Mesure de la consommation d’O₂ chez Drosophila melanogaster à l’aide de la microrespirométrie coulométrique

La capacité de mesurer le taux métabolique est cruciale pour une compréhension complète d’un organisme dans son contexte environnemental. Par exemple, il est nécessaire de mesurer le taux métabolique afin de comprendre son rôle dans la durée de vie¹, le rôle de l’alimentation dans le métabolisme², ou encore le seuil du stress hypoxique³.

Il existe deux approches générales pour mesurer le taux métabolique⁴. La calorimétrie directe mesure directement la dépense énergétique en mesurant la production de chaleur. La calorimétrie indirecte mesure la production d’énergie par d’autres moyens, souvent par mesure respirométrique de la consommation d’O2 (V,_O2), de_CO2 ou des deux. Bien que la calorimétrie directe ait été appliquée à de petits ectothermes, y compris Drosophila melanogaster⁵, la respirométrie est techniquement plus simple et plus couramment utilisée.

Plusieurs formes de respirométrie ont été utilisées avec succès pour mesurer le taux métabolique chez D. melanogaster de type sauvage et mutant et ont fourni un aperçu des effets métaboliques de la température⁶, de l’environnement social 3, de l’alimentation ^{3,7 et des} troubles neurodéveloppementaux⁸. Ceux-ci se répartissent en deux classes, dont le coût et la complexité varient considérablement. La manométrie est la plus simple et la moins coûteuse^9,10, dans laquelle les mouches sont placées dans une chambre scellée qui contient un absorbant de CO₂ et qui est reliée par un mince capillaire à un réservoir de fluide. Au fur et à mesure que l’O 2 est consommé et que le CO₂ est absorbé, la pression dans la chambre diminue et le fluide est aspiré dans le capillaire. Le volume rempli de liquide du capillaire est donc proportionnel à V_O2. Des versions plus élaborées, qui compensent la force exercée par le fluide dans le capillaire, ont également été utilisées sur D. melanogaster¹. La manométrie a l’avantage d’être simple et peu coûteuse, mais, parce qu’elle est sensible à la pression, elle nécessite des conditions environnementales constantes. De plus, comme l’O 2 consommé n’est pas remplacé, la pression partielle d’O₂ (P_O2) diminue progressivement à l’intérieur des chambres.

La respirométrie utilisant l’analyse des gaz est également régulièrement utilisée pour D. melanogaster. Dans ce cas, les gaz sont échantillonnés à intervalles réguliers dans des chambres scellées contenant des mouches et envoyés à un analyseur infrarouge ^2,6,11. Ce type d’appareil présente l’avantage d’être disponible dans le commerce, d’être moins sensible aux conditions environnementales et de rafraîchir les gaz pendant l’échantillonnage afin que le P_O2 reste stable. Cependant, l’équipement peut être coûteux et complexe à utiliser.

Un microrespiromètre coulométrique récemment mis au point¹² offre une alternative peu coûteuse, sensible et stable aux systèmes existants. En pratique, un organisme est placé dans une chambre hermétique où il consomme de l’O 2 et le CO₂ expiré est éliminé par un matériau absorbant, ce qui entraîne une diminution nette de la pression de la chambre. Lorsque la pression interne diminue jusqu’à un seuil prédéfini (seuil ON), le courant passe à travers un générateur électrolytique d’O2, ramenant la pression à un deuxième seuil (seuil OFF) arrêtant l’électrolyse. Le transfert de charge à travers le générateur d’O2 est directement proportionnel à la quantité d’O2 nécessaire pour repressuriser la chambre et peut donc être utilisé pour mesurer l’O2 consommé par l’organisme⁴. La méthode est très sensible, mesure la V O2 avec précision, et le remplacement régulier de l’O₂ peut maintenir la P_O2 à un niveau presque constant pendant des heures ou des jours.

Le microrespiromètre coulométrique utilisé dans cette étude utilise un capteur électronique multimodal (pression, température et humidité). Le capteur est actionné par un microcontrôleur qui détecte les petits changements de pression et active la génération d’O₂ lorsqu’un seuil de basse pression est atteint¹². Cet appareil est assemblé à partir de pièces prêtes à l’emploi, peut être utilisé avec une grande variété de chambres et d’environnements expérimentaux, et a été utilisé avec succès pour examiner les effets de la masse corporelle et de la température sur le coléoptère Tenebrio molitor. Dans la présente étude, le microrespiromètre a été adapté pour mesurer la consommation d’O₂ chez D. melanogaster, qui représente environ 1 % de la masse de T. molitor. La sensibilité de l’appareil a été augmentée en abaissant le seuil d’activation de la génération d’O2, et la stabilité de l’environnement a été améliorée en effectuant des expériences dans un bain-marie à température contrôlée et en maintenant l’humidité à l’intérieur des chambres à 100 % ou presque.

La protéine CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), qui fait partie de la famille des guanylate kinases associées à la membrane (MAGUK), est un échafaudage moléculaire dans différents complexes multiprotéiques, et les mutations de CASK sont associées à des troubles neurodéveloppementaux chez l’homme et chez D. melanogaster^13,14. Un mutant viable de D. melanogaster, CASK^Δ18, perturbe l’activité des neurones dopaminergiques 15 et réduit les niveaux d’activité de plus de 50 % par rapport aux témoins congéniques^14,16. En raison des niveaux d’activité réduits des mutants CASK et du rôle des catécholamines dans la régulation du métabolisme^{, nous avons} émis l’hypothèse que leur taux métabolique standard, et donc leur consommation d’O₂, seraient considérablement réduits par rapport aux témoins.

La consommation_d’O2 a été mesurée dans le fût^Δ18 et leurs congénères de type sauvage, w(ex33). Des groupes de mouches ont été placés dans des chambres de respirométrie, la consommation d’O2 a été mesurée, la consommation d’O2 a été calculée et exprimée à la fois en fonction de la masse et par mouche. L’appareil a enregistré la V O2 chez les mouches de type sauvage, ce qui était cohérent avec les études précédentes, et il a pu faire la différence entre la consommation_d’O2 par mouche des mouches mutantes de type sauvage et CASK mutantes.