후안와 정맥 주입의 신생아 설치류 모델
Summary
이 프로토콜은 신생아 기간 동안 쥐와 생쥐에서 사용할 수 있는 재현 가능한 정맥 투여 경로를 입증하는 것을 목표로 합니다. 이 절차는 주로 정맥 투여를 사용하는 신생아 치료실에서 약물 투여를 미러링하고자 하는 전임상 설치류 연구에 중요합니다.
Abstract
정맥 주사(iv) 주사는 임상 환경에서 신생아에게 가장 많이 사용되는 약물 투여 경로입니다. 따라서 후안와 정맥 주사는 성공적인 개념 증명 연구가 절실히 필요한 신생아 임상 시험으로 진행될 수 있는 연구에서 화합물 투여를 위한 중요한 방법입니다. 신생아 설치류에 대한 대부분의 정맥 주사 연구는 표재성 측두/안면 정맥을 사용합니다. 그러나 피부가 어두워지고 정맥이 더 이상 보이지 않는 후 2일이 지난 신생아 설치류에서는 역안와 주사를 신뢰할 수 없게 됩니다. 본 프로토콜에서는 표재성 측두정맥이 더 이상 보이지 않지만 눈이 아직 열리지 않은 나이에 신생아 마우스와 쥐 모두에서 정맥동의 후안와 주사를 설명합니다. 눈을 뜨면 연구자가 바늘을 삽입할 때 눈에 천공이 없다는 것을 명확하게 볼 수 있으므로 후안와 주입이 용이합니다. 우리는 이 기술이 부작용 없이 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방식으로 수행될 수 있음을 입증합니다. 또한 신생아 뇌 손상을 연구하기 위해 화합물을 투여하는 것과 같은 많은 연구에서 사용할 수 있음을 보여줍니다.
Introduction
동물 연구는 임상시험으로 이어지는 필수 단계이므로 동물 연구가 임상 환경에서 수행되는 절차 및 치료를 밀접하게 모방하는 것이 중요합니다. 그러나 임상 실습을 신생아 설치류 연구로 전환하는 데에는 몇 가지 문제가 있습니다. 여기에는 신생아 설치류의 크기가 작고, 성인 연구와 비교하여 신생아 연구 및 지식의 격차가 포함됩니다 1,2.
약물 또는 세포와 같은 다양한 물질의 투여는 복강내(IP), 피하(SC) 및 정맥(IV) 주사를 포함한 여러 경로를 통해 수행할 수 있습니다. IV에 의한 주사는 인간 신생아에서 화합물을 투여하는 우선적인 경로입니다. 신생아의 경우, 정맥 투여 경로는 약물의 전신 분포를 극대화하고 생체이용률이 높기 때문에 다른 경로에 비해 유리합니다 3,4. 반복적인 약물 투여를 위해 잘 관리된 IV 라인을 사용할 수 있습니다. 설치류 연구에서는 꼬리, 안면/측두정맥 또는 후안와 부비동에 정맥 주사를 놓아야 한다5. 꼬리 정맥 주사는 성인 설치류에서 일상적으로 사용되며,5 중에서 선택할 수 있는 두 개의 측면 꼬리 평행 정맥을 제공합니다. 그러나 이러한 정맥은 직경이 작기 때문에 신생아에 사용할 수 없습니다. 대부분의 신생아 정맥 주사는 표재성 안면/측두정맥에서 시행되는데, 이는 출생 후 0일째 (P0)-P2에서 볼 수 있고 비교적 많은 양의 투여가 가능하기 때문이다5. 그러나, 이 경로는 일단 동물이 피부색을 얻게 되면, P36 부근에서 신뢰할 수 없게 되어, 표재성 안면/측두맥을 육안으로 보기 어렵게 만든다. 신생아 횡동을 통한 투여 iv는 한 연구에서 기술되었다7; 그러나 이를 위해서는 횡동 위의 피부를 열고 현미경의 도움을 받아 P0-P1에서 AAV9를 주입해야 합니다.
잠재적인 치료법을 조사하거나 관련 신생아 손상 모델을 수립할 때 신생아 설치류는 인간과 다른 장기 발달 시기를 가질 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 우리의 프로토콜은 인간과 설치류 사이의 신생아 중추 신경계 발달의 차이를 기반으로 합니다. 예를 들어, 신생아 인간의 뇌라는 용어는 대략 P7 쥐와 P10 쥐의 뇌8에 해당한다. 후궤도로 주입된 물질의 분포가 다른 IV 부위와 유사하고 높은 혈중 농도가 빠르게 이루어지기 때문에 적절한 경로라고 생각합니다. 이 기술은 P1-P2 마우스의 안과 정맥동에 화합물을 주입한 Yardeni와 동료들에 의해 잘 설명되었습니다9. 현재 프로토콜에서는 아직 눈을 뜨지 않은 고령 신생아 설치류에서 후안와 주사를 수행하는 간단하고 실현 가능한 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 신생아 마우스와 랫트의 후안와 부비동에 물질을 주입하기 위한 명확하고 정확한 방법을 제공합니다. 이는 표재성 측두/안면 정맥을 더 이상 식별할 수 없는 P2 이상의 설치류와 눈꺼풀이 아직 열리지 않고 안구가 노출되지 않은 P12 미만의 동물에서 후안와 주사가 안정적이고 재현성 있게 수행될 수 있음을 보여주기 때문에 중요합니다. 또한, 신생아 후안와 주사는 새끼와 댐 모두에서 잘 견디며 기술을 숙달하면 부작용의 위험이 최소화됩니다.
iv를 통한 주입은 혈관의 파열을 방지하기 위해 주입 속도가 일정하고 낮게 유지된다는 점을 감안할 때 낮은 pH와 높은 pH뿐만 아니라 고농도의 주입이 가능하기 때문에 다른 투여 경로에 비해 이점이 있습니다. 또한, iv 주입은 화합물이 전신 순환에 직접 들어갈 때 화합물의 더 빠른 분포를 허용하여 다른 투여 경로에서 관찰되는 흡수 불량으로 인한 잠재적 지연을 우회합니다. 이를 통해 화합물에 대한 즉각적인 접근과 거의 100% 생체이용률이 가능합니다.
임상적으로 IV는 신생아(생후 28일 <)에서 선호되는 투여 경로입니다. 이는 IV 캐뉼레이션을 통해 약물/수액을 제공하기 위해 쉽게 접근할 수 있기 때문에 신생아 집중 치료 환경에서 특히 그렇습니다. sc 경로를 통한 주사는 신생아, 특히 적혈구 형성15의 투여를 위해 다소 사용되었습니다. 그러나 IV 주입을 우수한 대안으로 제시하는 연구가 나오면서 우려가 제기되고 있다16. 경구 투여는 신생아가 병원 중환자실에 있을 때 실용적인 옵션이 아닌 경우가 많습니다. 또한 성인에 비해 신생아는 위 배출이 지연되고 약물 흡수에 영향을 미칠 수 있는 장 운동성 감소를 포함하여 위장관에 차이가 있습니다. 근육 주사는 신생아의 근육 질량이 작기 때문에 투여하기가 어렵습니다 3,4.
설치류 연구에서 가장 널리 사용되는 IV 주사 방법 중 하나는 꼬리 정맥 주사입니다. 그러나 이 방법은 신생아와 함께 일할 때 사용할 수 없습니다. 표재성 측두정맥/안면정맥(superficial temporal/facial vein 6)과 같은 다른 iv 부위는 P3에서 보이지 않게 된다. 신생아 횡동은 한 연구에서 기술되어 있으며 P0-P1에서 현미경의 도움을 받아 피부를 열고 두개골을 통해 모세혈관 바늘을 횡동으로 전진시켜 2-4μl 부피의 주사를 허용했다7. 쥐17에서 P7의 외부 경정맥의 사용을 문서화한 연구는 거의 없다. 그러나, 이것은 피부의 외과적 개방과 외부 경정맥의 노출을 필요로 하는 침습적 기술이다(18). 성인 설치류를 대상으로 한 연구에서, 후안와 투여는 꼬리 정맥 주사5 만큼 효과적인 것으로 나타났으며, 따라서 후안와 경로의 생존 가능성과 관련성을 강화한다. 후안와 주사는 최소한의 고통을 유발하며 일단 숙달되면 최소한의 장비로 한 사람이 수행할 수 있으며 여러 번 주사할 수 있습니다(눈이 번갈아 가도록 함). 이전 연구들은 P0-P1 또는 P14-P2111 또는 P1719 에서 마우스에서 아데노-관련 바이러스 9를 투여하기 위해 후안와 주입이 사용되었음을 보여주었으며, 이는 이 방법의 수용이 증가하고 있음을 나타낸다.
신생아의 후안와 주사와 관련된 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 모든 IV 주입과 마찬가지로 주입 용량이 제한되어 있으므로 이 시술에는 5μL/g을 권장합니다. 또한 후안와 주사는 전신 마취가 필요합니다. 합병증을 최소화하기 위해 이소플루란과 같은 흡입 마취제는 마취 유도가 빠르고 신진대사가 빠르며 회복 속도가 빠르기 때문에 사용하는 것이 좋습니다. 바늘 경사의 잘못된 배치로 인한 주사 부위 주변의 잠재적인 부종이나 눈 외상을 방지하기 위해 말기 마취된 동물에서 유색 염료를 사용하는 것이 좋습니다. 이 동물의 크기가 작기 때문에 바늘 게이지가 작은 더 미세한 바늘이 필요합니다. 세포 주입은 혈관 막힘을 방지하고 세포 생존력을 보장하기 위해 단일 세포 현탁액으로 수행되어야 합니다. 고무적이게도, Amer와 동료들의 연구는 30G 주사기를 사용하여 포유류 세포를 주입하는 것이 높은 세포 밀도 방출에서도 여전히 신뢰할 수 있는 세포 생존력을 제공한다는 것을 보여주었다20.
요약하면, 신생아에서 신뢰할 수 있는 IV 경로를 확립하는 것은 인간에서 선호되는 투여 경로이기 때문에 임상적으로 중요합니다. 후안와 주사는 쉽게 마스터할 수 있고, 재현 가능하며, 설치류 신생아 기간 동안 안정적으로 사용할 수 없는 꼬리 및 측두/안면 정맥과 같은 다른 IV 주사 부위에 대한 적절한 대안을 제공합니다. 따라서, 신생아 후안와 주사는 적절한 신생아 연령에 약물, 세포 및 기타 화합물의 전달을 허용한다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로토콜에서 수행된 작업은 Hasselblad Foundation(2020-2021, ERF), Åke Wibergs Foundation(M19-0660, ERF), Swedish Research Council(2019-01320, HH; 2021-01872, CM), Sahlgrenska University Hospital의 공중 보건 서비스(ALFGBG-965174, HH ; ALFGBG-966107, CM), 스웨덴 뇌 재단(FO2022-0110, CM), 올렌 재단(223005, CM) 및 유럽 연합 Horizon 2020 프레임워크 프로그램(보조금 계약 번호 87472/PREMSTEM, HH).
Materials
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
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