Долгосрочная визуализация идентифицированных нейронных популяций с использованием микропризм у свободно движущихся животных и животных с фиксированной головой
Summary
При интеграции с головной пластиной и оптической конструкцией, совместимой как с однофотонными, так и с двухфотонными микроскопами, микропризменная линза представляет собой значительное преимущество при измерении нейронных реакций в вертикальной колонке в различных условиях, включая хорошо контролируемые эксперименты в состояниях, зафиксированных головой, или естественные поведенческие задачи у свободно движущихся животных.
Abstract
С развитием многофотонной микроскопии и молекулярных технологий флуоресцентная визуализация быстро развивается и становится мощным подходом к изучению структуры, функций и пластичности живых тканей мозга. По сравнению с традиционной электрофизиологией, флуоресцентная микроскопия может фиксировать нейронную активность, а также морфологию клеток, что позволяет проводить долгосрочные записи идентифицированных популяций нейронов с одноклеточным или субклеточным разрешением. Тем не менее, визуализация с высоким разрешением, как правило, требует стабильной установки с фиксированной головой, которая ограничивает движения животного, а подготовка плоской поверхности из прозрачного стекла позволяет визуализировать нейроны в одной или нескольких горизонтальных плоскостях, но ограничена в изучении вертикальных процессов, протекающих на разных глубинах. Здесь мы опишем процедуру, сочетающую фиксацию головной пластины и микропризму, которая дает многослойную и мультимодальную визуализацию. Этот хирургический препарат не только дает доступ ко всему столбу зрительной коры головного мозга мыши, но и позволяет получать двухфотонную визуализацию в фиксированном положении головы и однофотонную визуализацию в свободно движущейся парадигме. Используя этот подход, можно отбирать идентифицированные популяции клеток в различных слоях коры, регистрировать их реакцию в свободно движущихся состояниях и отслеживать долгосрочные изменения в течение нескольких месяцев. Таким образом, этот метод обеспечивает всесторонний анализ микросхем, позволяя напрямую сравнивать нейронную активность, вызванную хорошо контролируемыми стимулами, и в рамках естественной поведенческой парадигмы.
Introduction
Появление in vivo двухфотонной флуоресцентной визуализации 1,2, сочетающей в себе новые технологии оптических систем и генетически модифицированных индикаторов флуоресценции, стало мощным методом в нейробиологии для исследования сложной структуры, функций и пластичности живого мозга 3,4. В частности, этот метод визуализации дает беспрецедентное преимущество перед традиционной электрофизиологией, фиксируя как морфологию, так и динамическую активность нейронов, тем самым облегчая долгосрочное отслеживание идентифицированных нейронов 5,6,7,8.
Несмотря на свои замечательные сильные стороны, применение флуоресцентной визуализации с высоким разрешением часто требует статической установки с фиксированной головой, которая ограничивает подвижность животного 9,10,11. Кроме того, использование прозрачной стеклянной поверхности для визуализации нейронов ограничивает наблюдения одной или несколькими горизонтальными плоскостями, ограничивая изучение динамики вертикальных процессов, которые распространяются на различные глубины коры12.
Устраняя эти ограничения, в настоящем исследовании описывается инновационная хирургическая процедура, которая объединяет фиксацию головной пластины, микропризму и минископ для создания метода визуализации с многослойными и мультимодальными возможностями. Микропризма позволяет наблюдать вертикальную обработку вдоль кортикального столба 13,14,15,16, что имеет решающее значение для понимания того, как информация обрабатывается и трансформируется при прохождении через различные слои коры головного мозга и как вертикальная обработка изменяется при пластических изменениях. Более того, он позволяет визуализировать одни и те же нейронные популяции в парадигме с фиксированной головой и в свободно движущейся среде, охватывающей универсальные экспериментальные условия 17,18,19: например, фиксация головы часто требуется для хорошо контролируемых парадигм, таких как оценка сенсорного восприятия и стабильные записи в парадигме 2-фотонов, в то время как свободно движущаяся среда обеспечивает более естественную, гибкую среду для поведенческих исследований. Таким образом, возможность проведения прямого сравнения в обоих режимах имеет решающее значение для дальнейшего понимания микросхем, обеспечивающих гибкие, функциональные отклики.
По сути, интеграция фиксации головной пластины, микропризмы и минископа в флуоресцентную визуализацию предлагает многообещающую платформу для исследования тонкостей структуры и функциональности мозга. Исследователи могут отбирать образцы идентифицированных клеточных популяций на различной глубине, охватывающей все корковые слои, напрямую сравнивать их реакцию как в хорошо контролируемой, так и в естественной парадигме, и отслеживать их долгосрочные изменения в течение20 месяцев. Этот подход дает ценную информацию о том, как эти нейронные популяции взаимодействуют и изменяются с течением времени в различных экспериментальных условиях, открывая окно в динамическую природу нейронных цепей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы показали способность наблюдать и напрямую сравнивать нейроны в условиях фиксированной головы и свободно движущихся в одних и тех же нейронных популяциях. Несмотря на то, что мы продемонстрировали применение в зрительной коре, этот протокол может быть адаптирован к множеству ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим г-жу Чару Редди и профессора Маттео Карандини (Cortex Lab) за их консультации по хирургическому протоколу и обмену трансгенной линией мышей. Мы благодарим д-ра Норберта Хогрефе (Inscopix) за его руководство и помощь в разработке операции. Мы благодарим г-жу Андреа Алдеа (Sun Lab) за помощь в организации хирургического вмешательства и обработке данных. Эта работа была поддержана благотворительной организацией Moorfields Eye Charity.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Vaziri, A., Emiliani, V. Reshaping the optical dimension in optogenetics. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 128-137 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3 (2010).
- Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472 (2016).
- Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970 (2020).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F. The minicolumn hypothesis in neuroscience. Brain. 125, 935-951 (2002).
- Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579 (2017).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678 (2014).
- Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
- Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
- Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
- Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
- Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
- Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
- Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
- Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
- Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
- Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894 (2021).
- Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897 (2023).
