マウスにおける心筋虚血再灌流後の冠動脈血流予備能の動的評価

すべての実験は、北京大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。本研究では、8-12週齢の雄C57マウスを使用しました。動物は商業的な供給源から入手しました( 資料の表を参照)。 1.動物の調理 脱毛クリームを使用して、胸部から髪を取り除きます( 材料の表を参照)。次に、手順2に続いて超音波画像の取得に進みます。 2. IR手術前の超音波画像診断 マウスをイソフルラン誘導チャンバー( 材料の表を参照)に入れてマウスを麻酔し、1.5〜2.0 L / min O2 の流れで1.5%の濃度でイソフルラン送達を開始します。 麻酔をかけたマウスを生理学的モニタリングプラットフォーム(超音波システムのイメージングプラットフォーム、 材料の表を参照)上の仰臥位に配置します。生理学的モニタリングテーブルの銅シートに少量の導電性ゲルを塗布し、その上にマウスの足を低粘着テープで固定して、ECGと呼吸に関する生理学的情報を取得します。内蔵のウォーミングプラットフォームを使用して、体温を37〜38°Cに保ちます。注:ガス麻酔器の制御スイッチをチャンバーからマスクに切り替え、この間、麻酔薬の投与量を1.5%に一定に保ちます。この時点でのマウスの心拍数は、約350〜450拍/分である必要があります。 乾燥を防ぐために、イメージングの前に眼科用獣医軟膏を目に塗布します。. 40 MHzリニアプローブ9 (マウス用MS550プローブなど)を使用して経胸壁心エコー検査を行います(図1A)。注:超音波装置にはMS550プローブが装備されています。 超音波透過ジェル( 材料の表を参照)をたっぷりと塗布して、最適な画質を確保します。 プローブとプラットフォームの位置を調整して、修正された胸骨傍長軸(PLAX)を形成します view9 (図1A)Bモードで左前下行動脈(LAD)を検査します。簡単に言うと、傍胸骨長軸ビューを使用して、プラットフォームを横方向に整列させ、プローブとプラットフォームの間に小さな角度で配置して心臓を画像化します。 Bモードで適切な心臓セクションを見つけ、タッチスクリーンで カラードップラー をアクティブにします(図1B)。LAD(白い矢印)は、左心室壁内で識別できます(図1B)。リアルタイムの赤色は、血流の方向(つまり、血流がプローブに向かっている)を示します。注:X軸を調整することにより、カラードップラーは、この画像ウィンドウ内で完全なLAD(大動脈洞から遠位枝部位まで)を視覚化できます。 プローブを少し動かして正しい位置を見つけ、肺静脈の血流の影響を減らします。注:肺静脈の血流の影響を減らすには、プローブをわずかに調整し、LADを肺静脈と区別します。LADは左心室壁を走り、肺静脈は左心房に流れ込みます。カラードップラーを使用してLADを見つけ、Bモードを使用して適切なセクションを選択します。 カラードップラーモードでLADを視覚化した後、 パルス波(PW) ボタンを押してPWモードに切り替えます。黄色のインジケーターラインを冠状動脈に配置し、流れの方向と平行になるようにします。次に、[ クリップを保存] ボタンを押して、ベースラインデータを記録します。 イソフルラン濃度を3%に上げ、30秒待ちます。流速が時間とともに徐々に増加することを確認してください。 Save Clip ボタンを頻繁に押すと、最高の血流速度がキャプチャされます。注:イソフルラン刺激により心臓がより激しく働き、心臓とLADが動く可能性があります。PWモードの画像がキャプチャまたはシネ保存されたら、 PWモード をクリックして、黄色のインジケータラインがLAD上にあることを確認します。ずれが発生した場合は、黄色のインジケーターラインを血流点に少し調整して、記録を続行してください。このプロセスには、迅速な習得と切り替えが必要です。 冠状動脈血流画像を収集した後、麻酔薬をオフにし、プローブを正常なPLAXビューに調整します。マウスの心拍数が約500 bpmまでゆっくりと増加するのを待ってから、プローブを胸骨傍短軸切片(PSAX)に切り替えてマウスの心機能を測定します。 心エコーイメージングが完了したら、動物をプラットフォームから取り出し、自宅のケージで回復させます。ジェルを取り出し、低体温症を防ぐために動物を乾燥させます。 Peak Vel 関数ツールと LV 関数ツールを使用して、画像からそれぞれピーク拡張期速度と心臓収縮期関数を取得します。 CFR を、最大流量での拡張期ピーク冠状動脈流速 (CFV) とベースラインでの拡張期ピーク CFV の比として計算します。 3. 心筋虚血再灌流法 注:最初の測定はベースラインであり、その後、同じ動物に対して手術が行われました。 ペントバルビタールナトリウム(60 mg / kg)でマウスを麻酔し、鎮痛剤カルプロフェン(5 mg / kg、皮下注射)を投与します。外科的処置全体を通して、予め温めた加熱パッド(37°C)を使用してください。つま先をつまむ反射やまばたき反射に対する離脱反射がないため、適切な麻酔の深さを確保します。マウスの仰臥位を加熱パッドに置き、眼科用軟膏を目に塗布して、目が乾燥するのを防ぎます。人工呼吸器のための気管内挿管の実施:首の毛を取り除く前後に、ベタジンまたはクロルヘキシジンと70%アルコールの3つの交互のスクラブでその領域を消毒します。気管の位置を特定し、カテーテルをそっと挿入します。次に、マウスを人工呼吸器(120呼吸/分で吸気潮汐量250μL)に接続します( 材料の表を参照)。 前胸部の皮膚を、ベタジンまたはクロルヘキシジンと70%アルコールを交互に3回入れて消毒します。第4肋間腔で左開胸術10 を行うことにより、心臓を露出させます。 左前下行動脈(LAD)を5-0シルク縫合糸( 材料表を参照)を使用してスリップノットで結紮し、左心房付属器の根元から1〜2mm下に挿入します。ステッチ方向が左心房付属器の下端と平行であることを確認してください。虚血性心筋の局所的な色濃化 により 、すべてのマウスの虚血を視覚的に確認します。 LAD動脈を30分間閉塞します11.30分後、結紮糸を放出し、心筋の以前に変色した領域の発赤を1〜2分間観察することにより、再灌流を確認します。 冠状動脈閉塞/再灌流後、胸部を層状に閉じ、マウスが約30分間回復するのを待ちます11。 4. IR手術後の超音波画像診断 再灌流後1時間、3時間、5時間、8時間、24時間、および48時間で、セクション2で概説した手順に従って、CFRを再度測定します。これらの測定値を、虚血再灌流(IR)手順の前に得られたCFR値と比較します。 5. 統計分析 適切な統計解析ソフトウェアを使用して、統計解析を実行します( 資料の表を参照)。注:対応のあるサンプル間の連続変数の比較には、データが正規分布している場合は対応のある t検定 を利用します。非正規分布のデータの場合、または正規性の仮定が満たされない場合は、フリードマンの分散分析を使用します。 p < 0.05 を統計的に有意であると考えます。