ハイスループット糖鎖分析のためのマイクロアレイポリマープロファイリング(MAPP)

MAPP法の主な実験段階を 図1にまとめます。 1. サンプルの調製 注:ここでは、例示の目的で、この方法を植物組織に適用する。選ばれた植物は、 アラビカコーヒーノキ、 Allium sativum var. ophioscorodon、 およびいくつかのタイのマンゴー品種(Aokrong、Kam、Rad、Chokanan、Mamkamdang、Talabnak、Mahachanok、Nga)でした。植物は商業的重要性のために選ばれました。人間が消費するためのそれらの処理は、現在十分に活用されていない農業産業廃棄物を生成し、純粋な糖鎖を含む付加価値製品の供給源を提供する可能性があります。したがって、MAPPは、バイオプロスペクティングの目的で廃植物バイオマスの糖鎖組成を特徴付けるために適用されました。 植物材料を異なる組織(根、茎、葉など)に分離します。 植物組織を40°Cの熱風オーブンで12〜24時間乾燥させます(サンプルに応じて時間を増減します)。あるいは、サンプルを液体窒素で急速凍結し、その後~4日間凍結乾燥します。 乳棒と乳鉢、または各チューブにボールベアリングを備えた機械式組織ライザー( 材料表を参照)を使用して、サンプルを微粉末に均質化します。注:新鮮な植物組織の場合、均質化する前に乾燥または凍結乾燥することをお勧めします。一般に、乳棒と乳鉢による均質化は、ほとんどの乾燥サンプルで十分です。穀物、豆類、パスタなどの加工食品など、特に弾力性のあるサンプルの場合、液体窒素で急速凍結することで、サンプルの均質化の速度と効率を高めることができます。機械的均質化は、ほぼすべてのサンプルタイプに適合し、かなり高速で労働集約的ではなく、同じ機器(乳棒や乳鉢など)の繰り返し使用によるサンプルのクロスコンタミネーションのリスクを効果的に最小限に抑えることがわかりました。 2. アルコール不溶性残渣(AIR)の調製 1.5 mLの70%(v/v)エタノールを、50〜100 mgの風乾および均質化したサンプル材料に加えます。 完全にボルテックスして混合し、室温で10,000 x g で10分間遠心分離します。得られた上清をピペットで廃棄し、ペレットを保持します。 残りのペレットに、1.5 mLのメタノールとクロロホルム(1:1 [v/v])を加えます。上清をボルテックスし、遠心分離し、ステップ2.2に従って廃棄します。 残りのペレットに、1.5 mLの100%アセトンを加えます。上清をボルテックスし、遠心分離し、ステップ2.2に従って廃棄します。 得られたペレットをドラフトで一晩置いて残留アセトンを蒸発させるか、真空遠心分離機で乾燥させます。注意: AIR材料は、必要になるまで周囲温度で保管できます。 3. 糖鎖抽出 注:可能であれば、再懸濁を助けるために、各チューブにボールベアリングを備えた組織ライザーですべての抽出ステップを実行してください。組織ライザーが利用できない場合は、代わりに連続攪拌または振とうで抽出を行うことができます。これが不可能な場合は、抽出時間を延長する必要があります。 10 mg の AIR 材料に、pH 7.5 の 50 mM シクロヘキサンジアミン四酢酸(CDTA、 材料表を参照)を 30 μL/mg 添加します。 27Hzで2分間振とうし、続いて10Hzで2時間振とうします。 10,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 得られた上清を保持し、滅菌微量遠心チューブに加え、ロータリーシェーカーで4°Cで保存します。 残渣ペレットに、30 μL/mg 4 M NaOH + 0.1 % (w/v) NaBH4 を添加します。注意: NaBH4 は飲み込むと有毒です。個人用保護具(PPE)を使用してください。ドラフトの下で取り扱ってください。ほこりの形成を避けてください。ほこりを吸い込まないでください。製品を水に接触させないでください。 手順 3.2 から 3.3 を繰り返します。残留ペレットをdH2Oで2〜3回洗浄して、残留NaOHを除去します。 30 μL/mg セルラーゼ(できればGH5 エンド-1,4-β-グルカナーゼ、メーカーが推奨する適切な酵素バッファー中、材料 表を参照)をペレットに加え、酵素の最適温度で 16 時間インキュベートします。 サンプルを10,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。上清を保持し、洗浄された微量遠心チューブに移し、ロータリーシェーカーで4°Cで保存します。抽出したら、サンプルをできるだけ早く印刷する必要があります。 保存したすべての抽出物を、4°Cで10分間、10,000 x g で再度遠心分離します。注意: サンプルには微粒子や破片があってはなりません。必要に応じて、マイクロアレイ印刷の前に0.2μmスピンフィルターを通過させます。特に粘性のあるサンプルは、マイクロアレイのキャピラリーとプリントヘッドが目詰まりしやすいため、マイクロアレイ分析と互換性がありません。原則として、ユーザーは標準的な少量のピペットで印刷するすべてのサンプルをピペットでピペットできる必要があります。 4. 規格の作成 定義された糖鎖標準試料(表1)の溶液1 mg/mLを滅菌dH2Oで調製します。パキマンを標準物質として使用する場合は、代わりに 4 M NaOH に溶解し、可溶化後に氷酢酸で中和します。 調製した標準試料をロータリーシェーカーで4°Cで一晩保存し、完全に可溶化させます。 すべての標準試料を 10,000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離し、破片をペレット化します。得られた上清は、その後の印刷に使用されます。 5. マイクロアレイの印刷 グリセロール系バッファー(GSB;47%グリセロール、52.9%dH2O、0.06%Triton X-100、および0.04%殺生物剤[水中0.15%-0.17%硝酸第二銅および1.4%-2.0%硝酸マグネシウム]を混合)で1:20(v / v)希釈液を調製し、ろ過滅菌)( 材料表を参照)し、15,000 x g (室温)で10分間遠心分離します。注:インク溶液は、印刷されたマイクロアレイをメンブレン上で視覚的に検出できるように、印刷されたサンプルの周囲に上下の境界線を作成するために必要です。ただし、インク溶液には沈殿物が含まれている可能性があります。すべての溶液には印刷用の微粒子が含まれていない必要があるため、ピペッティング時に沈殿物を乱さないようにしてください。これが不可能になったら、廃棄して新鮮なものを準備します。溶液は、微粒子を除去するために簡単にろ過することはできません。 40 μL のインク溶液と GSB を最初の 384 ウェルプレートの最初のセクションに加えます(図 2)。 25 μL の GSB をすべての希釈 1(D1)ウェルに添加します。40 μL の GSB をすべての希釈倍率 2、3、4(D2-D4)ウェルに加えます。 抽出した糖鎖サンプルと定義糖鎖基質を 25 μL の糖鎖サンプルを D1 ウェルに順番に添加し、GSB で 1:1 (v/v) に希釈します。 D1ウェルから10 μLのサンプルを採取し、D2ウェルに添加して、各サンプルを4回段階希釈します。ピペットで静かに吸引して混ぜます。 D2ウェルから10 μLのサンプルを採取し、それをD3ウェルに添加して、このプロセスを繰り返します。 D4ウェルについても繰り返します。混合後、D4ウェルから10 μLを廃棄し、各ウェルに最終容量40 μLが含まれるようにします。 40 μLのインク溶液とGSBを最終プレートの最終ブロックに加えます。 プレートを粘着プレートカバーで覆い、3,000 x g (室温)で10分間遠心分離します。遠心分離後に気泡が残っていないことを確認し、必要に応じて繰り返します。 非接触圧電マイクロアレイ印刷ロボットを使用して、以下の手順に従ってサンプルをニトロセルロースメンブレン( 材料表を参照)に印刷します。注意: 以下は、最適な印刷品質のために推奨されるアクションです。ただし、必要な特定のパラメータは、最終的に使用する機器によって異なります。ユーザーは、機器の製造元に連絡して、デバイスに必要な適切なカスタマイズと印刷設定について話し合うことをお勧めします。印刷する前に、廃液バッファーリザーバーを空にし、必要に応じてクリーンバッファーリザーバーにクリーンなGSBを充填します。機器の電源を入れ、湿度と温度の制御システムが統合されている場合は、>10分間安定させます。マイクロアレイ装置のスイッチを入れ、システムを初期化します。注意: 機器の内圧を決定するためのテストを実行することをお勧めします。圧力が低すぎる場合は、高圧パージを実行する必要がある場合があります。繰り返しになりますが、機器の製造元に連絡して、特定の機器の特定の操作について話し合ってください。 プリントヘッドとキャピラリーをGSBで数回パージして、破片や潜在的な汚染物質を取り除きます。GSBのプレートを単独でロードするか、ロードされたプレートからのサンプル吸引をバイパスして、クリーンバッファーリザーバーから直接プリントするように機器を設定して、テストプリントを実行します。注意: ニトロセルロースメンブレンを使用してテスト印刷を実行する必要はありません。きれいな顕微鏡スライドで十分であり、サンプル印刷前にスポットサイズ、形状、品質を目視で評価できるという利点があります。 抽出した糖鎖サンプルをプリントする際は、各サンプル間でクリーンなGSBでフラッシュするようにシステムをプログラムしてください。注:通常、印刷スポットあたりのサンプル量は100 pL〜10 nLで、スポットサイズは選択したサンプル量に応じて20 μm〜100 μmの範囲です。1 つのソース 384 ウェルプレートから 100 個のマイクロアレイをプリントするには、システムフラッシングを含めて約 40 分かかります。結果として得られるマイクロアレイのサイズは約1cm2 になります。プレートを追加すると、プレートあたりアレイの長さが約1cm長くなります。印刷されたマイクロアレイ設計の概略図を 図3に示します。印刷後、マイクロアレイはすぐに使用でき、数年間保存することができます。印刷中にサンプルが蒸発する可能性があるため、何らかの理由で印刷ジョブを繰り返す必要がある場合は、新しいサンプルプレートをロードし、元のプレートを廃棄することをお勧めします。 週に一度、プリントヘッドとキャピラリーを徹底的に清掃してください。これを行うには、GSBに1:20希釈の濃NaOHを含む384ウェルをロードし、顕微鏡スライドに40分から1時間のプリントを実行します。ユーザーは、先に進む前に、この洗浄液が機器と互換性があることを確認する必要があります。 印刷されたマイクロアレイ用に作成された一意のグリッドファイル(.galファイル)を保存し、下流の分析の準備を整えます。 6. マイクロアレイの調査 ニトロセルロースメンブレンから個々の同一の印刷されたマイクロアレイを切り取り、プロービング用の適切なサイズの容器(12ウェルまたは24ウェルマイクロタイタープレートなど)に入れます( 材料表を参照)。アレイは容器の底面に平らに置く必要があります。プローブごとに 1 つのマイクロアレイが必要で、1 つのテクニカル レプリケートに相当します。 非特異的結合を低減するには、マイクロアレイをMP-TBSTブロッキングバッファー(1x Tris緩衝生理食塩水、pH 7.5、+ 0.1% [v/v] TWEEN 20 [TBST]、5%[w/v]脱脂粉乳を添加、 材料表を参照)中で1時間インキュベートします。ボリュームがアレイ全体を水没させるのに十分であることを確認してください。 インキュベーション後、MP-TBSTを取り外し、新しい容量のMP-TBSTと交換します。 1:10-1:1,000(メーカー指定、 材料表参照)に希釈したモノクローナル抗体(mAb)またはHisタグCBM、またはその他のGRMP(レクチンなど)と、MP-TBST中で回転/揺動シェーカー上で2時間インキュベートします。 インキュベーション後、分子プローブ溶液を除去し、アレイを清潔なTBSTで覆い、アレイが完全に水没していることを確認します。プローブの残留液を除去するには、すぐにTBSTを取り外し、新しいボリュームと交換します。アレイを回転/揺動シェーカーに5分間置きます。5分後、TBSTを取り外し、新しいボリュームと交換し、回転/ロッキングシェーカーの上に5分間置きます。メモ: このプロセスは、TBST の最初の追加と即時の削除を含めずに、3 回繰り返す必要があります。 アルカリホスファターゼ標識二次抗体(必要に応じて、抗マウス、抗ラット、抗ウサギ、抗His、材料 表を参照)をMP-TBSTで1:1,000希釈したアレイを、ロッキング/回転シェーカーで2時間インキュベートします。注:西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体も適しており、発色のためにテトラメチルベンジジン(TMB)/過酸化水素基質と組み合わせて使用します。 インキュベーション後、ステップ6.5に従って洗浄手順を繰り返し、非特異的に結合した二次抗体を除去します。 抗体結合の発色検出のために、アレイをニトロブルーテトラゾリウム(NBT)/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート(BCIP)発色溶液( 材料表を参照)で覆います。抗原結合部位に紫色の沈殿物スポットが発生するまで放置します(通常は5〜30分ですが、反応が急速に起こる可能性があるため、過飽和を避けるためにアレイを注意深く監視する必要があります)。注意: BCIPは皮膚に接触すると有害であり、呼吸器への刺激を引き起こす可能性があります。PPEを使用します。ほこりの形成を避けてください。ほこりを吸い込まないでください。 反応を終了するには、アレイをきれいな水道水に浸し、広範囲に洗浄します。 あぶらとり紙の間にアレイを置き、常温で一晩乾燥させます。 明らかな欠陥のあるアレイを廃棄し、そのような場合はプローブプロトコルを繰り返します(図4)。 7. 分析と定量化 デスクトップスキャナーを使用して、現像したアレイを2,400ドット/インチ(dpi)の解像度でスキャンします。画像をTIFFファイルに変換してから、ネガに変換します。 マイクロアレイ解析ソフトウェア( 材料表参照)を使用して、各マイクロアレイ画像に固有の.galグリッドファイルを重ね合わせ、各抗原結合部位で生成されたスポットの色強度を計算し、局所的な背景を差し引きます。 グリッド データを.txt ファイルとしてエクスポートします。これらは、分析のためにExcelシートに手動でインポートできます。 まず各サンプル希釈液でスポット強度を平均し、次に含まれる生物学的複製全体でスポット強度を平均することにより、各サンプルの平均スポットシグナル強度値を生成します。 最大平均スポット信号強度に値 100 を割り当て、それに応じて残りのデータを正規化します。注:正規化された平均スポットシグナル強度は、Excel33の条件付き書式関数、またはR ggplot2パッケージ40,41のgeom_tile関数を使用して、相対的な糖鎖エピトープ存在量のヒートマップとして表示できます。