冻肩大鼠模型中的推拿：一种高效且可重复的方案

本研究经山东中医药大学附属医院伦理委员会批准（编号：AWE-2022-023）。 1.实验动物 将20只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（7周龄，250-280g）饲养在标准条件下（室温[RT] 20-24°C，湿度40%-60%，12小时/12小时光/暗循环）。 2.分组方式 将SD大鼠分为对照组（C）、FS模型对照组（M）、FS模型推拿治疗组（MT）和FS模型口服治疗组（MO），每组由5只大鼠组成。每个笼子养5只大鼠（同组）。 驯化7天后，使用石膏固定固定3周以模拟FS，如下一节所述，固定M，MT和MO组中大鼠的一侧肩膀3周。 如第4节（图1）所述，对MT组的大鼠进行推拿治疗2周。 根据成人剂量（0.75mg /天）和大鼠与人体表面积的比例（0.018）计算每公斤大鼠（0.0675mg /天）所需的地塞米松剂量。 每天上午7：00以0.067mg / kg /天对MO组大鼠施用每日胃内地塞米松溶液，持续2周。注意：使用此分组方法确认推拿方案在本研究中的效果。根据不同研究中的实验目的进行分组方法。 3. FS模型的开发 使用三溴乙醇（250mg / kg，通过腹膜内注射）麻醉大鼠11。注：根据该机构伦理委员会的要求，将由摩擦乙醇（10g）和叔戊醇（10mL）组成的储备溶液储存在4°C下。 使用前，用蒸馏水稀释至2%。 将石膏浸泡的绷带贴在大鼠的右肩和胸部，使右前肢保持肩关节内旋90°，持续3周（图2）12。注意：监测大鼠以确保它们可以进行正常的生理活动，例如行走，进食和饮水。如果大鼠不能进行正常的生理活动，请重新固定石膏绷带。 通过观察大鼠右肩关节僵硬、右上肢收缩、肌肉萎缩、跛行等症状的发展，确认FS模型的成功建立13。 4.推拿法 注意：在整个过程中，研究者必须穿戴个人防护设备。只有一名专业的推拿医生必须执行所有操作（图 3、图 4 和图 5）。 通过智能按摩技术参数确定系统进行训练，该系统包括机械感受器和计算机（图3A）。在通过软件显示的三个方向上对机械感受器和力参数进行操作（图3B）。 使用拇指手指以0.5kg的强度和100-120次/分钟的频率在旋转运动中执行旋转揉捏方法（图3C）。 使用拇指指尖以0.5 kg的强度执行点压方法（图3D）。 通过保持步骤4.1.2和4.1.3中提到的机械显示器1分钟，对大鼠进行推拿。 握住大鼠直到它平静下来（~2分钟）。然后，执行操作。将大鼠置于侧卧位，但位置可能会根据不同的操作方法而改变。 用右手食指和中指夹住大鼠的右前肢并弯曲并伸展数次，以确定大鼠肩关节、肘关节和肱骨的位置。 用拇指髓顺时针旋转揉捏大鼠的右肩，前肢和背部，强度为0.5kg，频率为100-120次/分钟，持续3分钟（图4A-C）。在侧卧位操纵前肢肌肉。 以俯卧姿势操纵肩部和背部肌肉。 每个穴位用拇指指尖垂直按压 LI15（剑宇）、SI11（天宗）、HT01（吉泉）和 LI11（曲池）30 次，强度为 0.5 kg（图 4D-G）。使用大鼠穴位图谱定义每个穴位的位置（图5）14,15。 按LI15，位于肩峰端前下凹陷处，俯卧位。 按 SI11，位于肩胛棘中点冈下窝的凹陷处，俯卧位。 按位于腋窝中心的 HT01，仰卧位。 按LI11，位于侧卧位肘皱褶外侧端桡侧腕伸肌内侧的凹陷处。 用左手拇指和中指握住肩关节，在内收、外展、前伸和后伸位置拉伸前肢10秒（图4H-K）。注意：这种拉伸方法必须在大鼠中没有抵抗的情况下进行。 如果大鼠变得激动，请暂停推拿程序。抚摸大鼠10秒使其平静下来，然后进行试验。 每天执行该程序，持续 2 周。 5. 盂肱ROM的测量 注意： 重要的是要尽快完成测量过程，以防止关节囊组织退化。 用过量剂量的三溴乙醇（3倍初始剂量，通过腹膜内注射）处死大鼠后，切除肩胛骨和近端三分之二的肱骨，暴露肩胛骨的下边缘。 将注射针（1.2 cm x 0.45 mm）沿肱骨干插入肱骨头。 将两根注射针垂直插入肩胛骨的上角和下角，用无菌手术片包裹塑料泡沫。 将一根细线连接到肱骨干上的注射针上，然后用 5 g 的力将其拉到另一端，使其与肱骨干平行。测量肩胛骨下边缘与肱骨干之间的角度（图6）。注意：为确保可靠的结果，请让单独的调查员进行测量。 使用统计分析软件应用程序以均值±标准差 （SD） 的形式报告数据。注：此处使用的是 SPSS 软件（SPSS 25.0 版）。 使用单因素方差分析 （ANOVA） 分析组间差异。 使用适当的软件获取条形图形。注意：这里使用了GraphPad Prism 8。 测量后使用 H&E 和 Masson 染色评估胶囊病理学。 6. 章节准备 评估盂肱 ROM 后，将整个样品在 4% PFA 中固定 3 天，然后在 EDTA （pH 7.2） 溶液中再脱钙 2 个月。 脱水后，将含有样品的包埋组织块切成5μm切片16。 将切片在65°C干燥60分钟。 对切片进行脱蜡。 将切片浸泡在二甲苯I，二甲苯II和二甲苯III中7分钟，然后下降乙醇系列（无水乙醇，5分钟;95%乙醇，2分钟;80%乙醇，2分钟和70%乙醇，2分钟），最后在超纯水中浸泡2分钟。 7. H&E染色 用苏木精染色切片5分钟，用1%盐酸乙醇冲洗3秒，用流水洗涤5分钟。 用曙红染色切片3分钟，并用自来水洗涤。 将切片浸泡在乙醇系列（95%乙醇I，3秒;95%乙醇II，3秒;无水乙醇I，3秒和无水乙醇II，1分钟）中，然后浸入二甲苯系列（二甲苯I，1分钟;二甲苯II，1分钟）中。 在每个样品上滴一滴中性口香糖密封剂。用盖玻片密封每个样品。 使用倒置荧光显微镜（比例尺= 100μm）收集图像。 8. Masson染色 使用免疫组织化学笔，在切片周围画一个圆圈，然后将切片在37°C的Bouin溶液中孵育2小时以媒染。随后，用水清洗切片，直到黄色消失。 用青金石蓝染料处理样品3分钟，然后用蒸馏水洗涤。 用苏木精（Mayer）对切片染色2分钟后，在酸性乙醇分化溶液中处理切片3秒。然后，在流水中洗涤切片10分钟。 用ponceau洋红色染料溶液染色切片10分钟，然后用水洗涤。 将切片浸入磷钼酸溶液中10分钟。 向切片中加入苯胺蓝染色液5分钟，然后用弱酸工作液洗涤2分钟。 脱水并使部分透明，如步骤 7.3 中所述。 在每个部分滴一滴中性口香糖密封剂，并用盖玻片盖住它。将部分放在通风橱中晾干。 按照步骤 7.5 中的说明收集图像。