زرع الطعوم تحت الشبكية الموجهة عبر الحدقة في نموذج فأر تنكس الشبكية
Summary
يقدم هذا البروتوكول نهجا عبر الصلبة موجها بالرؤية عبر الحدقة لتقديم الطعوم الخلوية تحت الشبكية بأمان ودقة ، مع معدل منخفض من المضاعفات الجراحية ، في متلقي الفئران مع أو بدون تنكس الشبكية.
Abstract
يوفر زرع الخلايا المستقبلة للضوء والخلايا الظهارية الصبغية للشبكية (RPE) علاجا محتملا لأمراض تنكس الشبكية. يمثل زرع الخلايا تحت الشبكية للخلايا المانحة العلاجية في متلقي الفئران تحديا بسبب المساحة الجراحية المحدودة التي يسمح بها الحجم الصغير لعين الفأر. قمنا بتطوير منصة زرع جراحية عبر الصلبة مع توجيه مباشر للرؤية عبر الحدقة لتسهيل توصيل الخلايا الخارجية تحت الشبكية في متلقي الفئران. تم اختبار المنصة باستخدام معلقات خلايا الشبكية وصفائح الشبكية ثلاثية الأبعاد التي تم جمعها من الفئران الغنية بالقضبان Rho::EGFP و OPN1LW-EGFP الغنية بالمخروط. NRL- / – الفئران ، على التوالي. أظهر الفحص الحي / الميت انخفاض معدل وفيات الخلايا لكلا الشكلين من الخلايا المانحة. تم تسليم ترقيع الشبكية بنجاح إلى الفضاء تحت الشبكية لنموذج فأر من تنكس الشبكية ، Rd1 / NS ، مع الحد الأدنى من المضاعفات الجراحية كما تم اكتشافها بواسطة التصوير بالليزر متعدد الوسائط (cSLO) المسح الضوئي متحد البؤر. بعد شهرين من الزرع ، أظهر التلوين النسيجي دليلا على النضج المتقدم لترقيع الشبكية إلى قضبان ومخاريط “بالغة” (بواسطة تعبير Rho::EGFP و S-opsin و OPN1LW: EGFP ، على التوالي) في الفضاء تحت الشبكية. هنا ، نقدم منصة جراحية يمكنها تمكين توصيل تحت الشبكية بدقة عالية مع معدل منخفض من المضاعفات في متلقي الفئران. توفر هذه التقنية الدقة والسهولة النسبية لاكتساب المهارات. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه التقنية ليس فقط لدراسات زرع الخلايا تحت الشبكية ولكن أيضا للدراسات العلاجية الأخرى داخل العين بما في ذلك العلاجات الجينية.
Introduction
يوفر زرع الخلايا الظهارية المصطبغة بمستقبلات الضوء والشبكية (RPE) علاجا محتملا للأمراض التنكسية في شبكية العين مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ومرض ستارغاردت والتهاب الشبكية الصباغي (RP)1،2،3،4،5،6،7. لتجديد أو استبدال المستقبلات الضوئية المريضة وخلايا RPE في شبكية العين المتدهورة ، فإن الفضاء تحت الشبكية مناسب بشكل خاص كهدف زرع نظرا للتشريح الصفحي للمستقبلات الضوئية المضيفة وخلايا RPE. في حين أن الإجراءات الجراحية لزراعة الشبكية الفرعية لخلايا RPE راسخة في الكبيرة8،9،10 والتجارب السريرية11،12،13 ، فإن التحديات التي تواجه أبحاث زرع مستقبلات الضوء تشمل ندرة النماذج الحيوانية الكبيرة المعدلة وراثيا والفهم المحدود لآليات تكوين المشابك المتعمقة المشاركة في زرع الخلايا العصبية ، من بين مخاوف أخرى. توفر نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، مع أنواع مختلفة من طفرات تنكس الشبكية ، أدوات مفيدة لدراسة الآليات الجزيئية في سياق الزرع وتوجيه تطوير علاجات فعالة لاستبدال الخلايا في المرحلة قبل السريرية14،15،16،17،18.
على عكس العين الكبيرة نسبيا والعدسة البلورية الصغيرة في الكبيرة (مثل الخنزير) ، فإن الحجم الصغير والعدسة البلورية الكبيرة لعيون الفأر تجعلها أهدافا جراحية صعبة ، خاصة بالنسبة لزراعة الشبكية حيث تكون قيود المساحة المادية والتصور المباشر المحدود هي التحديات الأساسية.
يمكن تصنيف الأساليب الحالية إلى ثلاثة أنواع رئيسية بناء على مسار الحقن. أولا ، في حالة النهج عبر القرنية ، يتم تمرير الإبرة عبر القرنية إلى التجويف الزجاجي ثم إلى الفضاء تحت الشبكية19,20. يمكن تحقيق الولادة الناجحة تحت الشبكية باستخدام هذه الطريقة ولكن الضرر الذي يلحق بهياكل الجزء الأمامي (أي القرنية والقزحية والعدسة) يمثل خطرا كبيرا قد يعيق بشدة تحليل مجرى النهر في الجسم الحي. ثانيا ، في حالة النهج عبر الجسم الزجاجي ، تدخل الإبرة إلى التجويف الزجاجي من خلال pars plana ثم إلى الفضاء تحت الشبكية21. يستخدم هذا النهج على نطاق واسع في البشر الكبيرة. ومع ذلك ، هناك خطر محتمل لتلف العدسة في القوارض حيث تشغل العدسة حجما نسبيا أكبر من التجويف الزجاجي. والجدير بالذكر أن كلا من البروتوكولات عبر القرنية وعبر الجسم الزجاجي تتطلب اختراق الشبكية العصبية للوصول إلى الفضاء تحت الشبكية ، مما يتسبب في تلف شبكية العين المضيفة ويزيد من خطر ارتجاع الخلايا المانحة من خلال ثقب الاختراق. ثالثا ، في حالة النهج عبر الصلبة22,23 ، تخترق الإبرة مجمع RPE الصلب-المشيمية-وتدخل مباشرة إلى الفضاء تحت الشبكية. يقلل هذا النهج من الصدمة المحتملة لهياكل الجزء الأمامي والتجويف الزجاجي. ومع ذلك ، بدون تصور مباشر لقاع المضيف ، يتم اكتشاف الفشل الجراحي الناجم عن الثقوب عبر الشبكية ، وانفصال RPE ، ونزيف المشيمية.
هنا ، قمنا بتطوير منصة جراحية عبر الصلبة مع توجيه مباشر للرؤية عبر الحدقة لزراعة تحت الشبكية في متلقي الفئران. التحقق من صلاحية صفائح شبكية المتبرع ومعلقات الخلايا قبل إجراء الزرع. تم تأكيد التسليم الناجح للخلايا المانحة في الفضاء تحت الشبكية لنموذج فأر تنكس الشبكية. تم الكشف عن المضاعفات الجراحية النادرة فقط. بالإضافة إلى ذلك ، نجت المستقبلات الضوئية المزروعة في ترقيع الشبكية وأظهرت دليلا على النضج المتقدم في قضبان ومخاريط “بالغة” بعد شهرين من الزرع.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمثل زرع تحت الشبكية في الفئران تحديا تقنيا بسبب صغر حجم عيون الفأر. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير منصة بسيطة وقابلة للتكرار لزراعة تحت الشبكية في متلقي الفئران. تسمح المنصة بالاتساق في حماية قدرة المانحين على البقاء ، والولادة الناجحة تحت الشبكية ، وتضمن معدل مضاعفات منخفض.
تم تطوير تقنية زرع تحت الشبكية الموضحة هنا بناء على الطريق عبر الصلبة ، حيث تخترق إبرة الحقن الطبقات الخارجية (مجمع الصلبة المشيمية RPE) لجدار العين. بالمقارنة مع النهج عبر القرنية19،20 وعبر الجسم الزجاجي21،26،27 ، يدخل النهج عبر الصلبة مباشرة إلى الفضاء تحت الشبكية دون اختراق هياكل الجزء الأمامي والشبكية العصبية ، مما يتيح عملية زرع غير ضارة وتقليل خطر ارتجاع الخلايا المانحة من خلال ثقب الاختراق. يتمثل أحد تحديات النهج عبر الصلبة في ضمان انتشار طرف الإبرة على طول الفضاء تحت الشبكية قبل الوصول إلى موقع التسليم النهائي ، مع تجنب الاضطراب المحتمل لطبقات RPE والمشيمية المجاورة. من الصعب تحقيق هذه الأهداف من خلال نهج تقليدي عبر الصلبة28,29 دون توجيه بصري مباشر. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير منصة موجهة بالرؤية عبر الحدقة باستخدام مجهر جراحي وإضاءة خارجية للشبكية لتسهيل زرع تحت الشبكية في نماذج الفئران. تسمح المنصة للمشغل بتتبع العملية الجراحية وحالة شبكية العين لدى المتلقين من خلال توفير تصور في الوقت الفعلي لقاع العين تحت المجهر الجراحي. على سبيل المثال ، يمكن التحقق من الاختراق الناجح لمجمع sclera-choroid-RPE ببساطة من خلال انعكاس ساطع نسبيا لطرف الإبرة عبر التصور عبر الحدقتين. الأهم من ذلك ، عند الاسترشاد بالتصور عبر الحدقة ، يمكن للمشغل تعديل زاوية وعمق الحقن بدقة وفقا للموضع النسبي بين الإبرة والهياكل التشريحية في شبكية العين المتلقية (على سبيل المثال ، أوعية الشبكية ورأس العصب البصري). علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي الإدارة الدقيقة للمواد باستخدام هذه التقنية إلى تقليل RPE وصدمة المشيمية والمضاعفات الجراحية الأخرى. في الواقع ، وجدنا أنه يمكن تقليل النزيف عن طريق تجنب المناورات على مقربة من الأوعية الدموية في شبكية العين بمساعدة التصور عبر الحدقتين.
ارتجاع الخلايا المانحة هو سبب رئيسي للفشل الجراحي بعد الحقن29,30. هناك العديد من العوامل المشاركة في تعزيز ارتجاع خلايا المتبرع. يعد ارتفاع ضغط العين (IOP) للعيون المتلقية الناجم عن مخاليط خلايا المتبرع المحقونة عاملا مهما يعزز ارتداد الخلايا خارج العين. يقلل بروتوكولنا من IOP للمتلقين عن طريق اختراق الغرفة الأمامية في بداية الجراحة ويمكن IOP من الانخفاض تلقائيا عن طريق خروج السائل المائي قبل سحب الإبرة الزجاجية من التجويف الزجاجي. العامل الثاني هو نفق الحقن غير المختوم في عيون المتلقين. لمنع ارتداد الكسب غير المشروع مرة أخرى عبر نفق الحقن ، نستخدم إبرة حقن دقيقة صغيرة الحجم (34G) لإنشاء نفق ذاتي الإغلاق عند اختراق جدار العين وملقط دقيق مسنن لتثبيت حواف فتحة النفق الخارجي عند سحب الإبرة. في عمليات الزرع التقليدية ، بالكاد يتم اكتشاف الطعوم المرتدة لأنها قد تحدث بسرعة أو تتبدد بسرعة. هيالورونات الصوديوم ، عند تطبيق غطاء الغطاء ، ينزلق دائما تقريبا من القرنية لتغطية معظم الأطراف والصلبة بما في ذلك موقع بضع التصلب. بعد حقن الخلايا ، يمكن أن تساعد هيالورونات الصوديوم في موقع بضع التصلب في إبطاء التدفق الأكبر للمحتويات المرتجلة ، إن وجدت ، وتساعد على جعلها قابلة للكشف بصريا تحت المجهر الجراحي. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا التحقق من عدم وجود ارتجاع من خلال تتبع ثبات الفقاعة تحت الشبكية لتعليق الخلايا والموقع داخل العين لورقة الشبكية باستخدام بروتوكولنا ، والذي قد يكون مفيدا للمختبرات التي لا يتوفر فيها التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT).
في حين نجا عدد كبير من الخلايا المستقبلة للضوء في صفائح الشبكية المزروعة ، لا يمكن اكتشاف أي اتجاه خلوي واضح أو اتجاه الصفيحة. على الرغم من أن تسليم صفائح الشبكية ثلاثية الأبعاد للحيوانات الكبيرة قد تم تأسيسه26،31،32 ، فإن الفضاء تحت الشبكية في الفئران ، إلى جانب عدم وجود قدرة تصوير شبكية أثناء العملية ، يجعل من الصعب للغاية ضمان الحفاظ على اتجاه الورقة أثناء الجراحة وكذلك في فترة ما بعد الجراحة مباشرة التي قد تصبح خلالها الخلايا أو الأوراق المزروعة غير مستقرة مع استعادة الفأر للإسعاف.
نحن نصف منصة جراحية عبر الصلبة مع توجيه الرؤية المباشرة عبر الحدقة لزراعة تحت الشبكية في متلقي الفئران. تتيح هذه المنصة دقة عالية للحقن ومعدل منخفض من المضاعفات الجراحية. تتيح هذه المنصة التوصيل الدقيق للجرعات المعروفة من الخلايا ، وهي سهلة التعلم نسبيا ، وتسهل التوصيل تحت الشبكية بالإضافة إلى الحقن داخل الشبكية أو داخل الجسم الزجاجي لأنواع مختلفة من العوامل العلاجية بما في ذلك العلاج الجيني.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من خلال التمويل التالي: NEI R01EY033103 (MSS) ، مؤسسة مكافحة العمى (MSS) ، مؤسسة Shulsky (MSS) ، صندوق جوزيف ألبرت حكيميان (MSS) ، مؤسسة Juliette RP Vision (YVL) ، أبحاث للوقاية من العمى (منحة غير مقيدة لمعهد ويلمر للعيون في جامعة جونز هوبكنز ومعهد كولين للعيون في كلية بايلور للطب). نشكر الدكتورة ماليا إدواردز (كلية الطب بجامعة جونز هوبكنز) على تفضلها بتوفير التدريب على المجهر.
Materials
| Artificial tears | CareAll | P31447-04 | |
| Coverslips (5mm in diameter) | Deckglaser | N/A | |
| Goat anti-GFP (FITC) | Abcam | Ab6662 | |
| Goat-anti-rabbit Cy3 | Invitrogen | A10520 | |
| Insulin syringe (30G) | Easy Touch | 08496-3015-11 | |
| Ketamine | VETone Zetamine | AH2017J | |
| Live Dead Viability Kit | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| Micro scissor | Harvard Apparatus | 72-8503 | |
| Micro smooth forceps | ASICO | AE-4360 | |
| Micro toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Microinjection needle (26G) | Hamilton | 7804-03 | |
| Microinjection needle (34G) | Hamilton | 207434 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7633-01 | |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Petri-dish (35 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB012920 | |
| Povidone-iodine (10%) | Betadine Solution | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride (0.5%) | Keeler | AX0500 | |
| Rabbit anti-recoverin | Millipore | Ab5585 | |
| Rabbit anti-S-opsin | Millipore | Ab5407 | |
| Sodium hyaluronate | Johnson & Johnson Vision | 10-2400-11 | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25-806 2PC | |
| Sterile needle (25G) | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical materials/reagents | |||
| Tropicamide ophthalmic solution | Henry Schein | 112-7192 | |
| Xylazine | AnaSed Injection | N/A |
References
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nat Biotechnol. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Sci Transl Med. 10 (435), (2018).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Sci Transl Med. 11 (475), (2019).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 1101-1106 (2013).
- Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E81-E90 (2016).
- Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig. Retina. 24 (1), 98-109 (2004).
- Klassen, H., et al. Progenitor cells from the porcine neural retina express photoreceptor markers after transplantation to the subretinal space of allorecipients. Stem Cells. 25 (5), 1222-1230 (2007).
- Das, T., et al. The transplantation of human fetal neuroretinal cells in advanced retinitis pigmentosa patients: results of a long-term safety study. Exp Neurol. 157 (1), 58-68 (1999).
- Humayun, M. S., et al. Human neural retinal transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 3100-3106 (2000).
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 209 (2017).
- Liu, Y. V., et al. Characterization and allogeneic transplantation of a novel transgenic cone-rich donor mouse line. Exp Eye Res. 210, 108715 (2021).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. 485 (7396), 99-103 (2012).
- Ortin-Martinez, A., et al. Photoreceptor nanotubes mediate the in vivo exchange of intracellular material. EMBO J. 40 (22), 107264 (2021).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Singh, M. S., et al. Transplanted photoreceptor precursors transfer proteins to host photoreceptors by a mechanism of cytoplasmic fusion. Nat Commun. 7, 13537 (2016).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods Mol Biol. 884, 53-69 (2012).
- Fang, Y., et al. Safety evaluation of subretinal injection of trypan blue in rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 22 (10), 2923-2933 (2018).
- Liu, Y. V., et al. Quantifiable in vivo imaging biomarkers of retinal regeneration by photoreceptor cell transplantation. Transl Vis Sci Technol. 9 (7), 5 (2020).
- Liu, Y. V., et al. Single-cell transcriptome analysis of xenotransplanted human retinal organoids defines two migratory cell populations of nonretinal origin. Stem Cell Reports. 18 (5), 1138-1154 (2023).
- Park, S., et al. Animal models of corneal endothelial dysfunction to facilitate development of novel therapies. Ann Transl Med. 9 (15), 1271 (2021).
- Li, X., et al. Acute ocular hypertension disrupts barrier integrity and pump function in rat corneal endothelial cells. Sci Rep. 7 (1), 6951 (2017).
- Chao, J. R., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal cells into the subretinal space of a non-human primate. Transl Vis Sci Technol. 6 (3), 4 (2017).
- Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells Dev. 28 (17), 1151-1166 (2019).
- Zhao, C., et al. Development of a refined protocol for trans-scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes. J Vis Exp. (126), e55220 (2017).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), e4286 (2012).
- Wongpichedchai, S., Weiter, J. J., Weber, P., Dorey, C. K. Comparison of external and internal approaches for transplantation of autologous retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (12), 3341-3352 (1992).
- Luo, Z., et al. Establishing a surgical procedure for rhesus epiretinal scaffold implantation with HiPSC-derived retinal progenitors. Stem Cells Int. 2018, 9437041 (2018).
- Luo, Z., et al. Biodegradable scaffolds facilitate epiretinal transplantation of hiPSC-Derived retinal neurons in nonhuman primates. Acta Biomater. 134, 289-301 (2021).
