Messung des_{O2-Verbrauchs} in Drosophila melanogaster mittels coulometrischer Mikrorespirometrie

Die Fähigkeit, die Stoffwechselrate zu messen, ist entscheidend für ein vollständiges Verständnis eines Organismus in seinem Umweltkontext. Zum Beispiel ist es notwendig, die Stoffwechselrate zu messen, um ihre Rolle in der Lebensspanne¹, die Rolle der Ernährung im Stoffwechsel² oder die Schwelle für hypoxischen Stress³ zu verstehen.

Es gibt zwei allgemeine Ansätze zur Messung der Stoffwechselrate⁴. Die direkte Kalorimetrie misst den Energieverbrauch direkt durch die Messung der Wärmeproduktion. Die indirekte Kalorimetrie misst die Energieerzeugung auf andere Weise, oft durch respirometrische Messung des O2-Verbrauchs (V_O2), der CO_{2 –}Produktion oder beidem. Obwohl die direkte Kalorimetrie bei kleinen Ektothermen, einschließlich Drosophila melanogaster⁵, angewendet wurde, ist die Respirometrie technisch einfacher und wird häufiger verwendet.

Verschiedene Formen der Respirometrie wurden erfolgreich zur Messung der Stoffwechselrate bei Wildtyp- und mutierten D. melanogaster eingesetzt und haben Einblicke in die metabolischen Auswirkungen von Temperatur⁶, sozialem Umfeld 3, Ernährung^{3, 7 und} neurologischen Entwicklungsstörungen⁸ gegeben. Diese lassen sich in zwei Klassen einteilen, die sich in Kosten und Komplexität erheblich unterscheiden. Die Manometrie ist die einfachste und kostengünstigste ^9,10, bei der die Fliegen in eine geschlossene Kammer gesetzt werden, die ein_{CO2-Absorptionsmittel} enthält und über eine dünne Kapillare mit einem Flüssigkeitsreservoir verbunden ist. Wenn_O2 verbraucht und_CO2 absorbiert wird, sinkt der Druck in der Kammer und Flüssigkeit wird in die Kapillare gesaugt. Das flüssigkeitsgefüllte Volumen der Kapillare ist also proportional zu V_O2. Aufwendigere Versionen, die die Kraft der Flüssigkeit in der Kapillare kompensieren, wurden auch bei D. melanogaster¹ eingesetzt. Die Manometrie hat den Vorteil, dass sie einfach und kostengünstig ist, aber da sie druckempfindlich ist, erfordert sie konstante Umgebungsbedingungen. Da das verbrauchte O2 nicht ersetzt wird, nimmt der Partialdruck von O2 (_PO2) in den Kammern allmählich ab.

Auch die Respirometrie mittels Gasanalyse wird regelmäßig bei D. melanogaster eingesetzt. In diesem Fall werden Gase in regelmäßigen Abständen aus versiegelten Kammern, die Fliegen enthalten, entnommen und an einen Infrarot-Analysator ^2,6,11 geschickt. Diese Art von Apparatur hat den Vorteil, dass sie im Handel erhältlich ist, weniger empfindlich auf Umweltbedingungen reagiert und Gase während der Probenahme aufgefrischt werden, so dass P_O2 stabil bleibt. Die Geräte können jedoch teuer und komplex im Betrieb sein.

Ein kürzlich entwickeltes coulometrisches Mikrorespirometer¹² bietet eine kostengünstige, empfindliche und stabile Alternative zu bestehenden Systemen. In der Praxis wird ein Organismus in eine luftdichte Kammer gebracht, wo er O2 verbraucht und das ausgeatmete_CO2 durch ein absorbierendes Material entfernt wird, was zu einer Nettoabnahme des Kammerdrucks führt. Wenn der Innendruck auf einen voreingestellten Schwellenwert (ON-Schwelle) sinkt, wird Strom durch einen elektrolytischen_O2-Generator geleitet, der den Druck auf einen zweiten Schwellenwert (OFF-Schwelle) zurückführt und die Elektrolyse stoppt. Die Ladungsübertragung über den O2-Generator ist direkt proportional zu der Menge an O2, die erforderlich ist, um die Kammer wieder unter Druck zu setzen, und kann daher verwendet werden, um das vom Organismus⁴ verbrauchte_O2 zu messen. Die Methode ist hochempfindlich, misst V O2 präzise, und der regelmäßige Austausch von O2 kann P_O2 über Stunden oder Tage auf einem nahezu konstanten Niveau halten.

Das coulometrische Mikrorespirometer, das in dieser Studie verwendet wird, verwendet einen multimodalen (Druck, Temperatur und Feuchtigkeit) elektronischen Sensor. Der Sensor wird von einem Mikrocontroller betrieben, der kleine Druckänderungen erkennt und bei Erreichen einer niedrigen Druckschwelle^{12 die O2-Generation} aktiviert. Diese Apparatur wird aus handelsüblichen Teilen zusammengebaut, kann mit einer Vielzahl von Kammern und Versuchsumgebungen verwendet werden und wurde erfolgreich eingesetzt, um die Auswirkungen von Körpermasse und Temperatur auf den Käfer Tenebrio molitor zu untersuchen. In der vorliegenden Studie wurde das Mikrorespirometer angepasst, um den_O2-Verbrauch in D. melanogaster zu messen, der etwa 1% der Masse von T. molitor aufweist. Die Empfindlichkeit der Apparatur wurde erhöht, indem die Schwelle für die Aktivierung der_O2-Erzeugung gesenkt wurde, und die Umgebungsstabilität wurde durch die Durchführung von Experimenten in einem temperaturgesteuerten Wasserbad und durch die Aufrechterhaltung der Luftfeuchtigkeit in den Kammern bei oder nahe 100 % erhöht.

Das CASK-Protein (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), das zur Familie der membranassoziierten Guanylatkinasen (MAGUK) gehört, ist ein molekulares Gerüst in verschiedenen Multiproteinkomplexen, und Mutationen in CASK sind mit neurologischen Entwicklungsstörungen beim Menschen und bei D. melanogaster assoziiert ^13,14. Eine lebensfähige D. melanogaster-Mutante, CASK^Δ18, stört die Aktivität dopaminerger Neuronen 15 und reduziert das Aktivitätsniveau um mehr als 50 % im Vergleich zu kongenen Kontrollen^14,16. Aufgrund der reduzierten Aktivität von CASK-Mutanten und der Rolle von Katecholaminen bei der Regulierung des Stoffwechsels¹⁷ stellten wir die Hypothese auf, dass ihre Standardstoffwechselrate und damit der_O2-Verbrauch im Vergleich zu Kontrollen dramatisch reduziert wäre.

Der O2-Verbrauch wurde in CASK^Δ18 und ihren_{Wildtyp-Artgenossen} w(ex33) gemessen. Gruppen von Fliegen wurden in Respirometriekammern gesetzt, der O2-Verbrauch wurde gemessen, der_O2-Verbrauch wurde berechnet und sowohl massenspezifisch als auch pro Fliege ausgedrückt. Die Apparatur zeichnete V O2 in Wildtyp-Fliegen auf, was mit früheren Studien übereinstimmte, und sie konnte zwischen dem_O2-Verbrauch pro Fliege von Wildtyp- und CASK-mutierten Fliegen unterscheiden.