التنميط الدقيق للبوليمر (MAPP) هو تقنية عالية الإنتاجية للتحليل التركيبي للجليكان في العينات البيولوجية.
التنميط البوليمر Microarray (MAPP) هو نهج قوي وقابل للتكرار لتحديد التركيب والوفرة النسبية للجليكان والجليكوكونتيورات بشكل منهجي ضمن مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية ، بما في ذلك الأنسجة النباتية والطحالب والمواد الغذائية والعينات البشرية والحيوانية والميكروبية. تدعم تقنية Microarray فعالية هذه الطريقة من خلال توفير منصة فحص مصغرة وعالية الإنتاجية ، مما يسمح بآلاف التفاعلات بين الجليكان والمجسات الجزيئية الموجهة للجليكان المحددة للغاية ليتم توصيفها بشكل متزامن ، باستخدام كميات صغيرة فقط من التحليلات. يتم تجزئة الجليكان المكون كيميائيا وإنزيميا ، قبل استخلاصه بالتتابع من العينة وتجميده مباشرة على أغشية النيتروسليلوز. يتم تحديد تركيبة الجليكان من خلال ربط مجسات جزيئية محددة تتعرف على الجليكان بالجزيئات المبتزة والمطبوعة. MAPP مكمل لتقنيات تحليل الجليكان التقليدية ، مثل السكاريد الأحادي وتحليل الارتباط وقياس الطيف الكتلي. ومع ذلك ، توفر المجسات الجزيئية التي تتعرف على الجليكان نظرة ثاقبة للتكوينات الهيكلية للجليكان ، والتي يمكن أن تساعد في توضيح التفاعلات البيولوجية والأدوار الوظيفية.
الجليكان منتشر في كل مكان في جميع مجالات الحياة ويظهر تنوعا لا مثيل له في البنية والوظيفة مقارنة بالجزيئات الكبيرة الأخرى1. ومع ذلك ، نظرا لتعقيدها ، والتباين في التخليق الحيوي والروابط الجليكوسيدية ، وندرة الطرق المناسبة لتشريح هياكل الجليكان ، فإن فهمنا لهذا التنوع في الهياكل والوظائف محدود نسبيا2.
العديد من تقنيات تحليل الجليكان مدمرة وتتطلب تكسير الجليكان إلى السكريات الأحادية المكونة لها ، والتي يمكن أن تحجب السياقات ثلاثية الأبعاد والبيولوجية ذات الصلة3. على العكس من ذلك ، فإن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) ، ووحدات ربط الكربوهيدرات (CBMs) ، والمحاضرات ، والغلوتينين الفيروسي ، والالتصاقات الميكروبية ، والمعروفة مجتمعة باسم المجسات الجزيئية التي تتعرف على الجليكان (GRMPs)4 ، تتعرف على حوامل محددة وترتبط بها ويمكن استخدامها كأدوات للكشف والتمييز بين الجليكان داخل مصفوفات معقدة متعددة الجليكان 5,6.
هنا ، نقدم تنميط بوليمر microarray (MAPP) ، وهي طريقة سريعة ومتعددة الاستخدامات وغير مدمرة لتحليل الجليكان والتي تنطبق على مجموعة واسعة من العينات البيولوجية. تهدف الطريقة إلى توفير تقنية قوية وعالية الإنتاجية لتحليل الجليكان من أنظمة بيولوجية وصناعية / تجارية متنوعة. يوحد MAPP خصوصية التعرف على المجسات الجزيئية الموجهة بالجليكان مع تقنية فحص microarray القابلة للتكرار وعالية الأداء للسماح بآلاف التفاعلات الجزيئية بالتوازي. ناتج هذا النهج هو نظرة تشخيصية حول التركيب والوفرة النسبية للجليكان داخل عينة أو نسيج مهم.
يمكن استخدام MAPP كطريقة مستقلة قائمة بذاتها ، أو بالاقتران مع تقنيات كيميائية حيوية أخرى ، مثل الفحص المجهري المناعي7،8،9 والسكريات الأحادية أو تحليل الارتباط10،11. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لرسم خريطة لخصائص الخاتمة ل GRMPs الجديدة ، باستخدام المصفوفات المطبوعة بمعايير قليلة السكاريد النقية والمحددة جيدامن الناحية الهيكلية 12. الميزة الرئيسية ل MAPP على الطرق الأخرى ، مثل مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، هي توافقها مع أحجام العينات الصغيرة13,14. علاوة على ذلك ، يقدم MAPP تحليلا عالي الإنتاجية15 ويوفر شكلا فعالا لحفظ العينات ، حيث تكون العينات المطبوعة جافة ومستقرة عند تجميدها على النيتروسليلوز16.
يعتمد ربط GRMPs بشكل عام على وجود عدد من بقايا السكر المتجاورة التي تشكل مجتمعة موقع ربط (حاتم) فريد لفئة معينة من عديد السكاريد (زيلان ، مانان ، زيلوجلوكان ، إلخ.) 17. في المقابل ، يمكن أن تكون بقايا السكر الفردية (الزيلوز ، المانوز ، الجلوكوز) التي يتم قياسها كميا باستخدام معظم التقنيات الكيميائية الحيوية ، على سبيل المثال تكوين السكريات الأحادية أو تحليل المثيلة ، مكونات لفئات متعددة من السكريات وبالتالي يصعب تعيينها18.
تم تطوير MAPP استجابة لفجوة تقنية ، وهي القدرة على التحليل السريع لجليكان متعدد من مجموعة متنوعة من المصادر باستخدام كميات صغيرة من المواد. تستفيد MAPP من الذخيرة الواسعة من GRMPs التي تم تطويرها وتميزها على مدى العقود الثلاثة الماضية12،19،20،21،22،23،24،25،26،27،28،29،30،31،32. كان تطوير MAPP عملية تكرارية ، حيث يتم تحسين التقنية وتحسينها بشكل مطرد. يوجد الآن مجموعة كبيرة من الأدبيات التي تصف تطبيق MAPP على مختلف الأنظمة الطبيعية والصناعية حيث تلعب الجليكان أدوارا مركزية 5،6،9،10،21،33،34،35،36،37،38،39. هنا ، نصف الحالة الراهنة لفن MAPP.
تقنية MAPP الموصوفة هنا هي الآن طريقة راسخة لتحليل الجليكان. تم وصف المبادئ الأساسية لأول مرة في 200711 ، لكن التقنية خضعت للتطوير المستمر من أجل الاستفادة من أحدث الابتكارات في تقنية microarray ، وتطوير المسبار الجزيئي ، والتقدم في فهمنا للكيمياء الحيوية للجليكان. بشكل عام ، يعد تحليل الجليكان ، وخاصة السكريات ، أكثر صعوبة من البروتينات والنيوكليوتيدات بسبب تعقيدها الهيكلي وعدم تجانسها45 ، فضلا عن حقيقة أنه لا يمكن تسلسلها أو تصنيعها بسهولة1. في كثير من الحالات ، لا يمكن لتقنية واحدة فك تشفير تعقيد الجليكان بشكل قاطع. وبالتالي ، غالبا ما يتم استخدام MAPP مع طرق أخرى. هذا هو أحد أسباب اختيار إعداد AIR عادة كنقطة انطلاق ل MAPP ، نظرا لأن AIR متوافق مع معظم طرق تحليل glycan الأخرى34 ، مما يسهل المقارنة اللاحقة لمجموعات البيانات.
بسبب تجانس العينة قبل إعداد AIR ، يتم فقدان بعض المعلومات المكانية دائما. ومع ذلك ، نظرا لأن السكريات يتم إطلاقها بالتتابع من العينات ، فإن وجود الحواتم في الكسور التي تم الحصول عليها يوفر معلومات حول البنية الجزيئية وتكوين تلك العينة17. وبالتالي ، فإن اختيار نظام استخراج مناسب أمر بالغ الأهمية لنجاح الطريقة. تحدد المعلمات المتعددة مدى ملاءمة طريقة الاستخراج: التركيب الخلوي ، والوقت ، ودرجة الحرارة ، ودرجة الحموضة ، والضغط ، والقوة الأيونية للمذيب ، ودقة عينة الجسيمات الصلبة49. يوصى باستخدام مجموعة من المذيبات الأكثر عدوانية بشكل متزايد لزيادة احتمالية استخراج الجليكان المكون بنجاح وبناء صورة تركيبية تمثيلية للعينة. بالنسبة لمعظم العينات ، تكون CDTA و NaOH و cellulase كافية لإزالة التخزين المشتق من النبات والسكريات ذات الجدار الخلوي33،50،51،52. بالنسبة لبعض عينات الأنسجة ، ثبت أن نظام الاستخراج الهجين الذي يتضمن أيضا CaCl2 و HCl و Na2CO3 ناجح53 ، بينما قد تتطلب عينات الطحالب الدقيقة البحرية إضافة حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) 10.
يجب أن تتضمن المصفوفات الدقيقة مجموعة من معايير الجليكان النقية والمحددة لاستخدامها كعناصر تحكم إيجابية5. يجب تعديل المعايير المدرجة وفقا لطبيعة العينة. بمجرد طباعتها ، يجب اختيار GRMPs المناسبة. إن توليد الورم الهجين mAbs إلى هياكل السكاريد يمثل تحديا54. يصعب رفع الأجسام المضادة المرتبطة بالجليكان ويمكن أن يكون لها تقارب منخفض55. لحسن الحظ ، يمكن الحصول على معلومات تسلسل الجينات ل CBMs بسهولة نسبية للتعبير المؤتلف4 وهندسة خصائص ارتباطها56,57. في حين تم تطوير كتالوج مثير للإعجاب من GRMPs ، مع توفر معظمها الآن من مصادر تجارية ، بالنسبة لتنوع هياكل الجليكان الموجودة في الطبيعة ، تم إنتاج نسبة صغيرة فقط وتميزها بنجاح58. هذا يمكن أن يحد من القدرة على اكتشاف والتمييز بين هياكل معينة. ينصح بإجراء تجربة فحص أولية باستخدام واحد أو اثنين من المجسات الممثلة لكل بنية جليكان رئيسية من المتوقع أن تكون موجودة ، والتي تتميز خصوصية الارتباط بها بشكل جيد. في تجارب التحقيق اللاحقة ، يمكن توسيع قائمة المسبار لتغطية مجموعة أوسع من الجليكان والتعمق في الهياكل الدقيقة.
على الرغم من كونها عادية ، إلا أن ضمان غسل المصفوفات الدقيقة جيدا بعد كل خطوة حضانة أمر أساسي لنجاح إجراء الفحص. من المحتمل أن تؤدي الإزالة غير الفعالة للمجسات غير المرتبطة على وجه التحديد إلى حجب النتيجة عن طريق التسبب في إشارة خلفية عالية بعد تطور اللون. في هذه الحالة ، من الضروري تكرار إجراء الفحص ، بدءا من مصفوفة دقيقة جديدة. علاوة على ذلك ، يجب لمس المصفوفات باعتدال وفقط عن طريق إمساك الحواف بالملقط ؛ غشاء النيتروسليلوز هش ويتلف بسهولة. يتجمع حل تطوير الألوان في الشقوق والتجاعيد ، مما يتسبب في التشبع الزائد ، مما يعيق تحليل المصفوفة.
MAPP سريع وقابل للتكيف ومريح. تتوافق هذه الطريقة مع الجليكان الحيواني أو الميكروبي أو النباتي المشتق من أي نظام بيولوجي أو صناعي ، طالما يمكن استخراجها وشل حركتها على النيتروسليلوز ، والتي يمتلك المرء مجسات جزيئية مناسبة لها. توفر البيانات التي تم إنشاؤها رؤية تفصيلية وشبه كمية وتركيبية ، والتي لا يمكن الحصول عليها بسهولة عبر طرق تحليل الجليكان الأخرى.
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون أن يشكروا ArrayJet على مشورة الخبراء فيما يتعلق بروبوتات microarray . تود SS و JS الاعتراف بالدعم المقدم من الصندوق الأساسي 2022 (FF65 / 004) ، جامعة شيانغ ماي.
1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss) | Megazyme | P-LICHN | |
1,4-β-D-Mannan | Megazyme | P-MANCB | |
384-well microtiter plate | Greiner Bio-One | M1686 | |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Melford | B74100-1.0 | |
Acetone | Sigma | 270725 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-055-003 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 112-055-003 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag | Jackson ImmunoResearch | 300-055-240 | |
Arabinoxylan (wheat) | Megazyme | P-WAXYL | |
Array-Pro Analyzer Software | Media Cybernetics | Version 6.3 | |
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A) | NZYTech | CZ0564 | |
BAM antibodies | SeaProbes | Various | |
Black drawing ink (indian ink) | Winsor & Newton | GWD030 | |
Carbohydrate binding modules | NZYTech | Various | |
CCRC antibodies | CarboSource | Various | |
CDTA | Sigma | 319945 | |
Chloroform | Sigma | PHR1552 | |
Ethanol | Sigma | 1.11727 | |
Galactan (potato) | Megazyme | P-GALPOT | |
Galactomannan (carob) | Megazyme | P-GALML | |
Glycerol solution | Sigma | 49781-5L | |
Gum tragacanth (legumes) | Sigma-Aldrich | G1128 | |
INCh antibodies | INRA | Various | |
LM and JIM antibodies | PlantProbes | Various | |
Marathon Argus Microarray Printer | ArrayJet | ||
Methanol | Sigma | 34860 | |
Monoclonal antibodies | Biosupplies Australia | Various | |
NaBH4 | Sigma | 452882 | |
NaOH | Sigma | S5881 | |
Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Melford | N66000-1.0 | |
Nitrocellulose membrane | Thermo Fisher Scientific | 88018 | |
Pectin (degree of methyl esterification 46%) | Danisco | NA | |
ProClin 200 | Sigma | 48171-U | |
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre) | Megazyme | P-RHAGN | |
Rotating mixer | Fisher Scientific | 88-861-050 | |
Rotating/rocking Shaker | Cole-Parmer | ||
Skimmed milk powder | Marvel | ||
Spin filter | Costar Spin-X | 8160 | |
Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
Tris | Sigma | 93362 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | |
Xylan (beechwood) | Megazyme | P-XYLNBE | |
Xyloglucan (tamarind) | Megazyme | P-XYGLN | |
β-Glucan (oat) | Megazyme | P-BGOM |