Kulometrik Mikrorespirometri Kullanılarak Drosophila melanogaster'de _O2 Tüketiminin Ölçülmesi

Metabolik hızı ölçme yeteneği, bir organizmanın çevresel bağlamında tam olarak anlaşılması için çok önemlidir. Örneğin, yaşam süresi^1’deki rolünü, diyetin metabolizmadaki^{rolünü 2} veya hipoksik stres eşiğini³ anlamak için metabolik hızı ölçmek gerekir.

Metabolizma hızını ölçmek için iki genel yaklaşım vardır⁴. Doğrudan kalorimetri, ısı üretimini ölçerek doğrudan enerji harcamasını ölçer. Dolaylı kalorimetri, enerji üretimini başka yollarla, genellikle O 2 tüketiminin (V_O2), CO₂ üretiminin veya her ikisinin respirometrik ölçümü yoluyla ölçer. Drosophila melanogaster⁵ dahil olmak üzere küçük ektotermlere doğrudan kalorimetri uygulanmış olsa da, respirometri teknik olarak daha basittir ve daha yaygın olarak kullanılır.

Yabani tip ve mutant D. melanogaster’de metabolik hızı ölçmek için çeşitli respirometri formları başarıyla kullanılmış ve sıcaklık⁶, sosyal çevre 3, diyet ^{3,7 ve} nörogelişimsel bozuklukların⁸ metabolik etkileri hakkında fikir vermiştir. Bunlar, maliyet ve karmaşıklık açısından önemli ölçüde farklılık gösteren iki sınıfa ayrılır. Manometri, sineklerin bir CO₂ emici içeren ve ince bir kılcal damar yoluyla bir sıvı rezervuarına bağlanan kapalı bir odaya yerleştirildiği en basit ve en ucuz ^9,10’dur. O 2 tüketildikçe ve CO₂ emildikçe, odadaki basınç azalır ve sıvı kılcal damara çekilir. Kılcal damarın sıvı dolu hacmi bu nedenle V_O2 ile orantılıdır. Kılcal damardaki sıvının uyguladığı kuvveti telafi eden daha ayrıntılı versiyonlar da D. melanogaster 1’de kullanılmıştır. Manometri, basit ve ucuz olma avantajlarına sahiptir, ancak basınca duyarlı olduğu için sabit çevre koşulları gerektirir. Ayrıca, tüketilen O2 yerine konmadığı için, O2’nin (P_O2) kısmi basıncı odaların içinde kademeli olarak azalır.

Gaz analizi kullanan respirometri de D. melanogaster için düzenli olarak kullanılmaktadır. Bu durumda, gazlar sinek içeren kapalı odalardan düzenli aralıklarla örneklenir ve bir kızılötesi analizöre^{gönderilir 2,6,11}. Bu tip aparatlar, ticari olarak temin edilebilmesi, çevresel koşullara daha az duyarlı olması ve numune alma sırasında gazların yenilenmesi ve böylece P_O2’nin stabil kalması gibi avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, ekipmanın çalıştırılması pahalı ve karmaşık olabilir.

Yakın zamanda geliştirilen bir kulometrik mikrorespirometre¹², mevcut sistemlere ucuz, hassas ve istikrarlı bir alternatif sunar. Uygulamada, bir organizma_O2 tükettiği hava geçirmez bir odaya yerleştirilir ve solunan CO₂ emici bir malzeme tarafından uzaklaştırılır, bu da oda basıncında net bir azalmaya neden olur. İç basınç önceden ayarlanmış bir eşiğe (AÇIK eşik) düştüğünde, akım bir elektrolitik_O2 jeneratöründen geçirilir ve basıncı elektrolizi durduran ikinci bir eşiğe (OFF-eşik) döndürür. O₂ jeneratörü boyunca yük transferi, odayı yeniden basınçlandırmak için gereken O2 miktarı ile doğru orantılıdır ve bu nedenle organizma⁴ tarafından tüketilen_O2’yi ölçmek için kullanılabilir. Yöntem oldukça hassastır, V O2’yi hassas bir şekilde ölçer ve O2’nin düzenli olarak değiştirilmesi, P_O2’yi saatler veya günler boyunca neredeyse sabit bir seviyede tutabilir.

Bu çalışmada kullanılan kulometrik mikrorespirometre, çok modlu (basınç, sıcaklık ve nem) bir elektronik sensör kullanır. Sensör, basınçtaki küçük değişiklikleri algılayan ve düşük basınç eşiğine¹² ulaşıldığında_O2 üretimini etkinleştiren bir mikrodenetleyici tarafından çalıştırılır. Bu aparat raf parçalarından monte edilir, çok çeşitli odalar ve deney ortamları ile kullanılabilir ve vücut kütlesi ve sıcaklığının Tenebrio molitor böceği üzerindeki etkilerini incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu çalışmada, mikrorespirometre, T. molitor kütlesinin yaklaşık% 1’ine sahip olan D. melanogaster’de _O2 tüketimini ölçmek için uyarlanmıştır. O2 üretimini aktive etme eşiği düşürülerek aparatın hassasiyeti arttırılmıştır ve sıcaklık kontrollü bir su banyosunda deneyler yapılarak ve odaların içindeki nem% 100 veya buna yakın tutularak çevresel stabilite arttırılmıştır.

Membranla ilişkili guanilat kinazlar (MAGUK) ailesinin bir parçası olan CASK (Calmodulin’e bağımlı Serin Protein Kinaz) proteini, farklı çoklu protein komplekslerinde moleküler bir iskeledir ve CASK’deki mutasyonlar, insanlarda ve D. melanogaster’de nörogelişimsel bozukluklarla ilişkilidir ^13,14. Canlı bir D. melanogaster mutantı, CASK^Δ18, dopaminerjik nöronların 15 aktivitesini bozar ve konjenik kontrollere kıyasla aktivite seviyelerini %50’den fazla azaltır^14,16. CASK mutantlarının azalmış aktivite seviyeleri ve katekolaminlerin metabolizmayı düzenlemedeki rolü¹⁷ nedeniyle, standart metabolik hızlarının ve dolayısıyla_O2 tüketiminin kontrollere kıyasla önemli ölçüde azalacağını varsaydık.

_O2 tüketimi CASK^Δ18 ve bunların vahşi tip türdeşleri w(ex33) cinsinden ölçülmüştür. Sinek grupları respirometri odalarına yerleştirildi, O 2 tüketimi ölçüldü, O₂ tüketimi hesaplandı ve hem kütleye özgü hem de sinek başına ifade edildi. Cihaz, önceki çalışmalarla tutarlı olan vahşi tip sineklerde V O2 kaydetti ve vahşi tip ve CASK mutant sineklerinin sinek başına_O2 tüketimini ayırt edebildi.