת ביילור לרפואה). אנו מודים לד”ר מליה אדוארדס (בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג’ונס הופקינס) על מתן הדרכה בנושא המיקרוסקופ.

Materials

Artificial tears CareAll P31447-04
Coverslips (5mm in diameter) Deckglaser N/A
Goat anti-GFP (FITC) Abcam Ab6662
Goat-anti-rabbit Cy3  Invitrogen A10520
Insulin syringe (30G) Easy Touch 08496-3015-11
Ketamine VETone Zetamine AH2017J
Live Dead Viability Kit Thermo Fisher Scientific L3224
Micro scissor Harvard Apparatus 72-8503
Micro smooth forceps ASICO AE-4360
Micro toothed forceps World Precision Instruments 555041FT
Microinjection needle (26G) Hamilton 7804-03
Microinjection needle (34G) Hamilton 207434
Microinjection syringe Hamilton 7633-01
Papain dissociation kit Worthington Biochemical LK003150
Petri-dish (35 mm) Thermo Fisher Scientific FB012920
Povidone-iodine (10%) Betadine Solution N/A
Proparacaine Hydrochloride (0.5%) Keeler AX0500
Rabbit anti-recoverin Millipore Ab5585
Rabbit anti-S-opsin Millipore Ab5407
Sodium hyaluronate Johnson & Johnson Vision  10-2400-11
Sterile cotton swabs Puritan 25-806 2PC
Sterile needle (25G) BD PrecisionGlide Needle 305122
Sterile towel drapes Dynarex 4410
Surgical materials/reagents
Tropicamide ophthalmic solution Henry Schein 112-7192
Xylazine AnaSed Injection N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  2. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nat Biotechnol. 36 (4), 328-337 (2018).
  3. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Sci Transl Med. 10 (435), (2018).
  4. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  5. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  6. Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Sci Transl Med. 11 (475), (2019).
  7. Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 1101-1106 (2013).
  8. Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E81-E90 (2016).
  9. Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig. Retina. 24 (1), 98-109 (2004).
  10. Klassen, H., et al. Progenitor cells from the porcine neural retina express photoreceptor markers after transplantation to the subretinal space of allorecipients. Stem Cells. 25 (5), 1222-1230 (2007).
  11. Das, T., et al. The transplantation of human fetal neuroretinal cells in advanced retinitis pigmentosa patients: results of a long-term safety study. Exp Neurol. 157 (1), 58-68 (1999).
  12. Humayun, M. S., et al. Human neural retinal transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 3100-3106 (2000).
  13. Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 209 (2017).
  14. Liu, Y. V., et al. Characterization and allogeneic transplantation of a novel transgenic cone-rich donor mouse line. Exp Eye Res. 210, 108715 (2021).
  15. Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. 485 (7396), 99-103 (2012).
  16. Ortin-Martinez, A., et al. Photoreceptor nanotubes mediate the in vivo exchange of intracellular material. EMBO J. 40 (22), 107264 (2021).
  17. Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
  18. Singh, M. S., et al. Transplanted photoreceptor precursors transfer proteins to host photoreceptors by a mechanism of cytoplasmic fusion. Nat Commun. 7, 13537 (2016).
  19. Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
  20. Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods Mol Biol. 884, 53-69 (2012).
  21. Fang, Y., et al. Safety evaluation of subretinal injection of trypan blue in rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 22 (10), 2923-2933 (2018).
  22. Liu, Y. V., et al. Quantifiable in vivo imaging biomarkers of retinal regeneration by photoreceptor cell transplantation. Transl Vis Sci Technol. 9 (7), 5 (2020).
  23. Liu, Y. V., et al. Single-cell transcriptome analysis of xenotransplanted human retinal organoids defines two migratory cell populations of nonretinal origin. Stem Cell Reports. 18 (5), 1138-1154 (2023).
  24. Park, S., et al. Animal models of corneal endothelial dysfunction to facilitate development of novel therapies. Ann Transl Med. 9 (15), 1271 (2021).
  25. Li, X., et al. Acute ocular hypertension disrupts barrier integrity and pump function in rat corneal endothelial cells. Sci Rep. 7 (1), 6951 (2017).
  26. Chao, J. R., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal cells into the subretinal space of a non-human primate. Transl Vis Sci Technol. 6 (3), 4 (2017).
  27. Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells Dev. 28 (17), 1151-1166 (2019).
  28. Zhao, C., et al. Development of a refined protocol for trans-scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes. J Vis Exp. (126), e55220 (2017).
  29. Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), e4286 (2012).
  30. Wongpichedchai, S., Weiter, J. J., Weber, P., Dorey, C. K. Comparison of external and internal approaches for transplantation of autologous retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (12), 3341-3352 (1992).
  31. Luo, Z., et al. Establishing a surgical procedure for rhesus epiretinal scaffold implantation with HiPSC-derived retinal progenitors. Stem Cells Int. 2018, 9437041 (2018).
  32. Luo, Z., et al. Biodegradable scaffolds facilitate epiretinal transplantation of hiPSC-Derived retinal neurons in nonhuman primates. Acta Biomater. 134, 289-301 (2021).

Tags

Transpupillary-guidedTrans-scleralSubretinal GraftsRetinal DegenerationMouse ModelEGFPOPN1LW-EGFP/NRLRd1/NSPapainRetinal SheetAnesthesiaPupil DilationTranspupillary Visualization

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Liu, Y. V., Li, K. V., Li, Z., Lu, Y., McNally, M. M., Esposito, E. P., Aziz, K., Singh, M. S. Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model. J. Vis. Exp. (203), e65448, doi:10.3791/65448 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image