JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Microarray Polymer Profiling (MAPP) voor high-throughput glycaananalyse

Published: September 29, 2023
doi:
10.3791/65443
, , ,
1Department of Biology, School of Natural and Environmental Sciences,Newcastle University, 2Institute of Microbiology and Infection, College of Medical and Dental Sciences,University of Birmingham, 3Department of Plant and Soil Sciences, Faculty of Agriculture,Chiang Mai University

Summary

Microarray polymer profiling (MAPP) is een high-throughput techniek voor samenstellingsanalyse van glycanen in biologische monsters.

Abstract

Microarray-polymeerprofilering (MAPP) is een robuuste en reproduceerbare benadering om systematisch de samenstelling en relatieve overvloed van glycanen en glycoconjugaten te bepalen in een verscheidenheid aan biologische monsters, waaronder planten- en algenweefsels, voedselmaterialen en menselijke, dierlijke en microbiële monsters. Microarray-technologie ondersteunt de werkzaamheid van deze methode door een geminiaturiseerd, high-throughput screeningplatform te bieden, waardoor duizenden interacties tussen glycanen en zeer specifieke glycaangerichte moleculaire sondes gelijktijdig kunnen worden gekarakteriseerd, met behulp van slechts kleine hoeveelheden analyten. Samenstellende glycanen worden chemisch en enzymatisch gefractioneerd, voordat ze achtereenvolgens uit het monster worden geëxtraheerd en direct op nitrocellulosemembranen worden geïmmobiliseerd. De glycaansamenstelling wordt bepaald door de bevestiging van specifieke glycaan-herkennende moleculaire sondes aan de afgeperste en geprinte moleculen. MAPP is complementair aan conventionele glycaananalysetechnieken, zoals monosaccharide- en koppelingsanalyse en massaspectrometrie. Glycaan-herkennende moleculaire sondes geven echter inzicht in de structurele configuraties van glycanen, wat kan helpen bij het ophelderen van biologische interacties en functionele rollen.

Introduction

Glycanen zijn alomtegenwoordig in alle domeinen van het leven en vertonen een ongeëvenaarde diversiteit in structuur en functie in vergelijking met anderemacromoleculen. Vanwege hun complexiteit, variabiliteit in biosynthese en glycosidische bindingen, en het gebrek aan geschikte methoden voor het ontleden van glycaanstructuren, is ons begrip van deze diversiteit in structuren en functies echter relatief beperkt2.

Veel glycaananalysetechnieken zijn destructief en vereisen de afbraak van glycanen in hun samenstellende monosachariden, wat relevante driedimensionale en biologische contexten kan verdoezelen3. Omgekeerd herkennen en binden monoklonale antilichamen (mAb’s), koolhydraatbindende modules (CBM’s), lectines, virale agglutininen en microbiële adhesines, gezamenlijk bekend als glycaan-herkennende moleculaire probes (GRMP’s)4, specifieke epitopen en kunnen ze worden gebruikt als hulpmiddelen om glycanen binnen complexe multi-glycaanmatrices te detecteren en te onderscheiden 5,6.

Hier presenteren we microarray polymer profiling (MAPP), een snelle, veelzijdige en niet-destructieve methode voor glycaananalyse die toepasbaar is op een breed spectrum van biologische monsters. De methode heeft tot doel een robuuste en high-throughput technologie te bieden voor het analyseren van glycanen uit diverse biologische en industriële/commerciële systemen. MAPP verenigt de herkenningsspecificiteit van glycaangerichte moleculaire sondes met reproduceerbare, hoogwaardige microarray-screeningtechnologie om duizenden moleculaire interacties parallel te kunnen profileren. De output van deze aanpak is diagnostisch inzicht in de samenstelling en relatieve abundantie van glycanen in een monster of weefsel van belang.

MAPP kan worden gebruikt als een onafhankelijke, op zichzelf staande methode, of in combinatie met andere biochemische technieken, zoals immunofluorescentiemicroscopie 7,8,9 en monosaccharide- of koppelingsanalyse 10,11. De techniek kan ook worden gebruikt om epitoopspecifieke kenmerken van nieuwe GRMP’s in kaart te brengen, met behulp van arrays die zijn geprint met zuivere en structureel goed gedefinieerde oligosaccharidestandaarden12. Een groot voordeel van MAPP ten opzichte van andere methoden, zoals enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), is de compatibiliteit met kleine monstervolumes13,14. Bovendien biedt MAPP een analyse met een aanzienlijk hogere doorvoer15 en biedt het een effectieve vorm van monsterbewaring, aangezien geprinte monsters droog en stabiel zijn wanneer ze op nitrocellulose worden geïmmobiliseerd16.

De binding van GRMP’s is over het algemeen afhankelijk van de aanwezigheid van een aantal aaneengesloten suikerresiduen die samen een bindingsplaats (epitoop) vormen die uniek is voor een bepaalde polysaccharideklasse (xylaan, mannan, xyloglucaan, enz.) 17. De afzonderlijke suikerresiduen (xylose, mannose, glucose) die worden gekwantificeerd met behulp van de meeste biochemische technieken, bijvoorbeeld monosaccharidesamenstelling of methyleringsanalyse, kunnen daarentegen componenten zijn van meerdere polysaccharideklassen en dus moeilijk toe te wijzen18.

MAPP is ontwikkeld als reactie op een technologische kloof, namelijk de mogelijkheid om snel meerdere glycanen uit verschillende bronnen te analyseren met behulp van kleine hoeveelheden materiaal. MAPP maakt gebruik van het uitgebreide repertoire van GRMP’s dat in de afgelopen drie decennia is ontwikkeld en gekarakteriseerd 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. De ontwikkeling van MAPP is een iteratief proces geweest, waarbij de techniek gestaag is verfijnd en geoptimaliseerd. Er is nu een aanzienlijke hoeveelheid literatuur die de toepassing van MAPP beschrijft op verschillende natuurlijke en industriële systemen waar glycanen een centrale rol spelen 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. Hier beschrijven we de huidige stand van de techniek voor MAPP.

Protocol

De belangrijkste experimentele fasen van de MAPP-methode zijn samengevat in figuur 1. 1. Bereiding van de monsters OPMERKING: Hier wordt de methode ter illustratie toegepast op plantenweefsels. De geselecteerde planten waren Coffea arabica, Allium sativum var. ophioscorodon en verschillende Thaise mangovariëteiten (Aokrong, Kam, Rad, Chokanan, Mamkamdang, Talabnak, Mahachanok en Nga). De planten zijn geselecteerd op hun commerciële belang. De verwerking ervan voor menselijke consumptie genereert momenteel onderbenut agro-industrieel afval, dat een bron kan zijn van producten met toegevoegde waarde, waaronder pure glycanen. Zo werd MAPP toegepast om de glycaansamenstelling van de biomassa van afvalplanten te karakteriseren voor bioprospectiedoeleinden. Scheid het plantmateriaal in verschillende weefsels (bijv. wortel, stengel en bladeren). Droog de plantenweefsels gedurende 12-24 uur in een heteluchtoven bij 40 °C (verkort/verleng de tijd in overeenstemming met het monster). U kunt de monsters ook snel invriezen in vloeibare stikstof en vervolgens ~4 dagen lyofiliseren. Homogeniseer de monsters tot een fijn poeder met behulp van een vijzel of een mechanische weefsellyser (zie Materiaaltabel) met een kogellager in elke buis.OPMERKING: Voor vers plantenweefsel wordt drogen of lyofiliseren voorafgaand aan homogenisatie aanbevolen. Over het algemeen is homogenisatie met een vijzel voldoende voor de meeste droge monsters. Voor bijzonder veerkrachtige monsters, zoals granen, peulvruchten en bewerkte voedingsmiddelen zoals pasta, kan snel invriezen in vloeibare stikstof de snelheid en efficiëntie van monsterhomogenisatie verhogen. We hebben ontdekt dat mechanische homogenisatie compatibel is met bijna alle soorten monsters, aanzienlijk sneller en minder arbeidsintensief is en het risico op kruisbesmetting van monsters door herhaald gebruik van dezelfde apparatuur (d.w.z. stamper en vijzel) effectief minimaliseert. 2. Bereiding van in alcohol onoplosbaar residu (AIR) Voeg 1,5 ml 70% (v/v) ethanol toe aan 50-100 mg aan de lucht gedroogd en gehomogeniseerd monstermateriaal. Draai grondig om te mengen en centrifugeer vervolgens op 10.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het resulterende supernatans weg met een pipet en bewaar de pellet. Voeg aan de resterende pellet 1,5 ml methanol en chloroform toe (1:1 [v/v]). Vortex, centrifugeer en gooi het supernatant weg, zoals beschreven in stap 2.2. Voeg aan de resterende pellet 1,5 ml 100% aceton toe. Vortex, centrifugeer en gooi het supernatant weg, zoals beschreven in stap 2.2. Plaats de resulterende pellet een nacht in een zuurkast om de resterende aceton te laten verdampen of in een vacuümcentrifuge tot hij droog is.NOTITIE: AIR-materiaal kan bij kamertemperatuur worden bewaard totdat het nodig is. 3. Glycaanextractie OPMERKING: Voer indien mogelijk alle extractiestappen uit in een weefsellyser met een kogellager in elk buisje om resuspensie te bevorderen. Als er geen weefsellyser beschikbaar is, kunnen extracties in plaats daarvan worden uitgevoerd met continu roeren of schudden. Het kan nodig zijn om de extractietijd te verlengen als dit niet mogelijk is. Voeg aan 10 mg AIR-materiaal 30 μl/mg 50 mM cyclohexaandiaminetetra-azijnzuur (CDTA; zie materiaaltabel), pH 7,5 toe. Schud op 27 Hz gedurende 2 min, gevolgd door 10 Hz gedurende 2 uur. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Bewaar het resulterende supernatant, voeg het toe aan een steriele microcentrifugebuis en bewaar het bij 4 °C op een roterende schudder. Voeg aan de resterende pellet 30 μL/mg 4 M NaOH + 0,1 % (m/v) NaBH4 toe.LET OP: NaBH4 is giftig bij inslikken. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM’s). Handvat onder een zuurkast. Vermijd stofvorming. Vermijd het inademen van stof. Zorg ervoor dat het product niet in contact komt met water. Herhaal stap 3.2 tot en met 3.3. Was de resterende pellet twee of drie keer met dH2O om de resterende NaOH te verwijderen. Voeg 30 μl/mg cellulase (bij voorkeur GH5-endo-1,4-β-glucanase, in een geschikte enzymbuffer – zoals aanbevolen door de fabrikant; zie tabel met materialen) toe aan de pellet en incubeer gedurende 16 uur bij de optimale temperatuur van het enzym. Centrifugeer de monsters bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C . Bewaar het supernatant, breng over naar schone microcentrifugebuisjes en bewaar bij 4 °C op een roterende schudder. Eenmaal geëxtraheerd, moeten de monsters zo snel mogelijk worden afgedrukt. Centrifugeer alle opgeslagen extracten opnieuw bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.NOTITIE: De monsters moeten vrij zijn van deeltjes en vuil. Passeer indien nodig een spinfilter van 0,2 μm voordat u met microarray print. Bijzonder viskeuze monsters zijn niet compatibel met microarray-analyse, omdat de capillairen van de microarrayer en de printkop gemakkelijk verstopt kunnen raken. Als algemene regel geldt dat gebruikers alle monsters die bedoeld zijn om te printen moeten kunnen pipetten met een standaard pipet voor kleine volumes. 4. Opstellen van normen Bereid oplossingen van 1 mg/ml volgens bepaalde glycaanstandaarden (tabel 1) in steriele dH2O. Als pachyman als standaard wordt gebruikt, in plaats daarvan oplossen in 4 M NaOH en na solubilisatie neutraliseren met ijsazijn. Bewaar de voorbereide standaarden een nacht bij 4 °C op een roterende schudder om volledige oplosbaarheid mogelijk te maken. Centrifugeer alle standaarden gedurende 10 minuten bij 10.000 x g bij 4 °C om eventueel vuil te pelleteren. Het resulterende supernatans wordt gebruikt voor het latere afdrukken. 5. Microarray-afdrukken Bereid een verdunning van 1:20 (v/v) van zwarte Oost-Indische inkt/tekeninkt in glycerolsysteembuffer (GSB; combineer 47% glycerol, 52,9% dH2O, 0,06% Triton X-100 en 0,04% biocide [0,15%-0,17% koper(II)nitraat en 1,4%-2,0% magnesiumnitraat in water] en filter steriliseren) (zie materiaaltabel) en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 15.000 x g (kamertemperatuur).OPMERKING: Inktoplossing is nodig om een boven- en onderrand rond de geprinte monsters te creëren, zodat de geprinte microarrays visueel op het membraan kunnen worden gedetecteerd. De inktoplossing bevat echter waarschijnlijk bezinksel. Alle oplossingen moeten vrij zijn van deeltjes om te printen, dus vermijd verstoring van het bezinksel tijdens het pipetteren. Gooi weg en bereid vers wanneer dit niet meer mogelijk is. De oplossing kan niet gemakkelijk worden gefilterd om deeltjes te verwijderen. Voeg 40 μl inktoplossing en GSB toe aan het eerste deel van de eerste plaat met 384 putjes (afbeelding 2). Voeg 25 μL GSB toe aan alle verdunningsputjes 1 (D1). Voeg 40 μL GSB toe aan alle verdunningsputjes 2, 3 en 4 (D2-D4). Verdun de geëxtraheerde glycaanmonsters en gedefinieerde glycaansubstraten 1:1 (v/v) met GSB door 25 μL geëxtraheerd glycaanmonster in volgorde aan de D1-putjes toe te voegen. Verdun elk monster vier keer serieel door 10 μl van het monster uit het D1-putje te nemen en toe te voegen aan het D2-putje. Zuig voorzichtig op met een pipet om te mengen. Herhaal het proces door 10 μL monster uit het D2-putje te nemen en dit toe te voegen aan het D3-putje. Herhaal dit voor de D4 goed. Gooi na het mengen 10 μl uit het D4-putje weg, zodat elk putje een eindvolume van 40 μl bevat. Voeg 40 μL inktoplossing en GSB toe aan het laatste blok van de uiteindelijke plaat. Dek de platen af met een zelfklevende plaatafdekking en centrifugeer gedurende 10 minuten op 3.000 x g (kamertemperatuur). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen achterblijven na het centrifugeren en herhaal indien nodig. Gebruik een contactloze piëzo-elektrische microarray-printrobot om de monsters op het nitrocellulosemembraan af te drukken (zie Materiaaltabel) volgens de onderstaande stappen.OPMERKING: Hieronder worden acties aanbevolen voor een optimale afdrukkwaliteit; De specifieke parameters die nodig zijn, zullen echter uiteindelijk afhangen van het gebruikte instrument. We raden gebruikers aan contact op te nemen met de fabrikant van het instrument om de juiste aanpassingen en afdrukinstellingen voor hun apparaat te bespreken.Leeg voor het afdrukken het afvalbufferreservoir en vul het schone bufferreservoir indien nodig met schoon GSB. Schakel het instrument in en laat het gedurende >10 minuten stabiliseren als het een geïntegreerd vochtigheids- en temperatuurregelsysteem heeft. Schakel de microarrayer in en initialiseer het systeem.NOTITIE: Het wordt aanbevolen om een test uit te voeren om de interne druk van het instrument te bepalen. Als de druk te laag is, kan het nodig zijn om een hogedrukreiniging uit te voeren. Neem opnieuw contact op met de fabrikant van het instrument om de specifieke werking van het specifieke instrument te bespreken. Ontlucht de printkop en capillairen meerdere keren met GSB om vuil en mogelijke verontreinigingen te verwijderen. Voer een testafdrukrun uit door alleen een plaat GSB te laden of door het instrument in te stellen om rechtstreeks vanuit het schone bufferreservoir af te drukken, waarbij de monsteraspiratie van een geladen plaat wordt omzeild.NOTITIE: Het is niet nodig om de testafdruk uit te voeren met behulp van een nitrocellulosemembraan; Schone microscoopglaasjes zijn voldoende en bieden het voordeel dat de spotgrootte, vorm en kwaliteit visueel kunnen worden beoordeeld voordat het monster wordt afgedrukt. Wanneer u geëxtraheerde glycaanmonsters afdrukt, programmeert u het systeem om tussen elk monster te spoelen met schone GSB.OPMERKING: Doorgaans is het monstervolume per afgedrukte vlek 100 ml tot 10 nL en varieert de spotgrootte van 20 μm tot 100 μm, afhankelijk van het geselecteerde monstervolume. Het printen van 100 microarrays vanaf één bronplaat met 384 putjes duurt ongeveer 40 minuten, inclusief systeemspoeling. De resulterende microarrays zullen ongeveer 1cm2 groot zijn. Extra platen vergroten de lengte van de array met ongeveer 1 cm per plaat. Een schema van het geprinte microarray-ontwerp is weergegeven in figuur 3. Eenmaal geprint, zijn de microarrays direct klaar voor gebruik en kunnen ze meerdere jaren worden bewaard. Als de afdruktaak om welke reden dan ook moet worden herhaald vanwege de mogelijke verdamping van monsters tijdens het afdrukken, wordt aanbevolen om een nieuwe monsterplaat te plaatsen en de originele plaat weg te gooien. Reinig eenmaal per week de printkop en de haarvaten grondig. Doe dit door een 384-putje met een verdunning van 1:20 geconcentreerd NaOH in GSB te laden en een afdrukrun van 40 minuten tot 1 uur uit te voeren op microscoopglaasjes. Gebruikers moeten ervoor zorgen dat deze reinigingsoplossing compatibel is met hun instrument voordat ze verder gaan. Sla het unieke rasterbestand (.gal-bestand) op dat voor de geprinte microarray is geproduceerd, klaar voor downstream-analyse. 6. Microarray-onderzoek Knip afzonderlijke, identieke geprinte microarrays uit het nitrocellulosemembraan en plaats ze in een vat van de juiste grootte om te sonderen (bijv. een microtiterplaat met 12 of 24 putjes) (zie Materiaaltabel). De array moet plat op de bodem van het schip liggen. Per sonde is één microarray nodig en dit vertegenwoordigt één technische replicatie. Om niet-specifieke binding te verminderen, incubeert u de microarrays gedurende 1 uur in MP-TBST-blokkeerbuffer (1x Tris-gebufferde zoutoplossing, pH 7,5, + 0,1% [v/v] TWEEN 20 [TBST] en aangevuld met 5% [w/v] magere melkpoeder; zie Materiaaltabel) op een roterende/schommelende shaker. Zorg ervoor dat het volume voldoende is om de hele array onder te dompelen. Verwijder na incubatie de MP-TBST en vervang deze door een nieuw volume MP-TBST. Incubeer de arrays met monoklonale antilichamen (mAbs) of His-gelabelde CBM’s, of andere GRMP’s (bijv. lectines), verdund 1:10-1:1.000 (zoals gespecificeerd door de fabrikant; zie Materiaaltabel) in MP-TBST gedurende 2 uur op een roterende/schommelende shaker. Verwijder na incubatie de moleculaire sondeoplossing en bedek de arrays met schone TBST, waarbij u ervoor zorgt dat de arrays volledig zijn ondergedompeld. Om de resterende sondeoplossing te verwijderen, verwijdert u onmiddellijk de TBST en vervangt u deze door een nieuw volume. Plaats de arrays gedurende 5 minuten op een roterende/schommelende shaker. Verwijder na 5 minuten de TBST, vervang deze door een nieuw volume en plaats deze gedurende 5 minuten op een roterende/schommelende shaker.OPMERKING: Dit proces moet drie keer worden herhaald, exclusief de eerste toevoeging en onmiddellijke verwijdering van TBST. Incubeer de arrays met alkaline-fosfatase geconjugeerde secundaire antilichamen (anti-muis, anti-rat, anti-konijn, anti-His, indien van toepassing; zie Materiaaltabel) verdund 1:1.000 in MP-TBST gedurende 2 uur op een schommelende/roterende shaker.OPMERKING: Mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen zijn ook geschikt, gebruikt in combinatie met tetramethylbenzidine (TMB)/waterstofperoxidesubstraat voor kleurontwikkeling. Herhaal na de incubatie de wasprocedure, zoals beschreven in stap 6.5, om niet-specifiek gebonden secundaire antilichamen te verwijderen. Bedek de arrays met nitro-blauw tetrazolium (NBT)/5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat (BCIP) kleurontwikkelingsoplossing (zie Materiaaltabel) voor de chromogene detectie van antilichaambinding. Laat staan totdat zich paarse neerslagvlekken ontwikkelen op de antigeenbindingsplaatsen (meestal 5-30 minuten, maar de arrays moeten nauwlettend in de gaten worden gehouden om oververzadiging te voorkomen, omdat de reactie snel kan optreden).LET OP: BCIP is schadelijk bij contact met de huid en kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Gebruik PBM’s. Vermijd stofvorming. Vermijd het inademen van stof. Om de reactie te beëindigen, dompelt u de arrays onder in schoon kraanwater en wast u ze uitgebreid. Plaats de arrays een nacht tussen vloeipapier bij kamertemperatuur om te drogen. Gooi de arrays met duidelijke defecten weg en herhaal in dergelijke gevallen het tasterprotocol (Afbeelding 4). 7. Analyse en kwantificering Scan de ontwikkelde arrays met een resolutie van 2.400 dots per inch (dpi) met behulp van een desktopscanner. Converteer de afbeeldingen naar TIFF-bestanden en vervolgens naar negatieven. Met behulp van microarray-analysesoftware (zie Materiaaltabel) legt u het unieke .gal-rasterbestand over elke microarray-afbeelding om de kleurintensiteit van de spot te berekenen die op elke antigeenbindingsplaats wordt geproduceerd en trekt u de lokale achtergrond af. Exporteer de rastergegevens als een .txt bestand. Deze kunnen vervolgens handmatig worden geïmporteerd in een Excel-sheet voor analyse. Genereer een gemiddelde spotsignaalintensiteitswaarde voor elk monster door het gemiddelde te nemen van de spotintensiteit, eerst over elke monsterverdunning en vervolgens over eventuele biologische replicaten. Wijs een waarde van 100 toe aan de hoogste gemiddelde intensiteit van het spotsignaal en normaliseer de resterende gegevens dienovereenkomstig.OPMERKING: Genormaliseerde gemiddelde spotsignaalintensiteiten kunnen vervolgens worden gepresenteerd als een heatmap van de relatieve overvloed aan glycaanepitoop met behulp van de voorwaardelijke opmaakfunctie in Excel33 of met behulp van de geom_tile-functie in R ggplot2-pakket40,41.

Representative Results

MAPP werd toegepast om de glycaansamenstelling te bepalen van agrarisch biomassa-afval, bestaande uit mangoschillen van verschillende Noord-Thaise variëteiten, Coffea arabica-kersenpulp en koffiebonenverwerkingsafval, en wortel-, stengel- en bladweefsel van Thaise zwarte knoflook, Allium sativum var. Verschillende plantaardige polysacchariden worden in de voedingsindustrie gebruikt als functionele ingrediënten42,43. Het doel van dit experiment was dus om af te leiden of deze overvloedige en momenteel onderbenutte agro-industriële afvalstoffen een bron van zuivere polysachariden met toegevoegde waarde kunnen zijn. AIR-materiaal wordt routinematig gebruikt om monsters voor te bereiden die bedoeld zijn voor glycaananalyse44. Er zijn verschillende voordelen aan het gebruik van AIR; behandeling met oplosmiddelen verwijdert effectief endogene CAZymes, metabolieten, kleine sachariden, lipiden en pigmenten, wat resulteert in monsters verrijkt met polysacchariden en structurele eiwitten34. Bovendien is het produceren van AIR een snelle en effectieve manier om de levensduur van het monster te verlengen, omdat het thermostabiel is en meerdere jaren kan worden bewaard. Drie gemengde fracties van samenstellende glycanen werden achtereenvolgens geëxtraheerd uit plantaardig AIR-materiaal met behulp van CDTA, NaOH en cellulase. CDTA chelaat Ca2+ -ionen, die de verwijdering van Ca2+ verknoopte ontesterde pectines uit de celwanden van planten mogelijk maken45. Onder alkalische omstandigheden kunnen voornamelijk hemicelluloses, zoals mannan, xylaan en β-glucaan, vrijkomen als gevolg van de verstoring van de waterstofbinding en de verzeping van esterbindingen tussen cellulosemicrofibrillen en hemicellulose, respectievelijk lignine en hemicellulose46. Een recombinant endo-1,4-β-glucanase van Bacillus spp. werd gebruikt om amorfe gebieden van de structurele cellulosemicrofibrillen af te breken, waarbij resterende glycanen vrijkwamen die gebonden waren aan cellulose in de celwanden47. Hoewel deze methode glycanen effectief in deze drie brede groepen scheidt, moet worden opgemerkt dat de monsters niet zuiver zijn; door de aard van de extractiemethode zal hemicellulose, indien aanwezig in het monster, onvermijdelijk worden geëxtraheerd en vervolgens in verschillende mate worden gedetecteerd in de CDTA- en cellulasefracties. Evenzo zal enige pectine worden gedetecteerd in de NaOH-extractie als deze in het monster aanwezig is. Een contactloze, piëzo-elektrische microarray-printrobot werd gebruikt om geëxtraheerde glycaanfracties op nitrocellulose te immobiliseren via niet-covalente bijlage11, waardoor 300 identieke microarrays werden gevormd. Gedefinieerde glycaanstandaarden (tabel 1) werden ook opgenomen in de geprinte microarrays als positieve controles (figuur 5). Het MAPP-bindingsprofiel verkregen voor de geselecteerde glycaanstandaarden komt overeen met eerder gerapporteerde epitoopspecificiteiten. LM21 vertoonde bijvoorbeeld een sterke binding aan meerdere mannanpolysacchariden (galactomannaan en glucomannan), terwijl LM22 slechts een zwakke binding aan galactomannan25 vertoonde. Evenzo LM19 bij voorkeur gebonden aan gede-esterd homogalacturonan48 en LM15 gebonden aan tamarindezaad xyloglucan23. De relatieve abundantie van 16 epitopen, diagnostisch voor niet-cellulose-polysachariden van plantencelwanden, werd gedetecteerd door de gehechtheid van glycaangerichte monoklonale antilichamen (tabel 2) aan gedrukte extracten (figuur 6). De meerderheid van de geëxtraheerde glycanen werd gedetecteerd in de alkalische NaOH-fractie. Sterke bindingssignalen werden geregistreerd voor mAbs LM10 en LM11, die xylaan/arabinoxyl vertegenwoordigen, in de schillen van alle geteste mangovariëteiten. In de knoflookmonsters bonden LM10 en LM11 bij voorkeur aan wortelweefselextract (Garlic R) en vertoonden ze slechts een zwakke binding aan het bladweefselextract (Garlic L). LM19, dat staat voor gedeeltelijk methylveresterd of niet-veresterd homogalacturonan, sterk gebonden aan sommige extracten van mangovariëteiten (Aokrong en Talabnak), maar slechts zwak gebonden, of de binding was niet detecteerbaar, in andere variëteiten (Chokanan, Mamkamdang, Mahachanok en Nga). Bovendien bond LM19 zich alleen aan de koffiepulpfracties en niet aan het afvalmateriaal van de koffieboonverwerking, waarvan eerder werd gedacht dat het bestond uit halfgezuiverde koffiepectine (niet-gepubliceerde gegevens). Figuur 1: Belangrijke experimentele stappen in de MAPP-methode. (A) De monsters worden gehomogeniseerd om fijne poeders te vormen. (B) De gehomogeniseerde monsters worden verwerkt om hun JUV’s te isoleren. (C) De samenstellende glycanen worden achtereenvolgens geëxtraheerd met behulp van een op maat gemaakt extractieregime. (D) De geëxtraheerde glycaanfracties, inkt en GSB worden overgebracht naar platen met 384 putjes, volgens de plaatlay-out, om op nitrocellulose te worden afgedrukt. (E) De geprinte microarrays worden gesondeerd met geselecteerde GRMP’s. (F) GRMP-binding aan de geprinte glycaanfracties wordt gekwantificeerd en geanalyseerd voordat de gegevens als een heatmap worden gepresenteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Voorbeeld van een plaatlay-out met 384 putjes voor het laden van monsters, inkt en GSB met vier verdunningen per geëxtraheerd glycaanmonster/standaard. Verschillende kleuren duiden monsters aan die afkomstig zijn van verschillende extractiereagentia, terwijl verschillende tinten seriële verdunningen vertegenwoordigen. Het eerste getal in de code staat voor het monsternummer, terwijl het eindgetal staat voor het verdunningsgetal (D1 staat voor verdunning één, D2 voor verdunning twee, enzovoort). Een goed gelabeld ’12D3′ vertegenwoordigt bijvoorbeeld glycaanmonster 12, verdunning drie. Putplaten moeten worden verdeeld in acht identieke secties bestaande uit zes kolommen en acht rijen. Het eerste deel van de eerste plaat moet alleen inkt en buffer bevatten en lijken op de voorbeeldplaatlay-out. Geëxtraheerde glycaanmonsters kunnen vervolgens in volgende plaatsecties worden geladen volgens de plaatlay-out. Verschillende extractiereagentia mogen niet in hetzelfde plaatgedeelte worden geplaatst. Als er onvoldoende monsters zijn om een hele sectie te vullen, vul dan alle resterende putten in die sectie met buffer; Laat geen putten leeg. Als er meerdere platen nodig zijn, moet de volgende sectie nadat alle monsters zijn geladen drie afwisselende kolommen inkt bevatten en GSB – dit is mogelijk niet sectie acht, afhankelijk van het aantal monsters dat wordt afgedrukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Schematische weergave van het geprinte microarray-ontwerp. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4: Representatieve microarrays. (A) Geen binding. (B) Het bindingssignaal wordt verduisterd door een hoog achtergrondsignaal. (C) Gegeneraliseerde blauw/paarse kleuring als gevolg van oververzadiging met NBT/BCIP. (D) Gebrekkig tasten als gevolg van hoge substraatconcentratie. (E) Defecte afdruk als gevolg van de onschone printkop. (F) Sterke binding aan weinig monsters. (G) Sterke binding aan vele monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Monoklonale antilichaambinding aan gedefinieerde glycaanstandaarden, opgenomen om het print- en sonderingsproces te valideren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: MAPP van glycanen gewonnen uit agrarisch biomassa-afval. De monsters omvatten koffiepulpafval (koffiepulp en koffiepectine), mangoschillen van verschillende Thaise variëteiten (AO, Aokrong; KO, Kam; RD, Rad; CH, Chokanan; MA, Mamkamdang; TL, Talabnak; MH, Mahachanok; NG, Nga) en zwarte knoflookbladeren (Garlic L), stengel (Garlic S), bol (Garlic BG) en wortels (Garlic R), met behulp van CDTA, NaOH en cellulase (Bacillus spp. cellulase 5A). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Tabel 1: Gedefinieerde commerciële polysaccharidestandaarden die in de MAPP-analyse worden gebruikt als positieve controles. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 2: Glycaangerichte monoklonale antilichamen geselecteerd voor de ondervraging van geëxtraheerde plantaardige glycaanmicroarrays. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

De hier beschreven MAPP-techniek is nu een gevestigde methode voor glycaananalyse. De basisprincipes werden voor het eerst beschreven in 200711, maar de techniek heeft een voortdurende ontwikkeling ondergaan om te profiteren van de nieuwste innovaties op het gebied van microarray-technologie, de ontwikkeling van moleculaire sondes en vooruitgang in ons begrip van de biochemie van glycaan. Over het algemeen zijn glycanen, met name polysachariden, moeilijker te analyseren dan eiwitten en nucleotiden vanwege hun structurele complexiteit en heterogeniteit45, evenals het feit dat ze niet gemakkelijk kunnen worden gesequenced of gesynthetiseerd1. In veel gevallen kan geen enkele techniek de complexiteit van glycaan definitief ontcijferen; daarom wordt MAPP vaak gebruikt met andere methoden. Dit is een van de redenen waarom AIR-preparaat meestal wordt gekozen als uitgangspunt voor MAPP, aangezien AIR compatibel is met de meeste andere glycaananalysemethoden34, waardoor de latere vergelijking van datasets wordt vergemakkelijkt.

Door homogenisatie van het monster voorafgaand aan de AIR-bereiding gaat steevast een deel van de ruimtelijke informatie verloren. Aangezien polysacchariden echter achtereenvolgens uit monsters worden vrijgegeven, geeft de aanwezigheid van epitopen in de verkregen fracties informatie over de moleculaire architectuur en samenstelling van dat monster17. Het selecteren van een geschikt extractieregime is dus van cruciaal belang voor het succes van de methode. Meerdere parameters bepalen de geschiktheid van de extractiemethode: celstructuur, tijd, temperatuur, pH, druk, ionische sterkte van het oplosmiddel en fijnheid van het monster van vaste deeltjes49. Het wordt aanbevolen om een reeks steeds agressievere oplosmiddelen te gebruiken om de kans op succesvolle extractie van samenstellende glycanen te maximaliseren en een representatief samenstellingsbeeld van het monster op te bouwen. Voor de meeste monsters zijn CDTA, NaOH en cellulase voldoende om van planten afkomstige opslag- en celwandpolysacchariden 33,50,51,52 te verwijderen. Voor sommige weefselmonsters is aangetoond dat een hybride extractieregime dat ook CaCl2, HCl en Na2CO3 omvat, succesvol is53, terwijl mariene microalgenmonsters de toevoeging van ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)10 kunnen vereisen.

Microarrays moeten een reeks zuivere, gedefinieerde glycaanstandaarden bevatten die als positieve controles kunnen worden gebruikt5. De opgenomen normen moeten worden aangepast aan de aard van het monster. Eenmaal afgedrukt, moeten de juiste GRMP’s worden geselecteerd. Het genereren van hybridoma-mAbs tot polysaccharidestructuren is een uitdaging54; Glycaanbindende antilichamen zijn moeilijk op te wekken en kunnen een lage affiniteit hebben55. Gelukkig kan gensequentie-informatie voor CBM’s relatief gemakkelijk worden verkregen voor recombinante expressie4 en het manipuleren van hun bindingsspecificiteiten56,57. Hoewel er een indrukwekkende catalogus van GRMP’s is ontwikkeld, waarvan de meeste nu beschikbaar zijn uit commerciële bronnen, in verhouding tot de diversiteit van de glycaanstructuren die in de natuur bestaan, is slechts een klein deel geproduceerd en met succes gekarakteriseerd58. Dit kan het vermogen om bepaalde structuren te detecteren en te onderscheiden beperken. Het is raadzaam om een eerste sonderingsexperiment uit te voeren met behulp van een of twee sondes die representatief zijn voor elke belangrijke glycaanstructuur die naar verwachting aanwezig zal zijn en waarvoor de bindingsspecificiteit goed is gekarakteriseerd. In volgende sonderingsexperimenten kan de sondelijst worden uitgebreid om een breder scala aan glycanen te bestrijken en dieper in fijne structuren te duiken.

Hoewel alledaags, is het van fundamenteel belang voor het succes van de sonderingsprocedure om ervoor te zorgen dat microarrays na elke incubatiestap grondig worden gewassen. De ineffectieve verwijdering van niet-specifiek gebonden sondes zal waarschijnlijk het resultaat verdoezelen door een hoog achtergrondsignaal te veroorzaken na kleurontwikkeling. In dit geval is het noodzakelijk om de sonderingsprocedure te herhalen, te beginnen met een nieuwe microarray. Bovendien moeten arrays spaarzaam worden aangeraakt en alleen door de randen met een tang vast te houden; Het nitrocellulosemembraan is broos en gemakkelijk beschadigd. De kleurontwikkelingsoplossing verzamelt zich in scheuren en vouwen, waardoor oververzadiging ontstaat, wat de array-analyse belemmert.

MAPP is snel, aanpasbaar en handig. Deze methode is compatibel met dierlijke, microbiële of plantaardige glycanen die zijn afgeleid van elk biologisch of industrieel systeem, zolang ze kunnen worden geëxtraheerd en geïmmobiliseerd op nitrocellulose, en waarvoor men geschikte moleculaire sondes heeft. De gegenereerde gegevens bieden gedetailleerd, semi-kwantitatief inzicht in de samenstelling, dat niet gemakkelijk kan worden verkregen via andere glycaananalysemethoden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen ArrayJet bedanken voor hun deskundig advies op het gebied van microarray-robotica. SS en JS willen graag de steun van het Fundamental Fund 2022 (FF65/004), Chiang Mai University, erkennen.

Materials

1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss) Megazyme P-LICHN
1,4-β-D-Mannan Megazyme P-MANCB
384-well microtiter plate Greiner Bio-One M1686
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) Melford B74100-1.0
Acetone Sigma 270725
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 112-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag Jackson ImmunoResearch 300-055-240
Arabinoxylan (wheat) Megazyme P-WAXYL
Array-Pro Analyzer Software Media Cybernetics Version 6.3
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A) NZYTech CZ0564
BAM antibodies SeaProbes Various
Black drawing ink (indian ink) Winsor & Newton GWD030
Carbohydrate binding modules NZYTech Various
CCRC antibodies CarboSource Various
CDTA Sigma 319945
Chloroform Sigma PHR1552
Ethanol Sigma 1.11727
Galactan (potato) Megazyme P-GALPOT
Galactomannan (carob) Megazyme P-GALML
Glycerol solution Sigma 49781-5L
Gum tragacanth (legumes) Sigma-Aldrich G1128
INCh antibodies INRA Various
LM and JIM antibodies PlantProbes Various
Marathon Argus Microarray Printer ArrayJet
Methanol Sigma  34860
Monoclonal antibodies Biosupplies Australia Various
NaBH4 Sigma 452882
NaOH Sigma S5881
Nitro-blue tetrazolium (NBT) Melford N66000-1.0
Nitrocellulose membrane Thermo Fisher Scientific 88018
Pectin (degree of methyl esterification 46%) Danisco NA
ProClin 200 Sigma 48171-U
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre) Megazyme P-RHAGN
Rotating mixer Fisher Scientific 88-861-050
Rotating/rocking Shaker Cole-Parmer
Skimmed milk powder Marvel
Spin filter Costar Spin-X 8160
Stainless steel beads Qiagen 69989
TissueLyser II Qiagen 85300
Tris Sigma 93362
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Tween 20 Sigma P9416-100ML
Xylan (beechwood) Megazyme P-XYLNBE
Xyloglucan (tamarind) Megazyme P-XYGLN
β-Glucan (oat) Megazyme P-BGOM
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amicucci, M. J., et al. A nonenzymatic method for cleaving polysaccharides to yield oligosaccharides for structural analysis. Nature Communications. 11 (1), 3963 (2020).
  2. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Evolution of glycan diversity. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  3. Willats, W. G. T., McCartney, L., Knox, J. P. Pectin cell biology: complexity in context. Advances in Pectin and Pectinase Research. , 147-157 (2003).
  4. Cummings, R. D., et al. Glycan-recognizing probes as tools. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  5. Bakshani, C. R., et al. Analysis of glycans in a Burnt-on/Baked-on (BoBo) model food soil using Microarray Polymer Profiling (MAPP) and immunofluorescence microscopy. Food Chemistry. 410, 135379 (2023).
  6. Salmeán, A. A., Willats, W. G. T., Ribeiro, S., Andersen, T. J., Ellegaard, M. Over 100-year preservation and temporal fluctuations of cell wall polysaccharides in marine sediments. Frontiers in Plant Science. 13, 785902 (2022).
  7. Cid, M., et al. Recognition of the helical structure of β-1,4-galactan by a new family of carbohydrate-binding modules. Journal of Biological Chemistry. 285 (46), 35999-36009 (2010).
  8. Runavot, J. -. L., et al. Non-cellulosic polysaccharides from cotton fibre are differently impacted by textile processing. PLoS One. 9 (12), e115150 (2014).
  9. Ahl, L. I., et al. Analyses of aloe polysaccharides using carbohydrate microarray profiling. Journal of AOAC International. 101 (6), 1720-1728 (2018).
  10. Vidal-Melgosa, S., et al. Diatom fucan polysaccharide precipitates carbon during algal blooms. Nature Communications. 12 (1), 1150 (2021).
  11. Moller, I., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant Journal. 50 (6), 1118-1128 (2007).
  12. Ruprecht, C., et al. A synthetic glycan microarray enables epitope mapping of plant cell wall glycan-directed antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
  13. Cummings, R. D., et al. Principles of glycan recognition. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  14. Gao, C., et al. Glycan microarrays as chemical tools for identifying glycan recognition by immune proteins. Frontiers in Chemistry. 7, 833 (2019).
  15. Vidal-Melgosa, S., et al. A new versatile microarray-based method for high throughput screening of carbohydrate-active enzymes. Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9020-9036 (2015).
  16. Willats, W. G. T., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: A novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  17. Sørensen, I., et al. The charophycean green algae provide insights into the early origins of plant cell walls. The Plant Journal. 68 (2), 201-211 (2011).
  18. Liu, D., Tang, W., Yin, J. -. Y., Nie, S. -. P., Xie, M. -. Y. Monosaccharide composition analysis of polysaccharides from natural sources: Hydrolysis condition and detection method development. Food Hydrocolloids. 116, 106641 (2021).
  19. Pattathil, S., et al. A comprehensive toolkit of plant cell wall glycan-directed monoclonal antibodies. Plant Physiology. 153 (2), 514-525 (2010).
  20. Verhertbruggen, Y., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. The Plant Journal. 59 (3), 413-425 (2009).
  21. Rydahl, M. G., et al. Development of novel monoclonal antibodies against starch and ulvan – implications for antibody production against polysaccharides with limited immunogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 9326 (2017).
  22. McCartney, L., Marcus, S. E., Knox, J. P. Monoclonal antibodies to plant cell wall xylans and arabinoxylans. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (4), 543-546 (2005).
  23. Marcus, S. E., et al. Pectic homogalacturonan masks abundant sets of xyloglucan epitopes in plant cell walls. BMC Plant Biology. 8, 60 (2008).
  24. Pedersen, H. L., et al. Versatile high resolution oligosaccharide microarrays for plant glycobiology and cell wall research. The Journal of Biological Chemistry. 287 (47), 39429-39438 (2012).
  25. Marcus, S. E., et al. Restricted access of proteins to mannan polysaccharides in intact plant cell walls. The Plant Journal. 64 (2), 191-203 (2010).
  26. Smallwood, M., Martin, H., Knox, J. P. An epitope of rice threonine-and hydroxyproline-rich glycoprotein is common to cell wall and hydrophobic plasma-membrane glycoproteins. Planta. 196 (3), 510-522 (1995).
  27. Smallwood, M., Yates, E. A., Willats, W. G. T., Martin, H., Knox, J. P. Immunochemical comparison of membrane-associated and secreted arabinogalactan-proteins in rice and carrot. Planta. 198 (3), 452-459 (1996).
  28. Wisniewski, J. P., Rathbun, E. A., Knox, J. P., Brewin, N. J. Involvement of diamine oxidase and peroxidase in insolubilization of the extracellular matrix: implications for pea nodule initiation by Rhizobium leguminosarum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13 (4), 413-420 (2000).
  29. Jones, L., Seymour, G. B., Knox, J. P. Localization of pectic galactan in tomato cell walls using a monoclonal antibody specific to (1[->]4)-β-D-galactan. Plant Physiology. 113 (4), 1405-1412 (1997).
  30. Willats, W. G., Marcus, S. E., Knox, J. P. Generation of a monoclonal antibody specific to (1→5)-α-L-arabinan. Carbohydrate Research. 308 (15), 149-152 (1998).
  31. Cornuault, V., et al. LM6-M: a high avidity rat monoclonal antibody to pectic α-1, 5-L-arabinan. BioRxiv. , 161604 (2017).
  32. Sutherland, P., Hallett, I., Jones, M. Probing cell wall structure and development by the use of antibodies: a personal perspective. New Zealand Journal of Forestry Science. 39, 197-205 (2009).
  33. Mikkelsen, M. D., et al. Ancient origin of fucosylated xyloglucan in charophycean green algae. Communications Biology. 4 (1), 754 (2021).
  34. Fangel, J. U., Jones, C. Y., Ulvskov, P., Harholt, J., Willats, W. G. T. Analytical implications of different methods for preparing plant cell wall material. Carbohydrate Polymers. 261, 117866 (2021).
  35. Moore, J. P., et al. Analysis of plant cell walls using high-throughput profiling techniques with multivariate methods. The Plant Cell Wall: Methods and Protocols. , 327-337 (2020).
  36. Gao, Y., Fangel, J. U., Willats, W. G. T., Moore, J. P. Tracking polysaccharides during white winemaking using glycan microarrays reveals glycoprotein-rich sediments. Food Research International. 123, 662-673 (2019).
  37. Solden, L. M., et al. Interspecies cross-feeding orchestrates carbon degradation in the rumen ecosystem. Nature Microbiology. 3 (11), 1274-1284 (2018).
  38. Fangel, J. U., et al. Tracking polysaccharides through the brewing process. Carbohydrate Polymers. 196, 465-473 (2018).
  39. Mravec, J., et al. Pea border cell maturation and release involve complex cell wall structural dynamics. Plant Physiology. 174 (2), 1051-1066 (2017).
  40. Wickham, H. . ggplot2: elegant graphics for data analysis. , (2009).
  41. Gu, Z. Complex heatmap visualization. iMeta. 1 (3), 43 (2022).
  42. Nasrollahzadeh, M., Nezafat, Z., Shafiei, N., Soleimani, F. . Polysaccharides in Food Industry. , (2021).
  43. Shao, P., et al. Recent advances in improving stability of food emulsion by plant polysaccharides. Food Research International. 137, 109376 (2020).
  44. Sanz, M. L., Martínez-Castro, I. Recent developments in sample preparation for chromatographic analysis of carbohydrates. Journal of Chromatography. A. 1153 (1-2), 74-89 (2007).
  45. Bethke, G., Glazebrook, J. Cyclohexane diamine tetraacetic acid (CDTA) extraction of plant cell wall pectin. Bio-Protocol. 4 (24), e1357 (2014).
  46. Lu, Y., He, Q., Fan, G., Cheng, Q., Song, G. Extraction and modification of hemicellulose from lignocellulosic biomass: A review. Green Processing and Synthesis. 10 (1), 779-804 (2021).
  47. Jayasekara, S., Ratnayake, R. Microbial cellulases: an overview and applications. Cellulose. 22, 92 (2019).
  48. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., Ordaz-Ortiz, J. J., Knox, J. P. An extended set of monoclonal antibodies to pectic homogalacturonan. Carbohydrate Research. 344 (14), 1858-1862 (2009).
  49. Villares, A., Mateo-Vivaracho, L., Guillamón, E. Structural features and healthy properties of polysaccharides occurring in mushrooms. Agriculture. 2 (4), 452-471 (2012).
  50. Kračun, S. K., et al. Carbohydrate microarray technology applied to high-throughput mapping of plant cell wall glycans using comprehensive microarray polymer profiling (CoMPP). Methods in Molecular Biology. 1503, 147-165 (2017).
  51. Rajasundaram, D., et al. Understanding the relationship between cotton fiber properties and non-cellulosic cell wall polysaccharides. PLoS One. 9 (11), e112168 (2014).
  52. Michalak, L., et al. Microbiota-directed fibre activates both targeted and secondary metabolic shifts in the distal gut. Nature Communications. 11 (1), 5773 (2020).
  53. Salmeán, A. A., Hervé, C., Jørgensen, B., Willats, W. G., Mravec, J. Microarray glycan profiling reveals algal fucoidan epitopes in diverse marine metazoans. Frontiers in Marine Science. 4, 293 (2017).
  54. Knox, J. P. Revealing the structural and functional diversity of plant cell walls. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 308-313 (2008).
  55. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17-23 (2007).
  56. Stephen, P., Tseng, K. -. L., Liu, Y. -. N., Lyu, P. -. C. Circular permutation of the starch-binding domain: inversion of ligand selectivity with increased affinity. Chemical Communications. 48 (20), 2612-2614 (2012).
  57. Gunnarsson, L. C., Dexlin, L., Karlsson, E. N., Holst, O., Ohlin, M. Evolution of a carbohydrate binding module into a protein-specific binder. Biomolecular Engineering. 23 (2-3), 111-117 (2006).
  58. Moller, I., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchical clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25 (1), 37-48 (2008).

Tags

Microarray Polymer ProfilingMAPPGlycan AnalysisCarbohydrateHigh-throughputGlycoconjugatesNitrocellulose MembraneMolecular ProbesStructural ConfigurationsBiological Interactions

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bakshani, C. R., Sangta, J., Sommano, S., Willats, W. G. T. Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis. J. Vis. Exp. (199), e65443, doi:10.3791/65443 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image