JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

גידול הפרפר הלבן של הכרוב (Pieris rapae) בתנאים מבוקרים: מקרה בוחן עם עמידות למתכות כבדות

Published: August 18, 2023
doi:
10.3791/65383
,
1Deptartment of Ecology, Evolution and Behavior,University of Minnesota, 2Biology,Sweet Briar College

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לגידול הפרפר הלבן של הכרוב בתנאי מעבדה מבוקרים באמצעות תזונה מלאכותית, המאפשרת מניפולציות מדויקות של תזונה מוקדמת וחשיפה לרעלנים. התוצאות המייצגות מראות כיצד ניתן לבדוק רעילות של מתכות כבדות באמצעות פרוטוקול זה.

Abstract

פרפר לבן הכרוב (Pieris rapae) הוא מערכת חשובה למחקר הדברה יישומי ולמחקר בסיסי באקולוגיה התנהגותית ותזונתית. ניתן לגדל את הלבנים בקלות בתנאים מבוקרים על תזונה מלאכותית, מה שהופך אותם לאורגניזם מודל של עולם הפרפרים. במאמר זה, מניפולציה של חשיפה למתכות כבדות משמשת להמחשת שיטות בסיסיות לגידול מין זה. הפרוטוקול הכללי ממחיש כיצד ניתן לתפוס פרפרים בשטח, לגרום להם להטיל ביצים בכלובי חממה ולהעבירם כזחלים לתזונה מלאכותית. השיטות מראות כיצד ניתן לסמן, למדוד ולחקור פרפרים במגוון שאלות מחקר. התוצאות המייצגות נותנות מושג כיצד ניתן להשתמש בדיאטות מלאכותיות המשתנות ברכיביהן כדי להעריך את ביצועי הפרפרים ביחס לדיאטת ביקורת. באופן ספציפי יותר, פרפרים היו הכי סובלניים לניקל והכי פחות סובלניים לנחושת, עם סבילות לאבץ איפשהו באמצע. הסברים אפשריים לתוצאות אלה נדונים, כולל הצטברות יתר של ניקל בכמה צמחים פונדקאים של חרדל וראיות עדכניות בחרקים לכך שנחושת עשויה להיות רעילה יותר ממה שהוערך בעבר. לבסוף, הדיון סוקר תחילה וריאציות לפרוטוקול והוראות לפתרון בעיות בשיטות אלה, לפני שנבחן כיצד מחקר עתידי עשוי לייעל עוד יותר את התזונה המלאכותית המשמשת במחקר זה. בסך הכל, על ידי מתן סקירת וידאו מפורטת של גידול ומדידה של חלבוני כרוב בדיאטות מלאכותיות, פרוטוקול זה מספק משאב לשימוש במערכת זו במגוון רחב של מחקרים.

Introduction

פרפר לבן כרוב קטן (שם מדעי: Pieris rapae, להלן “כרוב לבן”) הוא מין מזיק קוסמופוליטי של גידולי חרדל, כגון כרוב, ברוקולי וקנולה 1,2,3. יחד עם זאת, לבן הכרוב הוא מערכת רבת עוצמה למחקר בביולוגיה ומודל פרפרים נפוץ, שכן ניתן לגדל ולתפעל אותם בקלות בניסויי מעבדה מבוקרים 4,5. מחקר על פרפרים לבנים מכרוב סיפק תובנות קריטיות ביחס לחיפוש פונדקאי 6,7,8, שימוש במשאבי צוף9,10,11, בחירת בני זוג וברירה מינית 12,13,14, התפתחות ואבולוציה של תבניות כנפיים15,16,17, ותגובות לחידושים ולשינויים סביבות18,19. רבות מהתובנות הללו מסתמכות על העובדה שניתן לגדל לבנים מכרוב על תזונה מלאכותית 4,20,21, אשר ניתן לתמרן במדויק כדי לשקף תנאים תזונתיים ירודים 22,23, רמות זיהום רלוונטיות לסביבה 24,25,26,27, או מעברים לצמחים מארחים חדשים 28,29. המחקר הנוכחי משתמש בניסוי על חשיפה למתכות כבדות כדי להדגים שיטות בסיסיות לגידול פרפרים לבנים כרוב על תזונה מלאכותית במעבדה ומדדי ביצועים מרכזיים של זחלים ובוגרים. היבטים רבים של שיטות אלה חלים על פרפרים אחרים30,31 ועש32,33,34 שניתן לגדל על תזונה מלאכותית.

במאמר זה, ניסוי על סובלנות מתכות משמש כדי להמחיש את השיטות הכלליות של גידול פרפרים לבנים כרוב. מתכות כבדות הן מזהם אנתרופוגני נפוץ הנובע מהתפרקות של מוצרים אנושיים, תהליכים תעשייתיים וזיהום ישן משימוש היסטורי בחומרי הדברה, צבעים ומוצרים אחרים35,36,37,38. מתכות כבדות רבות, כולל עופרת, נחושת, אבץ וניקל, יכולות לעבור מאדמה ומים לרקמת צמח 39,40,41,42, ומתכות באבק יכולות לשקוע על עלי צמח 43,44,45, וכתוצאה מכך נתיבי חשיפה מרובים לזחלי חרקים פיטופגיים. חשיפה למתכות כבדות בשלב מוקדם בחיים יכולה להיות בעלת השפעות שליליות על התפתחות בעלי חיים, במיוחד על רקמות עצביות, ורמות גבוהות יכולות להיות קטלניות 35,36,46,47,48. מספר מחקרים הראו את ההשפעות השליליות של חשיפה למתכות על חרקים מתפתחים, כולל מזיקים וחרקים מועילים 49,50,51. מספרם הרב של מזהמי המתכות הכבדות, והעובדה שלעתים קרובות הם מופיעים יחד בסביבות אנושיות52, פירושם שיש צורך בשיטות מעבדה מדויקות שבהן חוקרים יכולים לחשוף חרקים מתפתחים לרמות שונות ולשילובים שונים של מתכות מגוונות כדי להבין ולמתן את ההשפעות הסביבתיות שלהם.

העבודה הנוכחית מנגידה את ההשפעות של מתכות נפוצות על הישרדות והתפתחות של כרוב לבן, תוך התמקדות בנחושת (Cu), אבץ (Zn) וניקל (Ni), שלושה מזהמים נפוצים בסביבות אנושיות. לדוגמה, מזלגות מצידי הדרכים הכפריים של מינסוטה מכילים עד 71 עמודים לדקה Zn, 28 ppm Cu ו- 5 ppm Ni53. ניסוי זה מתפעל את רמות המתכות הללו בתזונה מלאכותית של פרפרים לבנים מכרוב ברמות התואמות לרמות הנראות בסביבה ואף עולות עליהן. משתמשים בתזונה מלאכותית כדי להשוות את הרעילות היחסית של מתכות אלה, ולחזות כי לבנים מכרוב יהיו רגישים יותר למזהמי מתכות שאינם חלק אינטגרלי מהפיזיולוגיה שלהם (ניקל) ביחס לאלה המתרחשים, אם כי ברמות קטנות, באנזימים וברקמות (נחושת ואבץ; איור 1). לכל אורכו, טקסט זה מספק פרטים מתודולוגיים והדמיות וידאו נלוות כדי להמחיש את שיטות הגידול והמחקר של מערכת מודל פרפרים חשובה זו.

Protocol

מחקר זה נערך תחת היתר APHIS של USDA P526P-13-02979. 1. אוסף פרפרים ניסיוניים תפסו נקבות פרפרים בוגרות בעזרת רשת חרקים אווירית. חלבוני הכרוב נמצאים בדרך כלל בבתי גידול פתוחים ומופרעים עם צמחי צוף וצמחים פונדקאים (ממשפחת Brassicaceae).חפש כאשר השמש בחוץ והטמפרטורה חמה. כדי להתמקד בנקבות, חפשו פרטים מרפרפים לאט, קרוב לאדמה, ונוחתים על צמחים כדי “לתוף” (לטעום) את העלים עם הקדמי שלהם. הציבו נקבות בכלובים כדי לקצור ביצים.הערה: נקבות שנאספו בשדה, בממוצע, הזדווגו עם זכר אחד או שניים12, ועליהן להתחיל להטיל ביצים פוריות זמן קצר לאחר הלכידה. נקבות שנלכדו בטבע זקוקות לאור טבעי כדי להזדווג ולהזדווג, לכן הניחו את הכלוב בחממה או על אדן החלון. נקבות בית עם צמח פונדקאי כדי לקצור ביצים.הערה: הנקבות יקבלו מגוון צמחים פונדקאים, כולל כרוב ירוק, צנון, קייל, קולרדים וארבידופסיס, אך יוודאו שהצמחים לא טופלו בחומרי הדברה כלשהם.הציגו את הצמחים המארחים בעציצים או במיכלים עם מים כדי לשמור על לחץ העלים, כגון גבעולי קייל בצינורות מים פרחוניים. אם החוקר מעוניין לאסוף ביצים ולהעבירן ישירות לתזונה, השתמש תחילה בגומייה כדי להצמיד עלה צמח פונדקאי לחלק העליון של מים מפלסטיק, ולאחר מכן מתח חתיכת פרפילם סביב הקצה – נקבות שנוגעות בעלה יעשו אוביפוזיט על הפרפילם (ראה5). ודאו שהכלוב מכיל גם משהו שישמור על לחות יחסית גבוהה, למשל באמצעות השקיה יומית של עציץ או הרטבת מגבת, במיוחד בתנאי יובש. אם משקים עציצים בכלוב, ודאו שמגבת נמצאת מתחת לעציץ, שכן פרפרים יכולים להיתקע במי איגום. האכילו את הפרפרים בתמיסת מי דבש מדוללת 10% המוצגת על ספוג צהוב, שהפרפרים לומדים להשתמש בו במהירות, במיוחד אם הם שוכנים עם אנשים מנוסים.כדי לעודד פרפרים להיזון מספוגים, הניחו אותם ישירות על מתקן ההאכלה, במיוחד לאחר ריסוס קל בבקבוק מים, מה שגורם להם לעתים קרובות לבלוט החוצה. כדי להגדיר את המזין, תחילה שטפו היטב את הספוגים הצהובים או הכתומים, ולאחר מכן חתכו אותם לריבועים קטנים שמתאימים לצלחות פטרי מפלסטיק בקוטר 60 מ”מ. החליפו את חומרי ההזנה מדי יום ונקו את הספוגים בתמיסת אקונומיקה עדינה, ולאחר מכן שטיפה יסודית למניעת צמיחת עובש. 2. ביצוע דיאטות מלאכותיות ראשית, השתמש במתכון בטבלה 1, או במקורות רלוונטיים אחרים, כדי לקבוע את המתכון הרלוונטי לניסוי. בצע שינויים נחוצים ספציפיים למין המוקד או לניסוי. הדפיסו מתכון שיש לעקוב אחריו תוך שקילת המצרכים. שוקלים את כל החומרים היבשים, למעט האגר, במיכל אחד. ודאו שהרכיבים מוכנסים בחזרה למקום האחסון המתאים להם, ושימו לב שמספר מרכיבים מאוחסנים בטמפרטורה של 4°C. הכניסו את תערובת המרכיבים היבשים שנשקלה מראש לבלנדר עם 5 מ”ל שמן זרעי פשתן. עבור כל אצווה דיאטה, בצע את השלבים המפורטים להלן.מערבבים 15 גרם של אגר רשת דקה עם 400 מ”ל מים מזוקקים בכוס בגודל 1 ליטר לפחות. חממו במיקרוגל עד שהאגר קרוב לרתיחה, עם בועות דקות לאורך התערובת, וערבבו את התערובת כל 30-60 שניות כדי למנוע רתיחה. לתערובת אגר חמה זו, הוסיפו 400 מ”ל מים מזוקקים בטמפרטורת הברז כדי להביא אותם לטמפרטורה מתאימה לערבוב עם החומרים היבשים, מכיוון שתערובת הוויטמינים רגישה לחום. מוסיפים את תערובת האגר לבלנדר ומערבבים היטב, מגרדים את קצוות הבלנדר במידת הצורך. בזמן שהאגר מתחמם, הניחו לפחות שבעים וארבע כוסות דיאטה על השיש כשהקצוות נוגעים זה בזה. לאחר ערבוב יסודי של הדיאטה, שפכו את התערובת מהבלנדר לכוסות דיאט, וודאו שהדיאטה מכסה את החלק התחתון של כל. לאחר שהדיאטה מתקררת, הניחו מכסים על הכוסות, תייגו את כוסות הדיאט עם סוג הדיאטה, ערמו אותן על מגשים ואחסנו עד חודש בטמפרטורה של 4°C צלזיוס עד לשימוש. 3. העברה וגידול על דיאטות מלאכותיות עלי צמח מארח הבית עם ביצי פרפר בכוסות מעדנייה של 30 אונקיות עם כיסוי רשת בתא אקלים של 24 מעלות צלזיוס. לאחר שבוע, בדקו את הגביעים – וודאו שהזחלים בוקעים ובסוף השלב הראשון או השני המוקדם, זמן טוב להעברה לתזונה מלאכותית. מעבירים את הזחלים לתזונה מלאכותית בעזרת מברשת צבע, מחטאים אותם בתרסיס אקונומיקה ושטיפת מים בין מיכלי הזחלים. מעבירים שלושה זחלים לכל של 120 מ”ל. בעוד שהתזונה המלאכותית צפופה באנרגיה ויכולה לתמוך בצפיפות גבוהה של זחלים, הימנעו מאריזת הזחלים לכוסות, שכן מחלות ועובש יכולים להתפשט בכוסות עם צפיפות זחלים גבוהה. הניחו את הכוסות בפח פלסטיק בצדדיהן, כך שהפראס ייפול לתחתית הכוסות והרחק מהתזונה, ובכך יפחית את הסיכון לעובש ולמחלות.אחסנו את כוסות הדיאט בתנאי טמפרטורה מבוקרים עם רמות אור נמוכות עד בינוניות. יש לעקוב אחר הכוסות לאיתור עובש ומחלות כל 1-2 ימים על ידי הצצה דרך מכסי הכוסות השקופים. כוסות עם עובש או מחלה ניתן להסגר או להקפיא כדי למנוע התפשטות לכוסות אחרות. 4. הופעה וטיפול במבוגרים אפשרו לזחלים להתרבות ולצאת בכוסות הדיאטה. כאשר הבוגרים מגיחים, תנו להם כמה שעות עד שהכנפיים שלהם יתקשו לפני שתסירו אותן לסימון. הסר פרפרים בוגרים מהגביעים בידיים נקיות על ידי אחיזה עדינה בכנפיהם, וציין כי תפיסת כל ארבע הכנפיים קרוב יותר לגופם היא אחיזה יציבה יותר. כדי לסמן את הפרפרים, החזיקו פרטים יבשים ליד הראש ובית החזה והשתמשו בחדות עדינה כדי לסמן בעדינות מספר על הכנף האחורית שלהם.בני מין המשתמשים בשילוב של סימני כנפיים ואיברי מין; לנקבות יש בדרך כלל שני כתמים שחורים על המצח הגבי שלהן וכנפיים אחוריות כהות וצהבהבות יותר, בעוד שלזכרים יש בדרך כלל נקודה שחורה אחת קטנה יותר על המצח הגבי על רקע לבן בהיריותר 54. בהתחשב בכך שצבע זה מראה שונות אינדיבידואלית ועונתית, לאשר את המין באמצעות תכונות בטן – לזכרים יש שני אבזמים בקצה הדיסטלי של הבטן שלהם ובטן צרה יותר באופן כללי, בעוד שלנקבות יש פתח איברי מין יחיד. מעבירים את הבוגרים למעטפות זכוכית שעווה על ידי פתיחת המעטפה ביד אחת, החזקת הפרפר בראש ובבית החזה, החלקתו לתוך המעטפה, ותפיסת הכנפיים דרך המעטפה ביד השנייה.יש לוודא שכל ארבעת האגפים סגורים כרגיל בתוך המעטפה. שמרו על הפרפרים בתנאי קור (5-6 מעלות צלזיוס) עד שבוע לפני הניסוי, אך השאירו לפחות יום אחד להתאקלם כאשר מוציאים אותם מהמקרר. 5. מדדי ביצועים כדי למדוד תכונות כנפיים על פרטים מתים, הסירו את כנפי הפרפר על ידי החזקת בית החזה ביד אחת ושימוש במלקחיים כדי להסיר כל כנף בבסיסה. הניחו את הכנפיים שטוחות בקופסת תאורה וצלמו למדידות מאוחרות יותר. כדי לקבל הערכות של פריון, לשכן את הבוגרים בכלובי הזדווגות, המאפשר לפחות יום אחד להבשלת רבייה של זכרים ויום אחד להזדווגות. הקריבו נקבות בנקודות זמן קבועות לספירת ביצים באמצעות נתיחה, או אספו ביצים בכל יום על צמחים פונדקאים. כדי להעריך את עומסי הביצים, הסירו את בטנה של הנקבה, הניחו אותה בחיץ PBS 1x וחתכו חריץ לאורך הצד הגחוני.השתמש במלקחיים כדי להפריד את הקרביים מן הקוטיקולה, ולאחר מכן למשוך את השחלות הרחק מן המעיים, קנה הנשימה, ותוכן אחר של הבטן. שחררו את ארבע השחלות המסולסלות בתוך כל אחת משתי השחלות, ושימו לב היכן ביציות בוגרות, חלמוניות וקליפות עוברות לזקיקים לא בשלים. השתמשו במונה כדי לעזור לחשב את סך הביצים הבשלות, בדרך כלל בין 0-200 ביצים. כדי לקבוע את מצב ההזדווגות של נקבה מנותחת, פתחו את קופולטריקס הבורסה והפרידו את הזרעונים שבתוכו. כאשר הזרעונים מתעכלים, הם בדרך כלל מפתחים “זנב” ומקננים זה בתוך זה. 6. ניתוח מקרה הערה: נקבות פרפרים לבנים בוגרות נאספו מהטבע בשנת 2014 כדי למצוא את אוכלוסיות הניסוי. מקורן של נקבות בוגרות הוא ליד דייוויס, קליפורניה (N = 8 נקבות מייסדות). שיכון הפרפריםלשכן את הנקבות בכלובי רשת “BugDorm” (61 ס”מ x 61 ס”מ x 61 ס”מ) תחת אור טבעי בחממה. ספק עלה אורגני של כרוב הצמח המארח (Brassica oleracea) עבור ovipositioning. כדי לשמור על לחות בכלובים, כלול עציץ קטן (קוסמוס), מושקה מדי יום, מונח על גבי מגבת בתוך כל כלוב. אספו ביצים מדי יום על ידי העברת עלים עם ביצים חדשות לכוסות פלסטיק של 473 מ”ל עם חורים במכסה והניחו בתא אקלים. לספק לפרפרים גישה לתמיסת מי דבש 10% (המיוצרת על ידי דילול דבש אורגני במים מזוקקים), הנגישה דרך ספוג צהוב בצלחת פטרי קטנה המוחלפת מדי יום. הכנת דיאטות מלאכותיותלהכין דיאטות מלאכותיות עבור זחלים לבנים כרוב באמצעות שינויים של דיאטות Lepidoptera שפותחו בעבר4. אצווה אחת של דיאטה הכילה 50 גרם של נבט חיטה, 27 גרם קזאין, 10 גרם של תאית, 24 גרם של סוכרוז, 15 גרם של קמח כרוב, 9 גרם של תערובת מלח וסון, 12 גרם של שמרים Torula, 3.6 גרם של כולסטרול, 10.5 גרם של תערובת ויטמינים Vanderzant, 1.1 גרם של פרבן מתיל, 1.5 גרם של חומצה סורבית, 3 גרם חומצה אסקורבית ו-0.175 גרם סטרפטומיצין (ראו טבלת חומרים). שקלו מראש את המרכיבים היבשים עבור אצוות דיאטה מרובות (טבלה 1) וערבבו היטב כדי להגביר את ההומוגניות בין סוגי הדיאטה לפני שהם מחולקים לאצוות נפרדות לערבוב עם תמיסות מתכת. מניחים את החומרים היבשים בבלנדר עם שמן פשתן ואת תערובת המתכת המתאימה.הערה: שמן פשתן שימש בניסוי הנוכחי כפי שהוא נמכר על ידי ספק בעבר של דיאטות חרקים. עכשיו, שמן זרעי פשתן אורגני משמש באופן בלעדי, אשר עשוי מאותו צמח, אבל הוא פחות סביר להכיל כל תוספים כמו ספקים מסחריים של שמן פשתן. מזגו את התזונה המוכנה לכוסות מעדנייה מפלסטיק בנפח 118 מ”ל. השתמשו במלחי מתכת מסיסים כדי להוסיף מתכות מוקדיות לתזונה מלאכותית. יש לשאוף לריכוזי מתכות בהתבסס על תצפיות קודמות של תכולת המתכת של צמחים (למשל, הצטברות ניקל 55,56,57 או זיהום בצד הדרך של צמחים 58,59,60) וסבילות של מתכות בלפידופטרות אחרות 49,50,51. יש להמיס מלחי מתכת ב-500-1,000 מ”ל מים מזוקקים לפני נטילת הכמויות המתאימות לתזונה מלאכותית. לדוגמה, כדי לבצע את דיאטת הניקל של 100 ppm, הוסף 317.6 מ”ל של תמיסת 1 M NiCl2 לתזונה המלאכותית לפני הערבוב כדי לתת ריכוז דיאטה סופי של 100 מ”ג / גרם Ni משקל יבש (כ 53 מ”ג / גרם משקל רטוב). כמות זו מתורגמת לריכוז נמדד ממוצע של 109.6 ppm (טבלה 2) בהתבסס על ספקטרוסקופיית פליטה אטומית פלזמה מצומדת אינדוקטיבית.הערה: רמות המתכות הוערכו על ידי מעבדות המחקר האנליטיות של אוניברסיטת מינסוטה עם שש דגימות. אחזקהשמרו על הביצים שנקטפו על צמחים פונדקאים בתאי אקלים בטמפרטורה של 23°C (7 °F) בפוטו-פרקי זמן של 14:10 למשך 7 ימים. לאחר מכן, להעביר את הזחלים instar השני מוקדם לתזונה מלאכותית. בעת ההעברה, חלקו באופן שווה את הזחלים מצמח נתון על פני ארבעת סוגי התזונה כדי למנוע בלבול בין קבוצות הזחלים לבין סוג הדיאטה. העבירו את הזחלים (N = 346 בסך הכל) כשני פרטים לכל דיאטה של 118 מ”ל כדי להפחית את שכיחות המחלה מצפיפות יתר ולאפשר מקום רב למבוגרים להתקרב בסופו של דבר. חורי ניקוב (שלושה בכל מכסה) במכסים של כוסות הגידול. הניחו את הכוסות בפחי פלסטיק בגודל קופסת נעליים לגידול, כאשר הדיאטות השונות משולבות זו בזו כדי למנוע השפעות שיטתיות של מיקום בחדר הגידול. אחסנו את כוסות הזחלים בתאי אקלים בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס בשעה 14:10 (עם פחי מים בתחתית התא כדי לשמור על לחות סביב 50%-60%, מנוטרים באמצעות חיישן לחות ביתי). במקרה שהכוסות הפכו לעובשות (כשמונה כוסות בסך הכל במקרה זה), הוציאו את הכוסות מהחדר והוציאו את האנשים האלה מהניסוי. אפשרו לזחלים להתרבות ולהופיע בגביעי הגידול (N = 162 בסך הכל).הערה: עבור תנאי הגידול במחקר זה, זמן ההתפתחות מאיסוף הביצים ועד הופעתן של בוגרות היה בממוצע סביב 25-30 יום (נע בין 20-40 יום, למשל, 25,28). כאשר הגלמים מתקרבים להופעתם של בוגרים, בדקו את הכוסות מדי יום לאיתור פרטים שזה עתה נסגרו והוציאו בוגרים עם כנפיים מיובשות. תייגו את הבוגרים על הכנפיים האחוריות שלהם עם המספר האישי המתאים להם (שהוקצה בעת העברת הזחל) באמצעות שארפ שחור בעל קצוות עדינים. לקבוע את מינו של כל אדם ולסמן על מעטפה זכוכית יחד עם מספרם ותאריך הופעתם. מניחים את הפרפרים הבוגרים במעטפות זכוכית ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C עד לעיבוד נוסף.הערה: חלק קטן מהבוגרים המתעוררים מראים עיוותים בכנפיים שיפריעו לתעופה ולהישרדות הבוגרים (5%-8%); אנשים אלה אינם נכללים בניתוחי הישרדות עבור ניסויים אלה. מדידה וניתוח נתוניםמדדו את ההישרדות כהישרדות מהכוכב השני (כאשר הזחלים הוכנסו לדיאטה) ועד הופעתם של בוגרים.הערה: המחקר הנוכחי התמקד בהישרדות ובזמן התפתחות כמדדים לביצועים בדיאטות השונות. מדדו את זמן ההתפתחות כמספר הימים בין המעבר לתזונה לבין הופעת המבוגרים בתא האקלים. לצורך ניתוח נתונים, הפעל שתי קבוצות של מודלים שכללו אינטראקציות בין המתכת לריכוז.הערה: מכיוון ששתי האינטראקציות היו משמעותיות (F 2,194 = 4.56, p = 0.01 לזמן פיתוח ו- X2 = 12.1, p = 0.002 להישרדות), המחקר המשיך בניתוח נפרד של כל מתכת. כדי לנתח הישרדות, ערכו בדיקות צ’י-ריבוע עבור כל מתכת כדי לבחון את ההשפעות של מינון המתכת (המטופל כארבע קטגוריות) על הישרדות לבגרות עם כנפיים שלמות לחלוטין. כאשר מזוהה השפעה משמעותית של המינון, בצע מעקב chi-square כדי להשוות כל רמה לדיאטת הביקורת. כדי לנתח את זמן ההתפתחות (מרגע ההעברה להופעה כמבוגר), לבדוק השפעות של מין על זמן ההתפתחות.הערה: מכיוון שלא הייתה השפעה של מין על זמן הפיתוח, (p > 0.10) עבור מתכת כלשהי בניסוי זה, הורדנו אותה מהשיקול במודל. הפעל ANOVA נפרד עבור כל מתכת כדי לבדוק את ההשפעה של ארבעת הריכוזים על זמן הפיתוח. בנוסף, הפעל בדיקות t עבור כל ריכוז ביחס לבקרה כדי לקבוע את הריכוז המינימלי שבו נראה אפקט ביצועים.הערה: במחקר זה, JMP v16 שימש לכל הניתוחים. כל הנתונים הגולמיים זמינים ב- Mendeley61.

Representative Results

סקירהניתן להשתמש בתזונה מלאכותית כדי לגדל פרפרים לבנים של כרוב בתנאים סטנדרטיים כדי לבדוק את ההשפעות של רכיבי תזונה מסוימים על ביצועי הפרפרים. בעבודה הנוכחית השתמשו בדיאטות מלאכותיות כדי לחקור את הרעילות של מתכות שונות שנמצאו בצמחים פונדקאים שגדלים באזורים מזוהמים (איור 1). הזחלים גודלו על דיאטות שהכילו ריכוזים הולכים וגדלים של שלוש מתכות שונות (איור 2; פרטים מתודולוגיים ספציפיים שהוצגו בסעיף 6 של הפרוטוקול). הישרדות והתפתחות פרפרים הושפעו יותר מנחושת ואבץ והכי פחות מניקל (איור 3 ואיור 4), עם רגישות דומה למחקרים אחרים עם פרפרים ועשים שגדלו על תזונה מלאכותית (איור 5). הישרדותזחלי הפרפרים הועברו לתזונה מלאכותית שהכילה נחושת, ניקל, אבץ או קבוצת ביקורת, שבה ריכוז כל סוג מתכת השתנה בשלוש רמות (טבלה 3). תמונה מייצגת של זחלים במינון הולך וגדל של רעלן מוצגת באיור 2. לא הייתה השפעה של ריכוז המתכות על הישרדות הניקל, אבל הייתה השפעה משמעותית גם על נחושת וגם על אבץ (טבלה 3 ואיור 3). השוואות צ’י-ריבוע פוסט-הוק הראו כי אבץ הראה ירידה בהישרדות ביחס לדיאטת הביקורת רק ברמה הגבוהה ביותר של אבץ (1,000 ppm, השוואה פוסט-הוק X12 = 8.41, p = 0.004; איור 1). נחושת גם הראתה ירידה משמעותית בהישרדות רק ברמות הגבוהות ביותר בשימוש (500 ppm, X12 = 7.00, p = 0.008), אם כי הייתה עלייה מועילה לא משמעותית בהישרדות בשתי הרמות הנמוכות ביותר (50 ppm ו- 100 ppm; איור 3). זמן פיתוחנמצאה השפעה משמעותית של ריכוז נחושת ואבץ על זמן הפיתוח (טבלה 4 ואיור 4). ככל שריכוז הנחושת עלה, חלה עלייה בזמן הפיתוח, עם סטייה משמעותית מהבקרה החל מ-50 ppm (p = 0.027; איור 3). ככל שריכוז האבץ עלה, חלה עלייה בזמן הפיתוח, עם סטייה משמעותית מהבקרה שהחלה ב-100 ppm (p = 0.03; איור 4). הייתה מגמה של הגדלת הניקל כדי לגרום לזמני התפתחות ארוכים יותר (p = 0.08; טבלה 4), והשוואות של כל דיאטה עם קבוצת הביקורת הראו השפעות משמעותיות החל מ-100 חל”מ (p = 0.022; איור 4). איור 1: רמות נצפות של מתכות מוקדיות ברקמת פרפר ובצמחים מארחים . (נתוניםמ-62.) רמות של נחושת, ניקל ואבץ הודגמו ברקמת פרפר פייריס (שגודלה על בוק צ’וי במעבדה) ובחרדל שנאסף בטבע (Bertorea sp). מכוניות מציינות את הרמות הנראות בעלי צמחים לאורך כבישים עמוסי תנועה53. רמות המתכות בתזונה מלאכותית ששימשו במחקר זה מדווחות בטבלה 1; נקודות מייצגות אמצעים, וסרגלי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: תמונה של זחלים לבנים של כרוב שהועברו באותו יום לתזונה מלאכותית של ריכוז הולך וגדל של רעלן. תמונה זו מציגה זחלים ממחקר מנה-תגובה (הוצג ב-28 באמצעות חומר צמחי מיובש עבור הצמח הרעיל אריסטולוצ’יה). צילום: ESR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: שונות בהישרדות בין דיאטות מתכת של ריכוזים הולכים וגדלים. כוכביות מצביעות על סטייה משמעותית בהישרדות ביחס לדיאטת הביקורת. ריכוזי המתכות המדויקים בתזונה מפורטים בטבלה 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: השפעות ריכוז המתכות על זמן הפיתוח. הכוכביות מציינות את ריכוז המתכת הנמוך ביותר עבורו יש הבדל משמעותי ביחס לבקרה (באמצעות מבחן t). ריכוזי המתכות המדויקים בתזונה מפורטים בטבלה 2. נקודות מייצגות אמצעים, וסרגלי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: סיכום סבילות למתכות בלפידופטרות אחרות. מוצגים נתוני הישרדות מורכבים מ-11 מחקרים קיימים 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68. משתנה התגובה הוא רמת ריכוז המתכות (ב-ppm) שבה נראות לראשונה השפעות שליליות על הישרדות. פרפרים מצביעים על תוצאות מחקר זה, ומציינים כי ערכי הסבילות לניקל היו גבוהים יותר מאלה שנמדדו במחקר זה. נקודות מייצגות אמצעים, וסרגלי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. מרכיב לשקול כ g מ”ל נבט חיטה רכיבים יבשים 50 תאית רכיבים יבשים 10 קמח כרוב רכיבים יבשים 15 קזאין רכיבים יבשים 27 סוכרוז רכיבים יבשים 24 תערובת מלח ווסון רכיבים יבשים 9 שמרי טורולה רכיבים יבשים 12 כולסטרול רכיבים יבשים 3.6 תערובת ויטמינים רכיבים יבשים 10.5 מתיל פרבן רכיבים יבשים 0.75 חומצה סורבית רכיבים יבשים 1.5 חומצה אסקורבית רכיבים יבשים 3 סטרפטומיצין רכיבים יבשים 0.175 שמן זרעי פשתן מרכיבים רטובים 5 אגר אגר 15 טבלה 1: מתכון לתזונה מלאכותית. מוצגים המשקלים (והנפחים) של המרכיבים במנה אחת של דיאטת פרפר לבן כרוב. החומרים היבשים (ושמן זרעי פשתן) מוכנים בנפרד מתערובת האגר (מומסים ב 400 מ”ל מים רותחים, ואז מביאים לטמפרטורה קרירה יותר עם 400 מ”ל מים בטמפרטורת החדר). סוג דיאטה נחושת (ppm) ניקל (ppm) אבץ (ppm) נחושת-“100 עמודים לדקה” 96.1 1.75 69.9 ניקל-“100 עמודים לדקה” 7.29 109.6 68.9 אבץ-“100 חל”מ” 7.96 1.06 186.2 אבץ-“500 חל”מ” 6.51 1.16 708 לשלוט 5.89 0.59 59.3 טבלה 2: מדידות של מתכות בדיאטות. מוצגות הרמות הממוצעות של נחושת, ניקל ואבץ בתת-קבוצה של התזונה המלאכותית ששימשה במחקר. שם הדיאטה (“סוג” בניתוח) מוצג בצד שמאל, כאשר הערכים במרכאות הם הרמה המחושבת. ריכוז היעד מוצג במרכאות. תת-קבוצה של דיאטות ששימשו במחקר נותחה כדי לוודא שהערכים המחושבים היו על היעד עם ערכים ממומשים; יש לציין כי לעתים קרובות יש מידה קטנה של שונות בהרכב רכיבי הדיאטה, וכל שורה המדווחת מייצגת רק שכפול אחד. אנילאאל פירסון X32 P נחושת (N = 118) 17.82 0.0005 ניקל (N = 152) 3.45 0.33 אבץ (N = 152) 12.52 0.006 טבלה 3: השפעות ריכוז המתכות על הישרדות. מוצגות תוצאות של בדיקת chi-square עבור כל מתכת, בניגוד לשלושה ריכוזים של מתכת ביחס לדיאטת ביקורת. מתכת F P נחושת (N = 61) F3,57 = 9.84 <0.0001 ניקל (N = 75) F3,71 = 2.35 0.079 אבץ (N = 64) F3,60= 3.79 0.015 טבלה 4: השפעות ריכוז המתכות על זמן הפיתוח. מוצגות התוצאות של ANOVAs בודדים עבור כל מתכת. זמינות נתונים: כל הנתונים זמינים במנדלי61.

Discussion

במחקר זה, פרפרים לבנים מכרוב (Pieris rapae) גודלו על תזונה מלאכותית כדי לבחון הבדלים ברעילות מתכות כבדות. בעשותו כן, מחקר זה מספק שיטות כלליות לגידול ומחקרי מעבדה של מערכת פרפרים קלה למניפולציה זו. דיון זה בוחן תחילה שאלות כלליות יותר על השיטות שנסקרו כאן, ולאחר מכן סוקר את הממצאים המדעיים שלנו לפני שהוא מסיים בהרהורים על מרכיבי התזונה המלאכותית.

הפרוטוקול הנסקר כאן נותן שלבים של שיטת גידול כללית לפרפרים לבנים כרוב, אך ישנן נקודות רבות בתוך פרוטוקול זה שניתן לשנות. לדוגמה, בעוד שמקרה המבחן המוצג כאן משתמש בספוגים להאכלה, לחוקרים אחרים היה מזל עם פתיליות שיניים ופרחי משי מלאים במי דבש5. בעוד המחקר הנוכחי משתמש במי דבש כמזון, חוקרים אחרים השתמשו בתמיסות סוכר ואפילו Gatorade. אם יש צורך לשקול גלמים, או להעביר אותם לתנאים אחרים להופעתם (למשל, גרימת דיאפאוזה וצורך לאחסן קר במשך חודש אחד), החוקר יכול בקלות להסיר אותם מהכוסות על ידי התזת אותם במים כדי להרטיב את אביזרי המשי שלהם ולתפוס אותם עם מלקחיים נוצות, ואז לתלות אותם מחדש באמצעות סרט דו-צדדי. אם החוקרים זקוקים לגמישות רבה יותר במונחים של העברת פרפרים בוגרים לכלובים לצורך התנהגות בוגרת, ניתן להחזיק אותם במקרר במשך מספר שבועות, אך יש להאכיל אותם. כל כמה ימים יש להוציא את הפרפרים כדי להאכיל אותם בתמיסת מי דבש מדוללים. תחת תאורה פנימית, זה יכול להיעשות על ידי שימוש בסיכה כדי לפתוח את החוטם שלהם לתוך האוכל. בצד הביצועים של המבוגרים, ניתן לנקוט במגוון רחב של אמצעי כושר על פרפרים לבנים כרוב. ניתן למדוד את גודל הגוף כמסה הרטובה או היבשה של הזחלים בשלבים מסוימים, הגלמים או הבוגרים (שהוקרבו או הוחזקו במעטפות זכוכית), או באמצעות מדידת אורך הכנפיים בתוכנית ImageJ (ראו 12,24,25,28). ניתן למדוד את אורך החיים של נקבות באמצעות איסוף ביצים יומי על צמחים פונדקאים 25,69,70, וניתן למדוד את גודלן של תכונות ספציפיות כמדד לביצועים; לדוגמה, המסה או הנפח של המוח או אזורי מוח בודדים 62,71,72, או המסה או תכולת החלבון של בית החזה או שריר התעופה 62,70. לבסוף, ניתן להשתמש במבוגרים במחקרים התנהגותיים כדי לבחון מספר רב של שאלות הבוחנות את ההשפעה של מניפולציה תזונתית על ליקוט מזון או בחירת אוביפוזיציה27,73.

אם פרוטוקול הגידול אינו פועל כצפוי, יש לפתור כמה היבטים. ראשית, ניתן לשאול האם רמות האור גבוהות מספיק כדי לעורר התנהגות נורמלית של מבוגרים. בעוד שקווים מותאמים למעבדה של פייריס יטילו ביצים תחת אור פלואורסצנטי, האור המלאכותי היחיד שעובד עבור קווים מסוג בר הוא אורות חממה חזקים בעלי ספקטרום רחב. אור טבעי בחממות, אדן החלון או בחוץ פועל בצורה הטובה ביותר כדי לעורר התנהגות הזדווגות והטלת ביצים. שנית, אם ביצים אינן בוקעות או אם הזחלים מתים בשלב מוקדם בהתפתחות, יש כמה דברים שיש לקחת בחשבון. החומר הצמחי המארח חייב להיות אורגני, וציין כי צמחים “אורגניים” מחנויות מטופלים לפעמים בכימיקלים שיכולים להרוג זחלים, כך שגידול צמחים פונדקאים הוא לעתים קרובות הטוב ביותר. אם שיעור הקבלה של הפונדקאי נמוך יותר, ניתן לנסות עלים צעירים יותר עם תכולת חנקן גבוהה יותר, להציג עציצים במקום עלים בודדים ולהבטיח הזדווגות של נקבות. הנקבות יקבלו זריעת ברסיסיקה, אפילו נבטים קטנים בני שבועיים. שיטת הפרפין פועלת היטב להעברת ביצים לתנאים שונים, אך יש לציין כי שיעור הקבלה נוטה להיות נמוך יותר מאשר צמחים שלמים. שלישית, כל מרכיבי הדיאטה חייבים להיות באיכות גבוהה ולא פג תוקפם. שמן זרעי פשתן יש להחליף מדי שנה ולאחסן במקרר24,25. נבט חיטה, תערובת ויטמינים, אנטיביוטיקה צריך גם להישמר מגניב. רביעית, אפשר לשקול לשנות את מערך כוסות הדיאטה. ניתן להשתמש בכל סוגי כוסות הפלסטיק החד-פעמיות לגידול, החל מאונקיה אחת ועד 15 אונקיות. מצאנו כי 4 אונקיות הוא גודל טוב כדי לאפשר הופעה בוגרת ונארז יפה לתוך תאי האקלים שלנו. חורים שננעצים בעפעפיים מאפשרים זרימת אוויר, אבל יותר מדי חורים יכולים לייבש את התזונה בתנאי לחות נמוכה, ולכן ייתכן שיהיה צורך להתאים את המספר הזה. חמישית, ייתכן שיהיה צורך להתאים את התנאים בתא האקלים בשילוב עם תנאי הגביע. אם התנאים יבשים מדי, צמחים פונדקאים עם ביצים עשויים להתייבש לפני שניתן להעביר את הזחלים, וכוסות עם תזונה עשויות להתייבש לפני הופעת הפרפרים. מצד שני, אם התנאים רטובים מדי, הכוסות יכולות להכיל עובש ומחלות. ייתכן שהחוקרים יצטרכו להתאים את זרימת האוויר בכוסות באמצעות מכסי רשת, או פחות או יותר חורים בעפעפיים. בעיה נפוצה נוספת היא אורות התא הבהירים מספיק כדי לגרום לתנודות טמפרטורה בכוסות ולהצטברות של עיבוי; שימוש בנורות עמעם הוא אפשרות קלה לגידול זחלים.

באשר לשאלות המחקר במאמר זה, מחקר זה מצא כי לבנים כרוב היו רגישים יותר לנחושת מאשר לניקל או אבץ. לנחושת היו השפעות שליליות משמעותיות על זמן הפיתוח בריכוזים נמוכים של עד 50 ppm (איור 3 וטבלה 3) ועל הישרדות ב-500 ppm (איור 4, טבלה 4). לעומת זאת, לא היו השפעות שליליות של ניקל על הישרדות (עד 500 ppm; איור 3) או השפעות שליליות על זמן הפיתוח של 100 ppm (איור 4). חלבוני כרוב היו די סובלניים לאבץ, עם השפעות הישרדות שנצפו רק ב-1,000 ppm (איור 3) והשפעות שליליות על זמן ההתפתחות החל מ-100 ppm (איור 4). בהתבסס על ריכוזים גבוהים יחסית של אבץ ברקמת הפרפר ובחרדל (הצמח המארח שלהם; איור 1), היה צפוי לראות סבילות גדולה יחסית לאבץ. אולם הרגישות לנחושת והסבילות לניקל היו מעט בלתי צפויות בהתחשב ברמות הנמוכות מאוד של ניקל ברקמת הפרפר (איור 1) והצורך בנחושת כמיקרו-נוטריאנטים. ממצאים בלתי צפויים אלה יידונו להלן לאחר בחינת הסבילות של מתכות אלה בפרפרים ועשים אחרים.

כדי להשוות את הנתונים הנוכחיים עם רגישות המתכות שנמדדו בלפידופטרות אחרות, נאספו נתונים ממחקרים קיימים על הריכוז המינימלי, שבו מתכות כבדות השפיעו לרעה על הישרדות 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; מחקרים אלה התמקדו בעשים, במיוחד מיני מזיקים (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp). כל ערכי הרגישות שנמדדו במחקר הזה קרובים לטווח שנמדד עבור המינים האחרים האלה (איור 5). עם זאת, נראה כי מדד הסבילות לניקל במחקר זה גבוה מהצפוי – בעוד שלא הייתה השפעה משמעותית של הישרדות ב-500 ppm, המחקר הקודם על Pieris rapae מצא גם סבילות גבוהה מאוד לניקל (השפעות משמעותיות החל מ-1,000 ppm56), למרות רמות נמוכות ברקמה שלהם באופן טבעי (איור 1). נראה כי מדד הרגישות לנחושת במחקר זה נמצא גם בקצה הנמוך ביותר עבור מחקרים על לפידופטרה. בעוד ששימוש בתזונה מלאכותית מאפשר השוואה נוחה ומבוקרת של רגישות יחסית למתכות, חשוב לציין כי רכיבי התזונה עלולים לשנות את מדידת הרגישות האבסולוטית למתכות. לדוגמה, ויטמין C בתזונה יכול לקזז עקה חמצונית הנגרמת על ידי מתכות74, או אנטיביוטיקה בתזונה יכולה לשנות את כל ההשפעות של חיידקים על עיבוד של מתכות75. קו מעניין של מחקר עתידי יהיה לבצע מניפולציה שיטתית של רכיבי תזונה כאלה כדי לבחון השפעות על רעילות מתכות, במיוחד בהתחשב בשאלות על התפקיד התפקודי של חיידקי המעי לפידופטרן 76,77 ורכיבי צוף שעשויים להיות בעלי תכונות נוגדות חמצון78. בנוסף, שונות בדרישות התזונתיות בין מינים שונים יכולה להפוך את ההשוואות הבין-ספציפיות למאתגרות, ויש להשלים שיטות מבוססות תזונה מלאכותית עם מניפולציות של צמחים מארחים.

פרפרים אלה סובלניים במיוחד לניקל ורגישים לנחושת. מחקרים קודמים ציינו כי צמחים רבים ממשפחת החרדל, הכוללת צמחים המועדפים על ידי Pieridae, צוברים ניקל יתר על המידה כמנגנון הגנה מפני אוכלי עשב 55,56,63,79,80,81. הצטברות היתר הזו היא יותר מ-1,000 ppm ברקמת הצמח, שהיא בסדר גודל גדול יותר ממה שנראה ברוב הצמחים (איור 1). ייתכן כי לפיריס יש סיבולת גבוהה במיוחד לניקל בשל ברירה בעבר על ידי מצברי ניקל כאלה, כפי ששיערו בעבר26. בעוד נחושת נחקרה לעתים רחוקות יותר כמיקרו-נוטריאנטים בתזונת חרקים, יש כמה ראיות לכך שהיא ממלאת תפקיד קטן ברבייה ובחסינות, אם כי בעיקר בחרקים הניזונים מדם (למשל, 82,83). ייתכן שנחושת ממלאת תפקיד פיזיולוגי פחות חשוב בפרפרים מאשר אצל בעלי חיים אחרים 84,85,86, דבר העולה בקנה אחד עם עבודות עדכניות המדגישות כיצד נחושת עשויה להיות מזהמת חרקים כמו עופרת, קדמיום וכספית (למשל, 87,88,89). בעוד שפיריס הוכח כמונע זיהום נחושת ברמות נמוכות90, הניידות של נחושת בצמחים (למשל, מעבר לעלים ופרחים) סימנה אותה גם כמזהם מתכתי מדאיג91.

בעוד שתוצאות אלה מספקות נתונים מעניינים על הרעילות היחסית של מתכות אלה לפרפרים לבנים כרוב, מאמר זה שואף גם להיות בשימוש כללי כהמחשה חזותית מפורטת של שיטות לגידול מערכת רבת עוצמה זו. לבני כרוב קלים לגידול ולתמרון בניסויי מעבדה מבוקרים 4,5 המאפשרים מחקרים של חיפוש פונדקאי 6,7,8, ליקוט מזון 9,10,11 וברירה מינית12,13,14. היכולת לגדל פרפרים אלה על תזונה מלאכותית היא המפתח ליצירת תנאי גינה נפוצים להשוואות ולתפעל חומרים מזינים, רעלים ואפילו צמחים פונדקאים חדשים. עם זאת, חשוב לציין כי תזונה מלאכותית זו אינה בהכרח התזונה המלאכותית האופטימלית עבור מין זה, וסביר להניח שניתן לשפר אותה באמצעות מניפולציות עתידיות. לדוגמה, תערובת המלח בתזונה זו (ובדיאטות לפידופטרניות אחרות) פותחה במקור עבור בעלי חוליות ויש לה רמות סידן גבוהות יותר ממה שרוב החרקים זקוקים לו92,93. לכן, חלק ממאמצי הגידול שלנו יצרו תערובות מלח מותאמות אישית עם רמות סידן נמוכות יותר (למשל, 62), ואחרים עושים שימוש ב”תערובת המלח של בק”, שעשויה להתאים יותר למיני חרקים רבים94. במניפולציות שלנו, מצאנו גם שהפרפרים הפגינו ביצועים טובים יותר עם פחות נבט חיטה יחסית ויחסית יותר תאית בהשוואה לריכוזים המקוריים4. תחום אחד הזקוק לתשומת לב נוספת הוא מקור השומנים והריכוז בתזונה. לדוגמה, עבודות קודמות הראו כי המעבר משמן פשתן (המשמש במחקר זה) לפוספוליפידים הגביר את שיעורי ההזדווגות ואת שיעורי הצמיחה של Pieris על דיאטות מלאכותיות95. תוספת של חומצות שומן ספציפיות בתזונה מלאכותית עשויה להיות בעלת השפעות חיוביות נוספות96,97. אופטימיזציה של התזונה המלאכותית של Pieris98,99 יוצרת הזדמנויות לענות על שאלות מעניינות על אקולוגיה תזונתית 100,101,102, אקולוגיה אבולוציונית ואקוטוקסיקולוגיה. גישות תזונה מלאכותית אלה מאפשרות לחוקרים לענות על שאלות לגבי תפקידם של שומנים ספציפיים באבולוציה קוגניטיבית 103, טרום הסתגלות לרעלים28, רכיבים תזונתיים המפחיתים את רעילות המזהמים 104, או אינטראקציות סטויכיומטריות בין חומרים מזינים105.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו אסירי תודה על התמיכה מעוזרי תואר ראשון במהלך הגידול לעבודה זו, במיוחד רג’ינה קורנדינה, ריאה סמיקלסקי. קרולין קלינובסקי סייעה לחבר ספרות על רעילות מתכות בלפידופטרות אחרות. עבודה זו התאפשרה הודות למענק מחקר קיץ של המחלקה לאקולוגיה, אבולוציה והתנהגות באוניברסיטת מינסוטה.

Materials

1-L Pyrex beaker Fisher Scientific 07-250-059
500 mL graduated cylinder Fisher Scientific 03-007-43
60-mm plastic petri dish lid Fisher Scientific 08-757-100B
Ascorbic Acid Frontier 6015
Blender Amazon – Ninja Store BL610 Professional
Cabbage Flour Frontier 1086
Casein Frontier 1100
Celluose Frontier 3425
Cholsterol Sigma C3045
Cups for rearing (4 oz) Wasserstrom 6094583 purchase with matching lids
Fine Mesh Agar Sigma
Flaxseed Oil amazon B004R63VI6
Floral water tubes, 2.8 x 0.8inch Amazon – Yimaa Direct B08BZ969DK
Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES) Amazon – Wizard Coin Supply B0045FG90G
Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6") Amazon B07SK6P94S
Methyl Paraben Frontier 7685
Ohaus Portable Scale Fisher Scientific 02-112-228
Organic Honey Amazon B07DHQQFGM
Photo studio portable lightbox Amazon B07T6TNYJ1
Plastic bin, shoebox size Amazon B09L3B3V1R
Plastic disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-680-50
Sorbic Acid Sigma S1626
Spatulas Fisher Scientific 14-357Q
Streptomycin Sigma S9137
Sucrose Target
Torula Yeast Frontier 1720
Vanderzant vitamin mix Frontier F8045
Weigh boats Fisher Scientific 01-549-750
Wesson Salt Mix Frontier F8680
Wheat Germ Frontier G1659
Wooden handled butterfly net, 12" hoop Amazon – Educational Science B00O5JDLVC
Yellow sponges Amazon-Celox B0B8HTHY5B
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Snyder, L. D., Gomez, M. I., Mudrak, E. L., Power, A. G. Landscape-dependent effects of varietal mixtures on insect pest control and implications for farmer profits. Ecological Applications. 31 (2), 2246 (2021).
  2. Shelton, A., Andaloro, J. T., Barnards, J. Effects of cabbage looper, imported cabbageworm, and diamondback moth on fresh market and processing cabbage. Journal of Economic Entomology. 75 (4), 742-745 (1982).
  3. Cartea, M. E., Padilla, G., Vilar, M., Velasco, P. Incidence of the major Brassica pests in northwestern Spain. Journal of Economic Entomology. 102 (2), 767-773 (2009).
  4. Troetschler, R. G., Malone, C. M., Bucago, E. R., Johnston, M. R. System for rearing Pieris rapae (Lepidoptera: Pieridae) on a noncruciferous artificial diet developed for Manduca sexta (Lepidoptera: Sphingidae). Journal of Economic Entomology. 78 (6), 1521-1523 (1985).
  5. Webb, S., Shelton, A. Laboratory rearing of the imported cabbageworm. New Yorks Food and Life Sciences Bulletin. 122, 1-6 (1988).
  6. Root, R. B., Kareiva, P. M. The search for resources by cabbage butterflies (Pieris rapae): ecological consequences and adaptive significance of Markovian movements in a patchy environment. Ecology. 65 (1), 147-165 (1984).
  7. Hern, A., Edwards-Jones, G., McKinlay, R. G. A review of the pre-oviposition behaviour of the small cabbage white butterfly, Pieris rapae (Lepidoptera: Pieridae). Annals of Applied Biology. 128 (2), 349-371 (1996).
  8. Renwick, J. A. A., Radke, C. D. Sensory cues in host selection for oviposition by the cabbage butterfly, Pieris-Rapae. Journal of Insect Physiology. 34 (3), 251-257 (1988).
  9. Lewis, A. C. Memory constraints and flower choice in Pieris rapae. Science. 232 (4752), 863-865 (1986).
  10. Kandori, I., Ohsaki, N. The learning abilities of the white cabbage butterfly, Pieris rapae, foraging for flowers. Researches on Population Ecology. 38, 111-117 (1996).
  11. Alm, J., Ohmeiss, T. E., Lanza, J., Vriesenga, L. Preference of cabbage white butterflies and honey-bees for nectar that contains amino-acids. Oecologia. 84 (1), 53-57 (1990).
  12. Espeset, A., et al. Anthropogenic increases in nutrients alter sexual selection dynamics: a case study in butterflies. Behavioral Ecology. 30 (3), 598-608 (2019).
  13. Tigreros, N. Linking nutrition and sexual selection across life stages in a model butterfly system. Functional Ecology. 27 (1), 145-154 (2013).
  14. Morehouse, N. I., Rutowski, R. L. In the eyes of the beholders: female choice and avian predation risk associated with an exaggerated male butterfly color. American Naturalist. 176 (6), 768-784 (2010).
  15. Stoehr, A. M., Goux, H. Seasonal phenotypic plasticity of wing melanisation in the cabbage white butterfly, Pieris rapae L. (Lepidoptera: Pieridae). Ecological Entomology. 33 (1), 137-143 (2008).
  16. Stoehr, A. M., Walker, J. F., Monteiro, A. Spalt expression and the development of melanic color patterns in pierid butterflies. Evodevo. 4 (1), 6 (2013).
  17. Stoehr, A. M., Wojan, E. M. Multiple cues influence multiple traits in the phenotypically plastic melanization of the cabbage white butterfly. Oecologia. 182 (3), 691-701 (2016).
  18. Ryan, S. F., et al. Global invasion history of the agricultural pest butterfly Pieris rapae revealed with genomics and citizen science. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 20015-20024 (2019).
  19. Snell-Rood, E. C., Papaj, D. R. Patterns of phenotypic plasticity in common and rare environments: a study of host use and color learning in the cabbage white butterfly Pieris rapae. American Naturalist. 173 (5), 615-631 (2009).
  20. Kono, Y. Rearing Pieris rapae crucivora Boisduval (Lepidoptera: Pieridae) on artificial diets. Applied Entomology and Zoology. 3 (2), 96-98 (1968).
  21. Parra, J. R. . The Evolution of Artificial Diets and their Interactions in Science and Technology. Insect Bioecology and Nutrition for Integrated Pest Management. , (2012).
  22. Morehouse, N. I., Rutowski, R. L. Developmental responses to variable diet composition in a butterfly: the role of nitrogen, carbohydrates and genotype. Oikos. 119 (4), 636-645 (2010).
  23. Rotem, K., Agrawal, A. A., Kott, L. Parental effects in Pieris rapae in response to variation in food quality: adaptive plasticity across generations. Ecological Entomology. 28 (2), 211-218 (2003).
  24. Shephard, A. M., et al. Assessing zinc tolerance in two butterfly species: consequences for conservation in polluted environments. Insect Conservation and Diversity. 13 (2), 201-210 (2020).
  25. Shephard, A. M., Zambre, A. M., Snell-Rood, E. C. Evaluating costs of heavy metal tolerance in a widely distributed, invasive butterfly. Evolutionary Applications. 14 (5), 1390-1402 (2021).
  26. Kobiela, M. E., Snell-Rood, E. C. Nickel exposure has complex transgenerational effects in a butterfly. Integrative and Comparative Biology. 58 (5), 1008-1017 (2018).
  27. Philips, K. H., Kobiela, M. E., Snell-Rood, E. C. Developmental lead exposure has mixed effects on butterfly cognitive processes. Animal Cognition. 20 (1), 87-96 (2017).
  28. Sikkink, K. L., et al. Tolerance of novel toxins through generalized mechanism simulating gradual host shifts of butterflies. American Naturalist. 195 (3), 485-503 (2020).
  29. Pentzold, S., et al. excretion and avoidance of cyanogenic glucosides in insects with different feeding specialisations. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 66, 119-128 (2015).
  30. Lampert, E. C., Dyer, L. A., Bowers, M. D. Dietary specialization and the effects of plant species on potential multitrophic interactions of three species of nymphaline caterpillars. Entomologia Experimentalis et Applicata. 153 (3), 207-216 (2014).
  31. Genc, H., Nation, J. L. An artificial diet for the butterfly Phyciodes phaon (Lepidoptera: Nymphalidae). Florida Entomologist. 87 (2), 194-198 (2004).
  32. Brinton, F., Proverbs, M., Carty, B. Artificial diet for mass production of the codling moth, Carpocapsa Pomonella (Lepidoptera: Olethreutidae)1. The Canadian Entomologist. 101 (6), 577-584 (1969).
  33. Metwally, H. M., et al. Low cost artificial diet for rearing the greater wax moth, Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae) as a host for entomopathogenic nematodes. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 22 (1), 15 (2012).
  34. Carpenter, J. E., Bloem, S. Interaction between insect strain and artificial diet in diamondback moth development and reproduction. Entomologia Experimentalis et Applicata. 102 (3), 283-294 (2002).
  35. Jaiswal, A., Verma, A., Jaiswal, P. Detrimental effects of heavy metals in soil, plants, and aquatic ecosystems and in humans. Journal of Environmental Pathology Toxicology and Oncology. 37 (3), 183-197 (2018).
  36. Kumar, A., et al. Lead toxicity: Health hazards, influence on food chain, and sustainable remediation approaches. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (7), 2179 (2020).
  37. Gall, J. E., Boyd, R. S., Rajakaruna, N. Transfer of heavy metals through terrestrial food webs: a review. Environmental Monitoring and Assessment. 187, 201 (2015).
  38. Mohammed, A. S., Kapri, A., Goel, R. . Heavy Metal Pollution: Source, Impact, and Remedies. Biomanagement of Metal-Contaminated Soils. , 1-28 (2011).
  39. Mitra, A., Chatterjee, S., Voronina, A. V., Walther, C., Gupta, D. K. Lead toxicity in plants: a review. Lead in Plants and the Environment. , 99-116 (2020).
  40. Perugini, M., et al. Heavy metal (Hg, Cr, Cd, and Pb) contamination in urban areas and wildlife reserves: Honeybees as bioindicators. Biological Trace Element Research. 140 (2), 170-176 (2011).
  41. Rycewicz-Borecki, M., McLean, J. E., Dupont, R. R. Bioaccumulation of copper, lead, and zinc in six macrophyte species grown in simulated stormwater bioretention systems. Journal of Environmental Management. 166, 267-275 (2016).
  42. Zulfiqar, U., et al. Lead toxicity in plants: Impacts and remediation. Journal of Environmental Management. 250, 109557 (2019).
  43. Spliethoff, H. M., et al. Estimated lead (Pb) exposures for a population of urban community gardeners. Environmental Geochemistry and Health. 38, 955-971 (2016).
  44. Li, C. C., et al. Foliar dust as a reliable environmental monitor of heavy metal pollution in comparison to plant leaves and soil in urban areas. Chemosphere. 287, 132341 (2022).
  45. Ram, S. S., et al. Plant canopies: bio-monitor and trap for re-suspended dust particulates contaminated with heavy metals. Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change. 19, 499-508 (2014).
  46. Karri, V., Schuhmacher, M., Kumar, V. Heavy metals (Pb, Cd, As and MeHg) as risk factors for cognitive dysfunction: A general review of metal mixture mechanism in brain. Environmental Toxicology and Pharmacology. 48, 203-213 (2016).
  47. Tong, S., von Schirnding, Y. E., Prapamontol, T. Environmental lead exposure: a public health problem of global dimensions. Bulletin of the World Health Organization. 78 (9), 1068-1077 (2000).
  48. Liu, J. H., Lewis, G. Environmental toxicity and poor cognitive outcomes in children and adults. Journal of Environmental Health. 76 (6), 130-138 (2014).
  49. Gintenreiter, S., Ortel, J., Nopp, H. J. Effects of different dietary levels of cadmium, lead, copper, and zinc on the vitality of the forest pest insect Lymantria-Dispar L (Lymantriidae, Lepid). Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 25, 62-66 (1993).
  50. Cheruiyot, D. J., Boyd, R. S., Moar, W. Testing the joint effects hypothesis of elemental defense using Spodoptera exigua. Journal of Chemical Ecology. 41 (2), 168-177 (2015).
  51. Coleman, C. M., Boyd, R. S., Eubanks, M. D. Extending the elemental defense hypothesis: Dietary metal concentrations below hyperaccumulator levels could harm herbivores. Journal of Chemical Ecology. 31 (8), 1669-1681 (2005).
  52. Kaushal, S. S., et al. Making ‘chemical cocktails’-Evolution of urban geochemical processes across the periodic table of elements. Applied Geochemistry. 119, 104632 (2020).
  53. Shephard, A. M., et al. Traffic patterns, more than adjacent land use, influence element content of roadside forbs for insect pollinators. Ecological Solutions and Evidence. 3 (4), 12195 (2022).
  54. Scott, J. A. . The Butterflies of North America: A Natural History and Field Guide. , (1992).
  55. Boyd, R. S. High-nickel insects and nickel hyperaccumulator plants: A review. Insect Science. 16 (1), 19-31 (2009).
  56. Boyd, R. S., Martens, S. N. Nickel hyperaccumulated by thlaspi-montanum var montanum is acutely toxic to an insect herbivore. Oikos. 70 (1), 21-25 (1994).
  57. Cempel, M., Nickel, G. A review of its sources and environmental toxicology. Polish Journal of Environmental Studies. 15 (3), 375-382 (2006).
  58. Aslam, J., Khan, S. A., Khan, S. H. Heavy metals contamination in roadside soil near different traffic signals in Dubai, United Arab Emirates. Journal of Saudi Chemical Society. 17 (3), 315-319 (2013).
  59. Mitchell, T. S., et al. Traffic influences nutritional quality of roadside plants for monarch caterpillars. Science of the Total Environment. 724, 138045 (2020).
  60. Voegborlo, R., Chirgawi, M. Heavy metals accumulation in roadside soil and vegetation along a major highway in Libya. Journal of Science and Technology. 27 (3), 86-97 (2007).
  61. Snell-Rood, E., Kobiela, M. . Data for: Rearing the Cabbage White Butterfly (Pieris rapae) in Controlled Conditions: A Case Study with Heavy Metal Tolerance. , (2023).
  62. Snell-Rood, E. C., Espeset, A., Boser, C. J., White, W. A., Smykalski, R. Anthropogenic changes in sodium affect neural and muscle development in butterflies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (28), 10221-10226 (2014).
  63. Boyd, R. S., Moar, W. J. The defensive function of Ni in plants: response of the polyphagous herbivore Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) to hyperaccumulator and accumulator species of Streptanthus (Brassicaceae). Oecologia. 118 (2), 218-224 (1999).
  64. Cheruiyot, D. J., Boyd, R. S., Moar, W. J. Exploring lower limits of plant elemental defense by cobalt, copper, nickel, and zinc. Journal of Chemical Ecology. 39 (5), 666-674 (2013).
  65. Davis, M. A., Boyd, R. S., Cane, J. H. Host-switching does not circumvent the Ni-based defence of the Ni hyperaccumulator Streptanthus polygaloides (Brassicaceae). South African Journal of Science. 97 (11-12), 554-557 (2001).
  66. Dubovskiy, I. M., Grizanova, E. V., Ershova, N. S., Rantala, M. J., Glupov, V. V. The effects of dietary nickel on the detoxification enzymes, innate immunity and resistance to the fungus Beauveria bassiana in the larvae of the greater wax moth Galleria mellonella. Chemosphere. 85 (1), 92-96 (2011).
  67. Jhee, E. M., Boyd, R. S., Eubanks, M. D. Nickel hyperaccumulation as an elemental defense of Streptanthus polygaloides (Brassicaceae): influence of herbivore feeding mode. New Phytologist. 168 (2), 331-343 (2005).
  68. Zhou, J. L., Shu, Y. H., Zhang, G. R., Zhou, Q. Lead exposure improves the tolerance of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae) to cypermethrin. Chemosphere. 88 (4), 507-513 (2012).
  69. Snell-Rood, E. C., Davidowitz, G., Papaj, D. R. Reproductive tradeoffs of learning in a butterfly. Behavioral Ecology. 22 (2), 291-302 (2011).
  70. Snell-Rood, E. C., Davidowitz, G., Papaj, D. R. Plasticity in learning causes immediate and trans-generational changes in allocation of resources. Integrative and Comparative Biology. 53 (2), 329-339 (2013).
  71. Snell-Rood, E. C., Papaj, D. R., Brain Gronenberg, W. size: A global or induced cost of learning. Brain Behavior and Evolution. 73 (2), 111-128 (2009).
  72. Snell-Rood, E. C., et al. Nutritional constraints on brain evolution: Sodium and nitrogen limit brain size. Evolution. 74 (10), 2304-2319 (2020).
  73. Jaumann, S., Snell-Rood, E. C. Adult nutritional stress decreases oviposition choosiness and fecundity in female butterflies. Behavioral Ecology. 30 (3), 852-863 (2019).
  74. Sahiti, H., Bislimi, K., Bajgora, A., Rexhepi, A., Dalo, E. Protective effect of vitamin C against oxidative stress in common carp (Cyprinus carpio) induced by heavy metals. International Journal of Agriculture and Biosciences. 7 (2), 71-75 (2018).
  75. Rothman, J. A., Leger, L., Graystock, P., Russell, K., McFrederick, Q. S. The bumble bee microbiome increases survival of bees exposed to selenate toxicity. Environmental Microbiology. 21 (9), 3417-3429 (2019).
  76. Hammer, T. J., Janzen, D. H., Hallwachs, W., Jaffe, S. P., Fierer, N. Caterpillars lack a resident gut microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (36), 9641-9646 (2017).
  77. Hammer, T. J., Sanders, J. G., Fierer, N. Not all animals need a microbiome. FEMS Microbiology Letters. 366 (10), (2019).
  78. Baker, H. G., Baker, I. . Coevolution of Animals and Plants. , 100-140 (1975).
  79. Boyd, R. S., Davis, M. A., Wall, M. A., Balkwill, K. Metal concentrations of insects associated with the South African Ni hyperaccumulator Berkheya coddii (Asteraceae). Insect Science. 13 (2), 85-102 (2006).
  80. Boyd, R. S., Wall, M. A., Jaffre, T. Nickel levels in arthropods associated with Ni hyperaccumulator plants from an ultramafic site in New Caledonia. Insect Science. 13 (4), 271-277 (2006).
  81. Kramer, U. Metal hyperaccumulation in plants. Annual Review of Plant Biology. 61, 517-534 (2010).
  82. Cardoso-Jaime, V., Broderick, N. A., Maya-Maldonado, K. Metal ions in insect reproduction: a crosstalk between reproductive physiology and immunity. Current Opinion in Insect Science. 52, 100924 (2022).
  83. Rivera-Perez, C., Clifton, M. E., Noriega, F. G. How micronutrients influence the physiology of mosquitoes. Current Opinion in Insect Science. 23, 112-117 (2017).
  84. Lee, J. H. Micronutrient deficiency syndrome: zinc, copper and selenium. Pediatric Gastroenterology, Hepatology & Nutrition. 15 (3), 145-150 (2012).
  85. Nube, M., Voortman, R. L. Human micronutrient deficiencies: linkages with micronutrient deficiencies in soils, crops and animal nutrition. Combating Micronutrient Deficiencies: Food-Based Approaches. , 289-311 (2011).
  86. Wysocka, D., Snarska, A., Sobiech, P. Copper-An essential micronutrient for calves and adult cattle. Journal of Elementology. 24 (1), 101-110 (2019).
  87. Oliveira, C. S., et al. Toxic metals that interact with thiol groups and alteration in insect behavior. Current Opinion in Insect Science. 52, 100923 (2022).
  88. Mogren, C. L., Trumble, J. T. The impacts of metals and metalloids on insect behavior. Entomologia Experimentalis et Applicata. 135 (1), 1-17 (2010).
  89. Hladun, K. R., Di, N., Liu, T. X., Trumble, J. T. Metal contaminant accumulation in the hive: Consequences for whole-colony health and brood production in the honey bee (Apis mellifera L.). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (2), 322-329 (2016).
  90. Elbassiouny, S. A. Changes in food-related behavioral-patterns of some phytophagous insect species following exposures to an antifeedant. Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica. 26 (3-4), 483-496 (1991).
  91. Hladun, K. R., Parker, D. R., Trumble, J. T. Cadmium, copper, and lead accumulation and bioconcentration in the vegetative and reproductive organs of Raphanus sativus: Implications for plant performance and pollination. Journal of Chemical Ecology. 41, 386-395 (2015).
  92. Nation, J., Robinson, F. Concentration of some major and trace elements in honeybees, royal jelly and pollens, determined by atomic absorption spectrophotometry. Journal of Apicultural Research. 10 (1), 35-43 (1971).
  93. Herbert Jr, E. W., Shimanuki, H. Mineral requirements for brood-rearing by honeybees fed a synthetic diet. Journal of Apicultural Research. 17 (3), 118-122 (1978).
  94. Beck, S. D., Chippendale, G., Swinton, D. Nutrition of the European corn borer, Ostrinia nubilalis. VI. A larval rearing medium without crude plant fractions. Annals of the Entomological Society of America. 61 (2), 459-462 (1968).
  95. Junnikkala, E. Rearing Pieris-Brassicae (L.) on a phospholipid and vitamin-supplemented semi-artificial diet. Annales Zoologici Fennici. 17 (1), 39-42 (1980).
  96. Hixson, S. M., et al. Long-chain omega-3 polyunsaturated fatty acids have developmental effects on the crop pest, the Cabbage White Butterfly Pieris rapae. PLoS One. 11 (3), e0152264 (2016).
  97. Turunen, S. Lipid utilization in adult Pieris brassicae with special reference to the role of linolenic acid. Journal of Insect Physiology. 20 (7), 1257-1269 (1974).
  98. Vanderzant, E. S. Development, significance, and application of artificial diets for insects. Annual Review of Entomology. 19, 139-160 (1974).
  99. Cohen, A. C. . Insect Diets: Science and Technology. , (2003).
  100. Balluffi-Fry, J., Leroux, S. J., Champagne, E., Vander Wal, E. In defense of elemental currencies: can ecological stoichiometry stand as a framework for terrestrial herbivore nutritional ecology. Oecologia. 199 (1), 27-38 (2022).
  101. Coogan, S. C. P., Raubenheimer, D., Zantis, S. P., Machovsky-Capuska, G. E. Multidimensional nutritional ecology and urban birds. Ecosphere. 9 (4), 02177 (2018).
  102. Raubenheimer, D., Simpson, S. J., Mayntz, D. Nutrition, ecology and nutritional ecology: toward an integrated framework. Functional Ecology. 23 (1), 4-16 (2009).
  103. Arien, Y., Dag, A., Zarchin, S., Masci, T., Shafir, S. Omega-3 deficiency impairs honey bee learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (51), 15761-15766 (2015).
  104. Man, K. Y., et al. Use of biochar as feed supplements for animal farming. Critical Reviews in Environmental Science and Technology. 51 (2), 187-217 (2021).
  105. Shephard, A. M., Knudsen, K., Snell-Rood, E. C. Anthropogenic sodium influences butterfly responses to nitrogen-enriched resources: implications for the nitrogen limitation hypothesis. Oecologia. 201 (4), 941-952 (2023).

Tags

Cabbage White ButterflyPieris RapaeHeavy Metal ToleranceControlled RearingUrban EnvironmentsAnthropogenic PollutionArtificial DietDevelopmental AdjustmentsEcological InterventionsPest Control ResearchBehavioral EcologyNutritional EcologyModel Organism

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Snell-Rood, E. C., Kobiela, M. E. Rearing the Cabbage White Butterfly (Pieris rapae) in Controlled Conditions: A Case Study with Heavy Metal Tolerance. J. Vis. Exp. (198), e65383, doi:10.3791/65383 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image